副溶血性弧菌快速检测研究进展_cropped

副溶血性弧菌快速检测研究进展_cropped 〃综述〃 副溶血性弧菌快速检测研究进展 谭翰清 ,万成松 中图分类号 : Q939. 1 用于细菌分型 。目前 ,通过血清学反应 , Vp 可分为 3 文献标识码 : A13 种 O 血清型 、71 种 K 血清型 。正确的分型为 () 文章编号 : 1671 - 5039 200401 - 0021 - 03流行病学调查和临床用药提供依据 。但此反应只能 大概区分不同地区和来源的菌株 ,而且由于抗原位( ) vibrio parahaemolyticus, Vp是一 副溶血性弧菌 点受环境等因素的影响易发生突变 ,出现新的血清( ) 种嗜盐性细菌 ,属弧菌科 Vibrio弧菌属 ,主要存在 4 型时 ,以现有的血清检测就会漏检 。 于近海岸的海水 、海底沉积物和鱼类 、虾类 、贝类 、牡 目前 ,应用最广泛的免疫学方法是酶联免疫吸 蛎等海产品中 。人多因食用被本菌污染而又未煮熟 ( ) 附法 enzyme linked immunosorbent assay , EL ISA。该 的海产品而引起中毒 , 在 细 菌 性 食 物 中 毒 中 , 比 例 方法从抗体的包被到酶联显色 ,都已经具备了成熟 高 、危害大 。目前 ,我国常规检测方法大多要经过前 的技术 ,易于制备试剂盒 ,操作简单 ,特异性好 ,灵敏 增菌 、选择性增菌 、选择性培养 、生化鉴定 、神奈川现 度高 。 象和血清学反应等过程 。这些实验操作繁琐 ,需耗 + (由于 Vp 临床分离株大多为 TDH 株 ,TRH ther2 时 5,6 d ,检出率低 ,给海产品生产 、出入境检验检 ) mostable related hemolysin阳 性 株 只 占 10 %, 15 % ,疫 、食品卫生监督等带来困难 ,影响经济发展 。我国 少数 为 TDH 和 TRH 双 阳 性 , 环 境 分 离 株 几 乎 无每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的报道 ,近年 + 5 ,6 1 TDH ,所以大多研 究 者 主 要 选 择 TDH、TRH 为 来世界发病率呈上升趋势。因此 ,建立 Vp 快速 、 抗原 ,制备相应的抗体进行检测 。 准确 、特异 、灵敏的检测诊断方法是十分必要的 。下 EL ISA 抗体的包被与固定是关键 , 影响检测的 面对副溶血性弧菌快速检测方法的研究进展进行综 7 灵敏度和特异性 。Honda 等了一种新的固定 述 。 () 方法 , 用 HCl 、聚乙烯 polythylence imine , PEI、甲 基 溶血试验KP 1 ( 乙烯基马来酸酐聚合醚 malwic anhydride methylvinyl ) 副溶血性弧菌临床分离株绝大部分都能产生耐ether copolymer ,MAMEC等化学试剂处理尼龙膜 ,接 () 热直接溶血毒素 thermostable direct hemolysin ,TDH, 着固定包被 TDH 和 TRH 的单克隆抗体 ,然后与 Vp并能在我萋血平板上产生一种特殊的溶血现象 ,叫 培养肉汤中 TDH 或 TRH 反应 15 min ,洗涤后 ,与抗2 ( ) 做神 奈 川 现 象 kanawaga phenomenen , KP。该 试 TDH、TRH 的兔血清多克隆抗体 37 ?反应 15 min ,再 验需经过前增菌 、选择性增菌 、选择性培养后 ,挑取 与碱性磷酸酶标记的抗兔抗体 IgG 反应 ,最后底物 可疑菌落接种到我萋血平板上 ,臵于 37 ?孵箱中过 显色 。结果显示 ,经过紧密相连的三次抗原抗体反夜 ,如菌苔周围出现透明溶血环 ,即为 KP 阳性 ,据 应 ,特异性 100 % , 灵敏度 9515 % ,并且通过肉眼观 此诊断样本中含有 Vp 。该试验是检测副溶血性弧 察就能区 分 TDH 和 TRH 株 。同 时 , 该 尼 龙 膜 也 可 菌最基本的方法 ,能把绝大部分副溶血性弧菌检测 以直接用于检测粪 便 标 本 , 特 异 性 达 8819 % , 灵 敏 () 出来 ,但操作繁琐 、所需时间长 约 4 d,而且存在部 度达 92 % ,并能在 1 h 内完成检测 。此固定方法减 - 分 TDH 株 ,易漏检 ,给人们健康带来危害 。 少非特异性吸附 ,增强抗体结合度 ,从而增强了特异 性 ,提高 了 灵 敏 度 。但 是 , 这 种 方 法 涉 及 到 抗 体 包 2 免疫学方法 被 、固定 、抗体的标记 、显色等步骤 ,操作繁琐 ,技术 免疫学方法特异性强 、灵敏度高 、易于观察 、应 要求高 ,而且尼龙膜不能长期保存 ,不能进行大规模 用广泛 。血清学反应是最基本的免疫学反应 ,主要临床检测 。同时 ,直接检测时 ,抗原量可能不足 ,抗 原位点也容易改变 ,导致出现新的血清型 ,如近年来 作者单位 :第一军医大学热带军队卫生学系微生物学教研室 , 8 出现新的 O3?K6 血清型,最终造成漏检 。 广东 广州 510515 11 因检测迎来了新的机遇 。2000 年 ,Makino 等已经 3 核酸杂交 完成 Vp 的基因组测序 , Vp 毒力基因及特异的基因 序列得到进一步确定 。根据 Vp 特异基因 序 列 , 设 免疫学方法是在蛋白水平检测 Vp ,而核酸杂交 计引物 ,进行 PCR 检测 ,是现阶段检测 Vp 的最快速 则是在基因水平进行检测 ,结果更为特异 、准确 、可 准确的方法 。目前应用于检测 Vp 的 PCR 方法主要 靠 。用于 检 测 Vp 的 核 酸 杂 交 方 法 主 要 有 斑 点 杂 ( ) 有任意引物 PCR abritrarily primed PCR ,Ap2PCR、针 交 、Southern 杂交 、夹心法杂交 。 ( ) 对任 意 引 物 PCR 、多 重 PCR multiplex2PCR、实 时 311 斑点杂交 9( ) PCR real2time PCR。 1992 年 , Yamamoto针 对 tdh 和 trh101 ,等 411 任意引物 PCR125bp 的基因设计探针 , 对 Vp 进行斑点杂交检测 , 12 Matsumoto 等采用任意引物 PCR 对 Vp 进行 其中 tdh 探 针 基 因 序 列 为 5′2ccccggttctgaXgagatattgtt2 检测 。他们针对 Vp 的 tdh 和 trh 基因一段特异的序 3′, trh 探 针 基 因 序 列 为 : 5′2tccaggttcggaXgagctactatt2 列 ,设计两条引物 ,引物 1 : 5′2ggtgcgggaa23′和引物 2 : 3′,X 为 dUTP ,用于标记碱性磷酸酶 。他们将 Vp 临 5′2gtttcgctcc23′,对 1977,1998 年所收集的 227 株 Vp 床分离 株 的 克 隆 基 因 片 段 点 到 尼 龙 膜 , 与 探 针 在 进行 PCR 。通过电泳分析发现 ,1996,1998 年收集 50 ?杂交 10 min ,洗涤 ,最后底物显色 。结果显示 , 的 22 株血清型为 03?K6 菌株与 1996 年以前收集的 tdh 探针特异性为 100 % 、灵敏度为 93 % ; trh 探针特 O3?K6 血清型菌株基因序列有所不同 ,为 O3?K6 血 异性为 93 % 、灵敏度为 86 % 。但是 ,tdh 探针把部分 清型新出现的变异株 ,并最初出现在孟加拉国 。这 弧菌科的其他细菌也检测出来 ,造成一定的假阳性 , 是目前最简单的以基因为基础的细菌亚分型方法 。 而且膜上核酸片段易脱落 ,不能长期保存 。 412 针对任意引物 PCR 312 Southern 杂交6 由于临床分离株绝大多数含有 tdh 基因 , 因此 1998 年 , Suthienkul 等对 137 株 Vp 临床 分 离 绝大 部 分 研 究 者 都 根 据 tdh 设 计 引 物 进 行 特 异 扩 株 进 行 Southern 杂 交 。tdh 探 针 选 自 p KY199 的 13 增 。1993 年 ,Lee 等根据 tdh 基因设计引物 ,对 36 EcoRI 片段 ,长 359 bp ,trh 探针选自 p KY298 的 EcoRI + - 片段 , 长 334 bp , 两探针的 dUTP 都标 记 上 地 高 辛 。 株 TDH 株 、89 株 TDH 株以及 46 株其他弧菌和肠 + 他们将菌株的 DNA 片段 Hind ?酶切 、电泳 、尼龙膜 道菌进行 PCR 检测 。结果显示 ,36 株 TDH 株全部 转移后 ,与 tdh 、trh 探针杂交 ,然后与碱性磷酸酶标 特异扩增出来 ,其余菌株都没有扩增 ;而检测灵敏度 记的抗地高辛抗体反应 ,最后底物显色 。结果显示 , 高 ,最低检测量可至 40 pg DNA ,并可直接检测粪便 + ( ) tdh 和 trh 探 针 特 异 性 好 , 把 tdh 株 共 127 株 和 标本 ,无需分离培养 ,方便快速 。 + () 14 trh 株 共 37 株全部检测出来 。然而 ,这种方法操 1999 年 , Kim 等选择 toxR 基因序列设计两对 作繁琐 、时间长 ,不适合临床实验室的快速检测 。 引物 ,5′2gtcttctgacgcaatcgttg23′和 5′2atacgagtggttgctgtcatg2 313 夹心法杂交 3′,对 14 株 Vp 、14 株其他弧菌进行 PCR 。结果显示 ,10 2003 年 ,Lee 等采用夹心杂交法检测海产品 14 株 Vp 都得到一条 368 bp 的特异扩增亮带 ,而其他 中 Vp 的 tl 基因 。他们对微孔板进行 NH 修饰 ,然后 15 菌株没有特异扩增 。此外 ,Venkateswaran 等选 择 与 tl 基 因 捕 获 探 针 的 磷 酸 基 团 共 价 结 合 , 接 着 把 16 gyrB 基因设计引物对 Vp 进行 PCR 、Cordova 等选择 PCR 变性产物 、标记生物素的信号探针加到微孔板 中进行杂交反应 ,洗涤后 ,与酶标链亲和素结合 ,最 pR72H 基因设计引物进行 PCR ,特异性 、灵敏度都很 后底物显色并在 405 nm 紫外灯下检测 。结果显示 , 好 。 该方法检测信噪比在 1411,4312 之间 , 特异性好 , 413 多重 PCR灵敏度高 ,能把每克牡蛎组织里 10 个 Vp 检测出来 。 由于不是全部副溶血性弧菌都含 tdh 或 trh 基该方法易于制成试剂 盒 , 目 前 , 美 国 市 场 上 已 有 销 售 。由于试剂盒已经把捕获探针固定在微孔板上 , ,所以只针对 tdh 或 trh 的单一 PCR ,有时会漏检 。因 检测时只需把 PCR 产物加到微孔板中杂交就行了 , 操作简单 ,重复性好 ,灵敏度高 ,特异性好 ,能进行临 ( ) 多重 PCR multiplex2PCR能 全 方 面 高 效 率 地 检 测 5 床大规模的快速检测 ,并且易于在普通实验室推广 。 Vp 。1994 年 ,Bej 等针对 tl 、tdh 、trh 设计不同的引 物对 ,在同一 PCR 反应体系内同时扩增 tl 、tdh 、trh 。 结果显示 ,所有的 Vp 都扩增出 tl 基因 ,tl 基因是 Vp 特异的 ;54 %的 Vp 扩增出 tdh 基因 ;只有 38173 %的 Vp 扩增出 trh 基因 ;该法灵敏度高 ,能把 10 g 牡蛎培 4 PCR 养肉汤里 10,100 个 Vp 检测出来 。与其他常规生 近年来 ,随着微生物基因组学的发展 ,微生物基化方法相 比 , 多 重 PCR 更 快 速 、仅 8 h 就 能 完 成 检 () ysisJ . FEMS Microbiol Lett , 1995 , 130 223: 287 - 292. 测 ,结果更为准确 、可靠 ,而且还可改进成定量竞争 4 Myers ML , Panicker G , Bej AK. PCR detection of a newly emerged PCR ,对标本中靶序列进行定量 。pandemic vibrio parahaemolyticus 03 :06 pathogen in pure cultures and 414 实时 PCRseeded waters from the gulf of mexico J . Appl Environ Microbiol , 常规 PCR 检测 ,需要从反应体系中吸取产物做 () 2003 ,69 4: 2194 - 2200 . 电泳或 Southern 杂交等实验进行鉴定 , 转移过程中 5 Bej AK , Patterson DP , Brasher CW , et al . Detection of total and 易污染 ,造成假阳性 ,而且耗费时间 。1996 年 , Tyagi hemolysin2producing vibrio parahaemolyticus in shellfish using multi2 ( ) 开创了一种实时 PCR real2time PCR。实时 PCR 是 plex PCR amplification of tl , tdh and trh J . J Microbiol Methods , 在 PCR 反应体系中加入标记有基团和猝灭基 () 1999 ,36 3:215 - 225 . 团的线性 Taqman 探针或茎环型荧光分子信标探针 , 6 Suthienkul O , Iida T , Park KS ,et al . Restriction fragment length poly2 在基因扩增过程中 ,与产物杂交 ,此时 ,报告基团和 morph2 ism of the tdh and trh genes in clinical vibrio parahaemolyticus 猝灭基团距离分开 ,根据能量共振转移现象 ,报告基 () strainsJ . J Clin Microbiol , 1996 ,34 5:1293 - 1295 . 团发出荧光而被检测 。这种方法操作简单 ,闭管检 Honda T ,Miwatani T , Yabushita Y ,et al . A novel method to chemically 7 测 ,减 少 污 染 , 灵 敏 度 高 , 并 且 可 以 在 PCR 结 束 或 immobilize antibody on nylon and its application to the rapid and differ2 PCR 过程进行同步定性或定量检测 ,而且可以进行 ential detection of two vibrio patahaemolyticus toxins in a . modified en2 临床大规模快速检测 。 zyme2linked immunosorbent assayJ . Clinical and diagnostic laborato 2 17 () ry immunology ,1995 ,2 2:177 - 181 . 2003 年 ,Blackstone 等针对 tdh 设计荧光分子 Okuda J , Ishibashi M , Hayakawa E , et al . Emergence of a unique O3 : 8 信标探针 ,对从牡蛎中富集的 13 个不同种类的菌株 K6 clone of vibrio parahaemolyticus in Calcutta . India , and isolation of 进行实时 PCR 检测 。结果显示 ,只有含 tdh 的 Vp 才strains from the same clonal group from Southeast Asian travelers arriv2 被检测出来 ,特异性好 ,灵敏度高 ,能把每个纯培养 () ing in JapanJ . J Clin Microbiol ,1997 ,35 12:3150 - 3155 . 体系的 1 个 CFU 检测出来 。实时 PCR 检测快速准 Yamamoto K , Honda T , Miwatani , et al . Enzyme2labeled oligonu2 9 cleotide probes for detection of the genes for thermostable direct 确 ,但需要价格昂贵的荧光检测仪和荧光分子标记 ( ) ( ) hemolysin TDHand TDH2related hemolysin TRHof vibrio para2 探针 ,一般的实验室不能广泛开展 。分子信标实时 () haemolyticus J . Can J Microbiol , 1992 ,38 5:410 - 416 . PCR 自 1996 年开创以来短短几年就得到蓬勃的发 Lee CY , Panicker G , Bej AK. Detection of pathogenic bacteria in 10 展 ,相信随着经济的发展 、技术的进步 、实时荧光检 shellfish using multiplex PCR followed by covalink NH microwell plate 测仪的普及 ,将会得到更为广泛的应用 。 ( ) sandwich hybridezationJ . J Microbiol Methoeds , 2003 ,53 2:199 - 209 . Makino K ,Oshima K , Kurokawa K , et al . Genome sequence of vibrio 11 parahaemolyticus :a pathogenic methanism distinct from that of vibrio 5 展望 () cholerae J . Lancet ,2003 ,361 9359:743 - 749 . Matsumoto C , Okuda J , Ishibashi M , et al . Pandemic spread of an 12 随着微生物基因组学 、现代分子生物学理论与 O3 : K6 clone of vibrio parahaemolyticus and emergence of related 技术的发展以及新仪器研发 ,副溶血性弧菌的检测 strains evidenced by arbitrarily primed PCR and toxRS sequence anal2 方法必将向快速 、准确 、灵敏 、特异的方向发展 ,特别 () ysesJ . J Clin Microbio ,2000 ,38 2:578 - 585 . Lee C ,Pan SF. Rapid and specific detection of the thermostable direct 是 PCR 、核酸杂交 、EL ISA 这三大现代分子生物学技 13 haemolusin gene in vibrio parahaemolyticus by the polymerase chain 术的联用以及实时 PCR 的进一步完善 ,将会实现副 ( ) reactionJ . Gen Microbiol ,1993 ,139 Pt 12:3225 - 3231 . 溶血弧菌快 速 、准 确 、灵 敏 、特 异 、大 规 模 的 检 测 诊 Kim YB ,Okuda J , Matsumoto C , et al . Identification of vibrio para2 14 断 ,大大提高食品检验检疫和临床诊断的检测质量 haemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR 和效率 。 () gene J . J Clin Microbiol ,1999 ,37 4:1173 - 1177 . Venkateswaran K ,Dohmoto N , Harayama S. 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