灵芝多糖肽对Alzheimer样大鼠海马氧化应激的干预作用

灵芝多糖肽对Alzheimer样大鼠海马氧化应激的干预作用 灵芝多糖肽对Alzheimer样大鼠海马氧化应 激的干预作用 Vo1.19No.4Aug.2007 河南职工医学院 JournalofHenanMedicalCollegeforStaffandWorkers?297? 基础医学 灵芝多糖肽对Alzheimer样大鼠海马氧化 应激的干预作用 王黎,田青,王群,王建枝 (1.华中科技大学同济医学院病理生理学系湖北武汉43003 2.河南职工医学院病理生理学教研室河南郑州450003) [摘要]目的观察GLPP对Alzheimer样大鼠海马SOD,GSH—Px和MDA含量以及空间学习记忆能力的影响. 雄性Wistar大鼠120只,随机分为8组,每组15只:正常对照组,模型组,NS组,GLPP组(按不同剂量50 mg/kg,250ing/kg和1.25g/kg分为GLPP,GLPP2和GLPP3组),Mel组和DMSO组;除正常对照组(正常昼夜节 律)外,其余各组连续光照(光照度400Lux,24h)30d,其间GLPP组各组按不同剂量igGLPP,每天1次;NS组ig相 同体积的生理盐水,每天1次;Mel组ipMel(1.0ing/kg),每天1次;DMSO组ip相同体积的DMSO,每天1次.光照 30d后Morris水迷宫法测试各组大鼠空间记忆能力,分光光度法测定大鼠海马组织SOD,GSH—Px活性和MDA含 量.结果模型组大鼠寻台潜伏期明显延长,与正常对照组比较有显着性差异(P<0.05);GLPP:组,GLPP,组和 Mel组寻台潜伏期明显缩短,与模型组比较有显着差异(P<0.05);GLPP.组,Ns组和DMSO组寻台潜伏期明显延 长.与模型组比较无显着差异(P>0.05).模型组大鼠海马组织SOD,GSH—Px活 性降低,MDA含量增高,与正常 对照组比较有显着差异(P<0.05);GLPP组,GLLP组和Mel组大鼠海马组织 SOD,GSH—Px活性增高,MDA含 量降低,与模型组比较有显着差异(P<0.05);GLLP.组,Ns组和DMSO组大鼠海马 SOD,GSH—Px活性降低,MDA 含量升高,与模型组比较无显着差异(P>0.05).结论中剂量和高剂量GLPP能够 通过提高海马抗氧化酶SOD, GSH—Px活性,降低MDA含量,减轻持续光照引起的AD大鼠海马氧化应激损伤; 低剂量GLPP无上述作用. [关键词]GLPP;氧化应激;海马;Morris水迷宫 [中图分类号]R697.31[文献标识码]B[文章编号]1008—9276(2007)04—0297—04 TheInterventionEffectofGLPPonoxidativestressofHippocampus ofonAlzheimer——likeRat WANGLi一,TianQing,WANGQun,WANGJian—zhi (1.Departmentofphysology,TongfiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,WhhanHuBei430030; 2.HenanMedicalCollegeforStaffandWorkers,ZhengzhonHenan450003,China) [Abstract]ObjectiveToobservetheeffectofGanodermalucidumpolysaccharidespeptide(GLPP) onactivityofSOD,GSH— PXandcontentofMDAinhippocampus,andspatialmemoryofAlzheimer— likerats.Methods120maleWistarratsweredividedrandomlyintoeightgroups(15pergroup):nor— malcontrols,modelgroup,NSgroup,GLPPgroup(subdividedintothreesubgroupsthatreceived50mg/ kg(GLPP1),250mg/kg(GLPP2)and1.25g/kg(GLPP3)differentdoses),melatonin(Me1)group andDMSO(dimethylsulfoxide)group.Exceptfornormalcontrols(received12:12hrlight— darkcy— cle),allothergroupswerereceivedcontinuousillumination(400luxilluminance,24h)for30days. Duringtheilluminateperiod,GLPPgroupwasreceivedGLPP(ig,onetimeperday);NSgroupwasre— ceivednormalsalineofthesamevolumeastheGLPPgroup(ig,onetimeperday);Melgroupwasre一 收稿日期:2007—03—13 作者简介:王黎(1962一),男,河南省郑州市人,博士,教授,从事老年痴呆的病理生理 学研究. 通讯作者:王建枝,教授,博士生导帅.I'cl:027—83693883 ? 298?河南职工医学院第19卷 ceivedmelatonin(ip,1.0mg/kg,onetimeperday);DMSOgroupwasreceivedDMSOofthesamevol- oneastheMelgroup(ip,onetimeperday).Afteranilluminateperiodof30days,Morriswatermaze testwasusedtomeasurethespatialmemoryofrats,Spectrophotometricmethodwasemployedtotestac- tivityofSOD,GSH— PxandcontentofMDAinhippocampus.ResultsComparedtothenormalgroup, modelgrouphasprolongedescapelatency(P<0.05).Comparedtothemodelgroup,theescapelatency ofGLPP2group,GLPP3groupandMelgroupwasshorten,therewassignificantdifferencewhencon- paredtothemodelgroup(P<0.05)TheescapelatencyofGLPP1group,NSgroupandDMSOgroup wasprolonged.buttherewasnosignificantdifferencewhencomparedtothemodelgroup(P>0.05). Comparedtothenormalgroup,activityofSODandGSH— Pxdecreased(P<0.05)andMDAcontentin themodelgroupwasincreased(P<0.05)inrathippocampus.Comparedtothemodelgroup ,GLPP2 group,GLPP3groupandMelgroupdemonstrateincreaseofactivityofSOD,GSH— Px(P<0.05),and decreaseofMDAcontentinrathippocampus(P<0.05).InNS,GLPP1andDMSOgroups,a ctivityof SOD,GSH— PxweredecreasedandMDAcontentwereincreased,buttherewasnosignificantdifference whencomparedtomodelgroups(P>0.05).ConclusionMiddleandhighdoseofGLPPcan up—regu- latetheactivityofSOD,GSH—Pxinhippocampus,down— regulatethecontentofMDAinhippocam- pus,andthenreducesinjuryofoxidativestressinducedbycontinuousilluminationinAD— likerat. However,lowdoseofGLPPhasnosucheffect. [Keywords]GLPP;oxidativestress;hippocampus,Morriswatermaze 阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是老 年痴呆病中最常见的一种进行性神经退行疾病,其 确切的发病机制至今还不完全清楚.其中氧化 应激在阿尔茨海默病发病过程中起重要作用., 灵芝多糖肽(GanodermaLucidumPolysacchraride Peptide,GLPP)有广泛的药理活性,包括提高机体免 疫力.抑制肿瘤,提高机体耐缺氧的能力,抗辐射,清 除自由基等.本实验通过复制大鼠AD模型, 观察了GLPP对Alzheimer样大鼠海马超氧化物歧 化酶(Superoxidedismutase,SOD),谷胱甘肽氧化物 酶(Glutathioneperoxidase,GSH—Px)活性和丙二醛 (Malondialdehyde,MDA)含量以及空间学习记忆能 力的影响,为AD的防治提供有用的实验资料. 1材料与方法 1.1实验动物及分组雄性Wistar大鼠120只,清 洁级.体重180,220g,由华中科技大学同济医学院 实验动物中心提供.Morris水迷宫法筛选后.大鼠 随机分为8组:正常对照组(15只),模型组(15 只),NS组(15只),GLPP组(按不同剂量分50mg/ kg,250mg/kg和1.25g/kg为3组,每组15只)和 Mel组即褪黑素组(15只);NS组,GLPP组分别ig 生理盐水和GLPP.每天1次;褪黑素组按1.0mg/ kgip褪黑素;DMSO组ip相同体积的DMSO;上述各 组连续光照24h共30d(正常对照组为正常昼夜节 律),期间给予大鼠自由摄食与饮水. 1.2主要药品与试剂灵芝多糖肽,购自南通四海 植物精华有限公司溶于加热的生理盐水,分别配制 成0.5%,2.5%,12.5%的溶液,无菌过滤备用.褪 黑素系Sigma公司产品.褪黑素配制和给药:将褪 黑素用100%二甲基亚砜(Dimethylsulphoxide,DM- SO)溶解加生理盐水稀释成3%DMSO溶液,既每ml 液体含0.1mg褪黑素,每天6:00pm注射.MDA, SOD,GSH—PX检测试剂盒购自南京建成生物 研究所;其它试剂均为国产分析纯. 1.3主要仪器和设备722分光光度计(上海);组 织匀浆器(江苏);超速离心机(上海). 1.4Morris水迷宫行为学测试采用Morris水迷 宫系统来测试大鼠的空间记忆能力.Morris水迷宫 实验系统由水迷宫装置,水迷宫图象自动采集和处 理分析系统组成.测试用圆形水池直径120cm,高 60cm:圆柱形有机玻璃平台直径10cm,高40cm. 大鼠在学习前2h移入水迷宫室,并将头颈部涂黑, 涂染面积不小于3×3cm,以与背景形成反差.水 池中水面高约45cm,室温及水温均保持在26? 2?,水以奶粉搅浑;平台用双层白色纱布覆盖扎紧 后任意放置于某一象限的中心位置,并没于水面下 约2cm.整个背景均为乳白色.以避免老鼠用视觉 搜寻平台.学习时先将摄相装置与计算机,监视器 连接好,先打开电脑,再打开显示屏,保证整个系统 的正常运行. 水迷宫池分为四个象限(通常以与平台所在象 第4期王黎,等灵芝多糖肽对Alhim样大鼠海马氧化应激的干预作用'299? 限相对的象限为第一象限,实验中取第一象限的潜 伏期为记录成绩),训练时大鼠从任何一象限人水, 面向池壁轻放于水中,其游泳图象经水面上方1.5 米处的摄象机拍摄并连接于路径追踪系统采集,记 录动物的人水时间,记录潜伏期(即老鼠从人水到 找到平台后四肢爬上平台时所需的时间);同时记 录动物人水后的游泳轨迹,将此作为分析动物搜索 目标时所采用何种策略的依据.每只大鼠每天在4 个象限共学习4次,每次游泳时限为60s,即在60s 内未找到平台者系统自动停止记录,潜伏期记为 60s,大鼠由测试者引导上台,并在平台上站立lOs. 将大鼠从平台上拿下来,休息30760s后再进行下 一 次训练.在一般情况下,正常大鼠在经过5,7个 实验日训练后很快就学会以最快最佳的轨迹搜索到 平台的确切位置.本实验所采取的策略是第31d 采用Morris水迷宫训练7d,以第7d的潜伏期成绩 来反映大鼠的空间记忆能力. 1.5样品的制备大鼠6%水合氯醛麻醉后,迅速 断头,于冰盘上迅速取海马,称重,按重量:体积= 1:9的比例加人预冷的生理盐水,用组织匀浆器充 分匀浆,将匀浆液以1500g离心10—15rain,取上 清液,用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量,一80?冻 存备用. 1.6海马组织SOD活性,GSH—Px活性和MDA含 量测定取冻存的上清液,4?融化,严格按试剂盒 说明书检测SOD,GSH—Px活性和MDA含量. 1.7统计学处理数据采用单因素方差分析,应用 SPSS10.0软件进行统计分析,组间比较采用t检 验,a=0.05作为差异有显着性的检验标准. 2结果 2.1GLPP对大鼠空间学习记忆能力的影响见图1. , T ..卤..幽.:.ControlModelGLPP1GLPP2GLPP3MelNSDMSO 图1GLPP对大鼠寻台潜伏期的影响 注:与Control组(n=14)比较,Model组(n=12)大鼠寻台潜伏期明 显延长,#P<0.05;GLPP2组(n=13),GLPP3组(n=12),Mel组(n =14)大鼠寻台潜伏期缩短,与Model组比较有显着性差异,}P< 0.05;GLPP1组,NS组,DMSO组潜伏期延长,与Model组比较无显 着性差异,P>0.05;数据用x?SD示. 2.2GLPP对海马组织SOD活性和MDA含量的影 响与正常对照组比较,模型组大鼠海马组织SOD 活性和GSH—Px活性均降低,MDA含量增高(P< 0.05);GLPP高剂量组,中剂量组和褪黑素组大鼠 海马组织SOD活性和GSH—Px活性均增高,与模 型组比较有显着性差异(P<0.05);GLPP高剂量 组,中剂量组和褪黑素组大鼠海马组织MDA含量 均明显降低,与模型组比较有显着性差异(P< 0.05);表明GLPP可通过提高SOD活性增强大鼠 海马组织清除自由基的能力,减少MDA含量抑制 脂质过氧化水平,减轻神经元的损伤.而GLPP低 剂量组,生理盐水组和DMS0组大鼠海马组织SOD 活性明显降低,与模型组比较无显着性差异(P> 0.05);GLPP低剂量组,生理盐水组和DMSO组大 鼠海马组织MDA含量明显升高,与模型组比较无 显着性差异(P>0.05).见图2,图3. 2.3GLPP对海马组织GSH—Px活性的影响 GLPP高剂量组,中剂量组和褪黑素组大鼠海马组 织GSH—Px活性均增高,与模型组比较有显着性差 异(P<0.05);GLPP低剂量组,生理盐水组和DM— SO组大鼠海马组织均GSH—Px活性明显降低,与 模型组比较无显着性差异(P>0.05);表明GLPP 可通过提高SOD活性增强大鼠海马组织清除自由 基的能力,减少MDA含量抑制脂质过氧化水平,减 轻神经元的损伤见图4. ControlModelGLPPlGLPP2GLPP3MelNSDMSO 图2GLPP对大鼠海马SOD活性的影响 注:与Control组比较,#P<0.05;与I~lodel组比较P<0.05;数据用 ?SD表示,n=6. ControlModelGLPP1GLPP2GLPP3MelNSDMSO 图3GLPP对大鼠海马MDA含量的影响 注:与Control组比较,#P<0.05;与Model组比较}P<0.05;数据用 x?SD表示.n=6. ??加???加0 (10】?E,一l^.? u^I一u【10? 痢嘲嘲圈 一 糊 一 麟豳豳一 黼瞄一 瘌翮豳一 嘲嘲嘲 一 嘲嘲 一 嗍 OOOOO0OOOO 987654321 一罩—日一口u—l00《f_1_ 如如加0 —0?一0口?_I ? 300?河南职工医学院第19卷 ControlModelGLPP1GLplY2GLPP3MelNSDMSO 图4GLPP对大鼠海马GSH—Px活性的影响 注:与Control组比较,#P<0.05;与Model组比较P<0.05;数据用 X4-SD表示,n=6. 3讨论 近年研究充分显示氧化应激与阿尔茨海默病之 间有很强的相关性".阿尔茨海默病的病理特征 主要有老年斑,神经纤维缠结,神经元死亡.自由基 参与了这3种特征性病理损害.在正常情况下, 机体有对抗自由基损伤的酶系和非酶系统,抗氧化 酶中主要有超氧化物歧化酶(SOD),各种过氧化酶 如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px),过氧化氢酶 (CAT)和解毒酶等.SOD通过歧化反应清除0, 对氧化损伤起重要拮抗作用,GSH—Px可催化HO 还原成H,O,同时氧化2分子还原型谷胱甘肽 (GSH)生成1分子氧化型谷胱甘肽(GSSG),从而阻 止HO:与铁反应生成毒性更强的羟自由基 (OH一),这使得GST成为脑内一个重要的抗氧化保 护机制. 已有实验证明,大鼠在持续光照下,松果体重量 变轻,细胞变小,褪黑素(MT)合成减少;反之,大鼠 在持续黑暗环境中,松果体合成MT的酶活性增强, MT素合成增加?.实验和临床的证据都显示AD 患者存在MT合成及分泌下降,节律紊乱等多方面 异常…,12j.MT的分泌受光周期(光相一黑相)制约 影响,呈现24h节律性变化?.若将动物长期暴 露于光照中破坏光照的周期性影响或切除松果体均 可引起体内MT水平持续下降,从而影响个体的生 长,发育,性成熟和免疫等一系列生理功能?,并且 MT的减少可诱发氧化应激反应. 本实验发现模型组大鼠海马SOD,GSH—Px活 性均明显降低,MDA含量增高,提示持续光照可使 AD大鼠海马自由基清除能力下降,氧化应激反应 增强.作者推测,可能是持续光照造成了大鼠睡眠 节律紊乱,使得MT分泌减少,而MT是维持睡眠节 律所必需,且有很强的抗氧化作用.MT的减少造 成了海马氧化应激过强,从而引发一系列AD样病 理改变.而本实验结果显示:高剂量,中剂量GLPP 可以明显提高AD模型鼠脑海马组织SOD,GSH— Px活性,降低MDA含量,提示GLPP可以通过提高 AD大鼠海马抗氧化酶活性,降低膜脂质过氧化作 用,抑制海马tau蛋白过度磷酸化和AI3沉积,保护 神经元膜性结构及线粒体和突触的结构和功能,改 善AD大鼠记忆功能,从而达到防治AD的目的,而 低剂量GLPP无上述作用,表明GLPP预防AD样改 变与剂量有关. 参考文献: [1]MaccioniRB,MunozJP.ThemolecularbasesofADandother Neurodege—nerativedisorders.ArchMedRes,2001,32(5):367 — 381. 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