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骨桥蛋白与CD44v6在结肠腺癌中的达及其临床意义.pdf.doc 中图分类号:R735.3+5 编号:20110237 承德医学院 硕士研究生毕业论文 骨桥蛋白与 CD44v6在结肠腺癌中的表达及其临床意义 Expression of osteopontin and adhesion molecule CD44v6 in Colon adenocarcinoma and their clinical significance 研究生:张晔 导 师:卞永生教授 学科专业:肿瘤学 所在系部:保定市第一医院 研究起止日期:2012年 9月,2014年 3月 论文提交日期:2014年 3月 承德医学院 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学 位论文研究所获的研究成果，其知识产权归承德医学院所有。承德医学院 有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相 关的论文，第一署名单位为承德医学院，试验、原始数据、申报的专 利等知识产权均归承德医学院所有。否则，承担相应的法律责任。 研究生签名: 导师签章: 年 月 日 承德医学院 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名: 导师签章: 年 月 日 骨桥蛋白与 CD44v6在结肠腺癌中的表达及其临床意义 Expression of osteopontin and adhesion molecule CD44v6 in Colon adenocarcinoma and their clinical significance 研究生:张晔 学 号:20110237 年 级:2011级 导 师:卞永生教授 学科专业:肿瘤学 所在系部:保定市第一医院 研究方向:结直肠肿瘤 研究起止日期:2012年 9月,2014年 3月 论文提交日期:2014年 3月 目 录 中文摘要...................................................... .....................................................1 英文摘要............................................................................................................4 英文缩写............................................................................................................7 研究论文骨桥蛋白与 CD44v6在结肠腺癌中的表达及其临床意义 前言............................................................................................................9 材料与法..................................................................................................10 结果..........................................................................................................12 附图..........................................................................................................14 附表..........................................................................................................16 讨论..........................................................................................................20 结论..........................................................................................................28 参考文献..................................................................................................29 综 述..........................................................................................................33 致 谢..........................................................................................................40 个人简历..........................................................................................................41 中文摘要 骨桥蛋白与 CD44v6在结肠腺癌中的表达及其临床意义 摘要 目的: 结肠癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一近年来我国结肠癌 的发率生及患者死亡率呈逐年逐渐上升趋势复发及转移是结肠癌导致患 者死亡的主要原因。而结肠癌的病理表达中结肠腺癌占大部分比例。目前 结肠腺癌临床尚无明确的肿瘤标记物为临床结肠癌早期诊断和治疗做出 指导。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种含有多种功能的分泌型钙结 合磷酸化糖蛋白。它是一种与肿瘤细胞的转化、浸润和转移有关的蛋白质。 并且是通过与整合素受体、CD44受体结合来实现调节细胞基质相互作用 和信号转导,使细胞无限制增殖,形成肿瘤。CD44是分布极为广泛的细 胞表面跨膜蛋白，同时是一条糖基化的跨膜多糖链。CD44v6是CD44的 外显子不同表达方式体现一种变异型蛋白。 CD44一种是的研究时间较 长、并且研究较深入较广泛的蛋白。已知CD44是分布极为广泛的细胞表 面跨膜糖蛋白，它主要参与肿瘤的异质性粘附，即肿瘤细胞与宿主细胞和 宿主基质的粘附，肿瘤的异质性粘附在肿瘤细胞侵袭和转移过程中起促进 作用。CD44v6作为CD44配体在这个过程中起到重要作用。 本文通过对 OPN、CD44v6在正常结肠组织、结肠腺瘤组织、结肠腺 癌组织中的表达水平进行研究,从而研究二者与结肠腺癌的发生、发展的 关系。为结肠腺癌的研究提供分子学水平的依据。为临床诊断、治疗结肠 腺癌提供一定的帮助。 方法: 收集保定市第一医院 2005年 1月- 2012年 12 月经病理学证实的切 除的结肠腺癌蜡块标本 80例,其中无淋巴结转移 48例，有淋巴结转移 32 例。其中男 47例女 33例。年龄 35—80岁。平均年龄 58岁。所有选择标 本术前均未行任何相关抗癌治疗。标本均在癌灶中央常规取材 , 0.5%甲 醛固定,常规石蜡包埋,4μm厚连重新续切片。另取正常结肠组织 20例 1 和结肠息肉组织 30例作为对照组。所有标本采用免疫组化链霉素抗生物 素蛋白-过氧化物酶(S-P)法检测 OPN、CD44v6在蜡块标本组织切片中 中文摘要 的表达。结果统计学处理采用 SPSS17.0统计学软件行统计学检验和相关 分析。本研究资料均为计数资料采用 χ2检验.当某一个理论数 1,T?5时， 须对 χ2进行连续性校正，以 P,0.05为差异有显著性。二者相关性采用结果: Spearman相关分析。 OPN、CD44v6在细胞中表达定位观察:免疫组化结果显示, OPN主 要表达于癌细胞胞质中,呈强染色或中等染色，巢状或片状分布,部分腺腔 上皮细胞和血管内皮细胞亦呈中等染色，间质细胞中无或弱染色;而 CD44v6主要在癌细胞胞膜上表达，胞质内偶见棕黄色颗粒，间质中几乎 无阳性细胞。观察染色阳性反应均由两位高年资病理师独立观察每张切片 后一起作出判断。OPN在 80例结肠腺癌组织中 58例表达。30例结肠腺 瘤组织中和 20例正常结肠分别有 7例和 0例阳性表达。阳性表达率分别 72.5%、23.3%和 0.0%。CD44v6在结肠腺癌组织中 64例表达，在结肠腺 瘤组织中 11例阳性表达在正常结肠组织中 1例阳性表达。阳性表达率分 别是 80%、25.6%和 5%。在正常结肠组织和结肠腺瘤组织中 OPN表达差 异有统计学意义(χ2=5.426，P=0.02)，在正常结肠组织和结肠腺癌中 OPN 表达差异有统计学意义(χ2=34.524，P<0.001)，在结肠腺瘤和结肠腺癌 中 OPN表达差异有统计学意义(χ2=22.818，P<0.001)。在正常结肠组织 和结肠腺瘤组织中 CD44v6表达差异有统计学意义(χ2=6.579， 80例结肠腺癌中 OPN和 CD44v6同时表达阳性为 56例，OPN表达 P=0.01)， 阳性 CD44v6表达阴性的为 8例。OPN和 在正常结肠组织和结肠腺癌中 CD44v6表达同时为阴性为 8 CD44v6表达差异有统计学意义 例，OPN阴性表达 CD44v6阳性表达为 16例。通过 (χ2=39.560，P<0.001)，在结肠腺瘤和结肠腺癌中 CD44v6表达有统计 Spearman相关分析， 学意义(结论:χ2 =18.885，P<0.001)。得出两者在结肠腺癌、结肠腺瘤和正常 结肠腺癌中 OPN表达与 CD44v6的表达呈正相关，随着OPN阳性表达结肠组织中的表达差异有统计学意义。 虽然本研究对 OPN与 CD44v6在肿瘤发生、发展过程中具体作用的 及生 物学方式尚未特别明确，但两者在肿瘤中的作用基本明确，增强，CD44v6的阳性表达逐渐增强(P<0.05 r=0.252)。 2 OPN与 中文摘要 CD44v6可能参与并促进了结肠腺癌的发生、发展过程。对结肠腺癌的淋 巴结转移起到一定促进作用。OPN与 CD44v6与结肠腺癌的发生、发展 呈正相关。二者在结肠腺癌中表达的联合检测有助于临床对结肠腺癌的早 期诊断、恶性程度、转移及预后程度有一定帮助。关键词:结肠腺癌;肿瘤转移;OPN;CD44v6; 免疫组织化学 3 英文摘要 Expression of osteopontin and adhesion molecule CD44v6 in colon adenocarcinoma and their clinical significance ABSTRACT Objective: Colon cancer is one of common malignant tumors which is severely harmful to human health. In recent years, the incidence and mortality rate of colon cancer are gradually rising, recurrence and metastasis of colon cancer are the main cause of death. Most of the pathological expressions of colon cancer are colon adenocarcinoma. Currently there is no clear colon adenocarcinoma tumor marker for the early diagnosis and treatment guidance. Osteopontin (osteopontin, OPN) is a secreted calcium has multiple functions combined with phosphorylated glycoprotein. It is a kind of proteins related to the tumor cell transformation, infiltration and metastasis. And with the integrin receptor, CD44 receptor binding to regulate the cell -matrix interactions and signal transduction, enable the unrestricted proliferation of cells to form tumors. CD44 is a widely distributed transmembrane protein expressed on cell surface, and it is also a glycosylated transmembrane polysaccharide chain. CD44v6 is a variant protein which is a different expression exon of CD44. It has been a long time to study on CD44 and the study is thorough extensive. CD44 is known as a widely distributed transmembrane glycoprotein expressed on cell surface mainly involved heterogeneous adhesion, i.e tumor cells and the host cells and host matrix adhesion, adhesion heterogeneity plays a catalytic role in the invasion and metastasis of tumor cell. CD44v6 as ligands of CD44 plays an important role in this process. Based on the study of OPN, CD44v6 expression levels in normal colon tissue, colon adenomas, colorectal adenocarcinoma, to study the relationship of the OPN &CD44v6 to the colon cancer occurrence and development. Providing the Molecular level foundation for the study of colon 4 英文摘要 adenocarcinoma. And providing some help to the clinical diagnosis and treatment of colon cancer. Methods: Collect 80 cases resection specimens of menstrual pathology confirmed colon cancer of Baoding First Hospital from January 2005 to December 2012, including 48 cases without lymph node metastasis, 32 cases with lymph node metastasis, of which 47 males and 33 females. Age 35-80 years old. The average age is 58 years old. All specimens were not treated with any anti-cancer treatment before surgery. Specimens were routinely drawn in the center of focus, 0.5% formalin-fixed, paraffin-embedded, 4 μm thick serial sections. And collect 20 cases of normal colon tissue and 30 cases of colon polyps for comparison. All specimens are adopted the immunohistochemistry streptomycin avidin - peroxidase (SP) method to inspect OPN, CD44v6 expression in the tissue sections. The results will be analyzed by SPSS17.0 statistical software. The research data are count data using χ2 test when a certain theoretical number 1,T?5, it must be corrected with χ2 test. If P <0.05, then it will be considered as statistically significant. Using Spearman to analyze the correlation of the two. Results: OPN, CD44v6 Expression and localization observed in cells : Immunohistochemistry shows that OPN is mainly expressed in the cytoplasm of cancer cells as strong staining or moderate staining, nested or flake distribution, some of glandular epithelial and endothelial cells are also moderate staining, stromal cells are no or weak staining; while CD44v6 is mainly expressed on the membrane of cancer cells, and occasionally brown granules in the cytoplasm, almost no positive cells in the stroma. Positive reaction was observed by two professional pathologists who observed each slice independently and made the judgment together. OPN is expressed in 58 cases of colon adenocarcinoma out of the 80 cases colon adenocarcinoma tissues. There are 7 cases of positive expression out of the 30 cases of colorectal adenoma and 0 case of position expression out of 20 cases of 5 英文摘要 normal colon. The positive expression rates are 72.5%, 23.3% and 0.0%. CD44v6 is expressed in 64 cases of colon adenocarcinoma, 11 cases of positive expression in normal colon tissues, one case expression in the colon adenoma tissue. The positive expression rates are 80%, 25.6% and 5%. In normal colon tissue and colon adenoma tissue, OPN expression differences are statistically significant (χ2= 5.426, P = 0.02), in normal colon tissue and colon adenocarcinoma OPN expression differences are statistically significant (χ2 = 34.524, P < 0.001 ) ,OPN expression in colon adenoma and colon adenocarcinoma differences are statistically significant (χ2 = 22.818, P <0.001). In normal colon tissue and colon adenoma tissue CD44v6 expression difference was statistically significant (χ2 = 6.579, P = 0.01), in normal colon tissue and colon adenocarcinoma CD44v6 expression differences are statistically significant (χ2 = 39.560, P <0.001), in the colon adenoma and colon adenocarcinoma CD44v6 expression is statistically significant (χ2 = 18.885, P<0.001). The differences between the expression obtained in colon adenocarcinoma, colorectal adenoma and normal colon tissues are statistically significant. 56 cases OPN and CD44v6 expression out of the 80 cases of colon adenocarcinoma are simultaneous positive, 8 cases are OPN positive expression while CD44v6 expression is negative. 8 cases OPN and CD44v6 expression are negative, 16 cases OPN expression are negative while CD44v6 expression are positive. By Spearman correlation analysis, OPN and CD44v6 expression in colon adenocarcinoma are positively correlated, with enhanced expression of OPN, CD44v6 expression gradually increased (P <0.05 r = 0.252). Conclusion: Although in the study the effects of OPN and CD44v6 in tumor development process is not so clear, their roles in the tumor basically clear, OPN and CD44v6 may be involved in the occurrence and development of colon cancer. It also facilitates the Lymph node metastasis of colon adenocarcinoma. OPN and CD44v6 are positive correlated with the colon 6 英文摘要 cancer occurrence and development. Combined inspection the expression of the two in colon adenocarcinoma will help the early clinical diagnosis, degree of malignancy, metastasis and prognosis in colorectal adenocarcinoma. Key Words: Colon cancer; tumor metastasis; OPN; CD44v6; 7 英文缩写 英文缩写 英文缩写 英文全称 中文译名 CD44 Cluster of differentiation 44 人类白细胞分化抗原 OPN osteopontin 骨桥蛋白 CD44V区外显子 CD44v6 CD44v6 molecule PBS 磷酸缓冲液 Phosphate buffered saline Arg-Gly-Asp RGD 精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸 激活蛋白(AP)1 AP-1 Activator protein-1 EGFR Epidermal growth factor receptor表皮生长因子受体 VEGF Vascular endothelial growth血管内皮生长因子 factor UICC Internatinonal Union Against国际抗癌联盟 Cancer 细胞外基质 ECM extracellular matrix HE Heermatoxylin-Eosin 苏木素-伊红 High endothelial venule 高内皮小静脉 HEV MMP-2 matrixmetalloproteinase2 基质金属蛋白酶 VEC vascular endothelial cell 血管内皮细胞 8 研究论文 骨桥蛋白和CD44v6在结肠腺癌中的表达及其临床意义 前 言 结肠癌是人类肿瘤的高发类型，全球结肠癌以每年 2%的速度增长， 其中我国每年的增长率 4.2%。我国近年来结肠癌的发病率已越居世界第 一。结肠癌的发生率升高与现代人日常生活环境和生活习惯有密切关系。 尽管现在临床医学对结肠腺癌早期诊断，早期治疗已取得明显进展，但仍 有 1/3的患者死于复发和转移[1]。如果能在肿瘤类疾病的早期做出正确的 诊断对肿瘤疾病的治疗与预后都有重要的临床意义。 OPN(osteopontin骨桥蛋白)是一种 1979年由Senger等人首次报 道 出的一种转化特异性分泌蛋白与肿瘤的关系的蛋白，当时称之为转化相关 性磷酸蛋白。后来 Franzen等从骨组织中分离出一种磷蛋白，其特性与 Senger等发现的磷蛋白相似，而正式命名为骨桥蛋白。它是一种与肿瘤细 胞的转化、浸润和转移有关的蛋白质。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是 一种含精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)的分泌型糖基 化磷蛋白，它的类型归类于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白。 OPN既是细胞因子，又是细胞的黏附分子。近年来研究表明OPN在多种肿 瘤中呈过表达，且与肿瘤的浸润，转移密切相关。人类 CD44基因位于11 号染色体短臂，全长约50kb，共由20个高度保守的外显子组成，每个外显 子长度70-210bp不等，中间由长短不一的内含子分隔。CD44基因的20个外 显子按照转录方式不同可分为组成型外显子(C)和变异型拼接外显子(V) 两大类。CD44v6是黏附分子家族的重要成员,是细胞表面的一种跨膜糖 蛋白, CD44v6有可能通过促进肿瘤细胞与血管内皮细胞和细胞外基质的黏 附,从而促进肿瘤向基质的浸润 ,影响肿瘤细胞骨架蛋白的聚集和分布 , 从而影响肿瘤细胞的迁徙运动能力[2]。OPN通过其特有的RGD结构与整合 素结合,且通过非依赖RGD结构的方式与CD44结合。目前,OPN在结肠癌 组织中表达状况报道较少。本文对OPN、CD44v6在结肠癌中的表达水平 进行研究,并初步了解其临床意义。 9 研究论文 材料与方法 1 、实验材料和标本的采集: 1.1收集保定市第一医院 2005年1月至2012年12月经病理学诊断证实为 结肠腺癌蜡块标本80例。其中男47例，女33例;年龄35,80岁，平均年龄 58岁。根据UICC提出的TNM分期法其中?期7例，?期23例，?-?期50 例。所有选取标本术前均未行任何相关治疗。结肠腺癌标本均在癌灶中央 取材,中性福尔马林固定,常规石蜡包埋, 4μm厚度连续切片。另取正常 结肠组织20例中性福尔马林固定,常规石蜡包埋, 4μm厚度连续切片。和 结肠腺瘤组织30例均在腺瘤中央取材,中性福尔马林固定,常规石蜡包埋, 4μm厚度连续切片作为对照组。 1.2正常组织(对照组):取结肠肿物5cm以上经病理学证实的正常结肠 组织20例。 1.3结肠腺瘤(对照组):取经病理学证实的结肠腺瘤组织 30例。任何 标本术前均未做相关抗癌治疗。 2.1切片制备 将载玻片放置于浓硫酸中 12小时，取出后蒸馏水洗净，放入烤箱烘 干，放入 0.1%的多聚赖氨酸中溶液中 1min，取出后烤箱烘干，置成防脱 片载玻片。 2.2标本处理 所有标本均经4%甲醛溶液固定，将标本放入包埋框合成模型槽，注 入石蜡。包埋完后，将其置于冷冻台上，当冷冻台上的包埋块表面出现凝 结固定后取出蜡块，修削去周边的余蜡。每包埋完一块组织块，即将标签 附上，以防出错。蜡块常规行4μm厚度连续切片。 3 、试 剂 OPN抗体(兔抗人单克隆抗体 ,上海江莱生物科技有限公 司 ),工作 液浓度为 1:150;CD44v6(即用型，兔抗人单克隆抗体，福建迈新试剂 公司);免疫组化试剂盒(福建迈新公司);显色剂(3、3-二氨基联苯胺， 福建迈新试剂公司)。 4 、仪 器 免疫组化专用湿盒 福建迈新公司 10 研究论文 抗原修复盒 福建迈新公司 美的集团 美的微波炉 海尔集团 海尔低温冰箱 LEICA RM切片机 德国 OLYMPUS双目显微镜日本 加液枪 上海求精生化试剂有限公司 PHY-?病理组织漂烘仪常州市中威电子仪器厂 保定市第一医院病理科提供:载玻片、梯度酒精液、二甲苯溶液、苏 木素染色剂、3,H2O2溶液，中性树胶、PBS液、EDTA缓冲液等等。 5、实验步骤 (1)常规石蜡切片脱蜡至水。 (2)抗原修复，可在微波炉内高火 4-5min，后低火 15min。 (3)3%H 2 O 2室温孵育 5-10分钟，用以消除内源性过氧化物酶 的活 性。 (4)蒸馏水冲洗，PBS液浸泡,5分钟 x2。 (5)滴加一抗(OPN、CD44v6)工作液，37?孵育 1-2小时或 4?过 夜。 (6)PBS液冲洗，5分钟 x3次。 (7)滴加适量生物素标记二抗工作液，37?孵育 20 分钟。 (8)PBS液冲洗，5分钟 x3次。 (9)滴加适量的二抗增强剂，37?孵育 30分钟。 (10)PBS液冲洗，5分钟 x3次。 (11)DAB显色剂显色 3-15分 钟。 (12)蒸馏水充分冲洗，复染，脱水，透明，树胶封片。 (13)显微镜下观察切片染色。 6 、结果判 断 OPN主要表达于癌细胞胞质中,呈强染色或中等染色，巢状或片状分 布,部分腺腔上皮细胞和血管内皮细胞亦呈中等染色，间质细胞中无或弱 染色。CD44v6于癌细胞细胞膜染色呈棕黄色染色。判断根据，按切 片中阳性细胞数占细胞总数的比例计分:0分，无阳性细胞显染色;1分,阳 性细胞<25%染色;2分,阳性细胞 25%-50%染色;3分，阳性细胞>50%染 11 研究论文 色。请 2名主治资格以上的病理科医生帮助观察每一张切片的所有染色优 良情况，以择优选择观察对象。观察阳性反应由两位高年资病理师独立观 察每张切片后一起作出判断。 7 、统计学处 理 实验数据的统计学处理通过 SPSS17.0统计软件完成，采用 Spearman 等级相关分析 OPN、CD44v6的相关性。计数资料采用χ2检验，当某一 个理论数 1,T?5时，须对 χ2进行连续性校正，以 P,0.05为差异有统计 学意义。 结 果 1、OPN与 CD44v6在结肠腺癌、结肠腺瘤、正常结肠组织中的表达。 1.1、 OPN在结肠腺癌、结肠腺瘤、正常结肠组织中的表达。 OPN主要表达于癌细胞胞质中,呈强染色或中等染色，巢状或片状分 布,部分腺腔上皮细胞和血管内皮细胞亦呈中等染色，间质细胞中无或弱 染色。 OPN在 80例结肠腺癌组织中 58例表达图一。30例结肠腺 瘤组织中 和 20例正常结肠分别有 7例图二和 0例阳性表达。阳性表达率分别为 72.5%、23.3%和 0.0%。在正常结肠组织和结肠腺瘤组织中 OPN表达差异 有统计学意义(P<0.05)见表一，在正常结肠组织和结肠腺癌中 OPN表 达差异有统计学意义(P<0.001)见表二，在结肠腺瘤和结肠腺癌中 OPN 表达差异有统计学意义(P<0.001)见表三。得出 OPN在结肠腺癌、结肠 1.2、 CD44v6在结肠腺癌、结肠腺瘤、正常结肠组织中的表达 腺瘤和正常结肠组织中的表达差异具有统计学意义。 CD44v6主要在癌细胞胞膜上表达，胞质内偶见棕黄色颗粒，间质中 几乎无阳性细胞。 CD44v6在结肠腺癌组织中 64例表达图三，在结肠腺瘤组织中 11 例阳性表达图四，在正常结肠组织中 1例阳性表达。阳性表达率分别是 80%、25.6%和 5%。在正常结肠组织和结肠腺瘤组织中 CD44v6表达差异 有统计学意义( P=0.01)见表四，在正常结肠组织和结肠腺癌中 12 CD44v6 研究论文 表达差异有统计学意义( P<0.001)见表五，在结肠腺瘤和结肠腺癌中 CD44v6表达有统计学意义(P<0.001)见表六 2. OPN和 CD44v6与结肠腺癌临床病理特征关系 2.1 OPN在结肠腺癌中的表达与结肠腺癌的临床病理特征的关系见表 七 经研究 OPN在结肠腺癌中的表达与标本的年龄、性别无关 (P>0.05)。而与结肠腺癌是否有淋巴结转移和临床分期有关。OPN的 阳性率差异有统计学意义(P<0.005)。 2.2 CD44v6在结肠腺癌中的表达与结肠腺癌的临床病理特征的关系见 表八 经研究证明 CD44v6在结肠腺癌中的表达与标本的年龄、性别无关 (P>0.05)。而与结肠腺癌是否有淋巴结转移和临床分期有关。OPN的 阳性率差异有统计学意义(P<0.005)。 2.3 OPN和 CDv6在结肠腺癌中表达的相互关 系 80例结肠腺癌中 OPN和 CD44v6同时表达阳性为 56例，OPN阳性 CD44v6表达阴性的为 8例。OPN和 CD44v6表达同时为阴性为 8例，OPN 阴性 CD44v6阳性表达为 16例。通过 Spearman相关性分析，结肠腺癌中 OPN表达与 CD44v6的表达呈正相关，随着OPN阳性表达的增强，CD44v6 的阳性表达逐渐增高。见表九 附图 13 研究论文 Fig.1 OPN expression in colon adenocarcinoma Fig.2 OPN expression in colorectal adenomas Fig.3 CD44v6 expression in colon adenocarcinoma 14 研究论文 Fig.4 CD44v6 expression in colorectal adenomas 15 研究论文 附表 Table 1 OPN in normal colon tissue and colon adenoma. Groups n OPN The positive χ2 Positive P rate Normal 20 0 0.00% 5.426 0.02 30 7 Adenoma 23.3% Table 2 OPN in normal colon tissue and colon adenocarcinoma. Groups n OPN The positive χ2 Positive P rate Normal 20 0 0.00% 34.524 <0.001 Adenocarcino 80 58 72.5% ma Table 3 OPN expression in colon adenoma and colon adenocarcinoma. Groups n OPN The positive χ2 Positive P rate Adenoma 30 7 23.3% 22.818 <0.001 Adenocarcino 80 58 72.5% ma Table 4 CD44v6 in normal colon tissue and colon adenoma. Normal n CD44v6 The positive χ2 Positive P rate Normal 20 1 5.00% 6.579 =0.001 30 Adenoma 11 25.6% 16 研究论文 Table 5 CD44v6 in normal colon tissue and colon adenocarcinoma. Normal n OPN The positive χ2 Positive P rate Normal 20 1 5.00% 39.560 <0.001 Adenocarcino 80 64 80.0% ma Table 6 CD44v6 in normal colon adenoma and colon adenocarcinoma. Normal n OPN The positive χ2 Positive P rate 11 Adenoma 30 25.6% 18.885 <0.001 Adenocarcino 80 64 80.0% ma 17 研究论文 Table 7 OPN relationship with clinicopathological features of colon cancer The clinical and n OPN pathological features χ2 Positive The positive P rate 33 Sex male 47 70.2% 0.300 0.585 female 33 25 75.7% >58 53 38 71.6% Age 2.350 0(822 27 20 74.0% <58 0.001 30 17 56.6% stage ? 10.165 +? 50 44 88.0% ?+? 32 28 87.5% 0.075 0.014 Yes Lymph node metastasis No 48 30 62.5% 18 研究论文 Table 8 CD44v6 relationship with clinicopathological features of colon cancer The clinical and n OPN pathological features χ2 Positive The positive P rate 37 Sex male 47 78.7% 2.352 0.125 female 33 27 81.8% >58 53 41 77.3% Age 0.560 0(408 27 23 85.1% <58 8.335 30 20 66.6% ? 0.004 +? stage ?+? 50 46 82.1% 32 30 93.7% Yes 6.446 0.012 Lymph node metastasis NO 48 34 70.8% Table 9 Correlation between OPN and CD44v6 expression in colon adenocarcinoma CD44v6 OPN Total Positive Negative 56 Positive 14 70 8 Negative 8 16 (r=0.252，P<0.05) 讨论 19 研究论文 在各种肿瘤中结肠癌的预后相对较好，有关统计显示:行结肠癌根治 术后五年生存率可达 50,以上，其中，早期诊断并采取手术根除的患者 五年生存率可高达 80,以上，而晚期患者术后五年生存率仅有 30,左右 (以上统计数据包含不同部位结肠癌)。只有早期确诊病情才能早期行手 术治疗，因此早期诊断及早期治疗对结肠癌患者的预后尤为重要。但结肠 病变早期症状不明显，临床表现可有: (1)腹痛及下消化道的激惹症状: 大多数病人有不同程度的腹痛及腹部不适，如腹部隐痛、右侧腹饱胀、恶 心、呕吐及食欲不振等，进食后症状常加重，或有时伴有间歇性腹泻或便 秘、易与右下腹常见的慢性阑尾炎、回盲部结核、回盲部节段性肠炎或淋 巴肿瘤相混淆而不宜诊断。结肠肝曲癌可表现为右上腹阵发性绞痛，难以 与慢性胆囊炎鉴别诊断。(2)排便习惯和粪便性状的改变:此现象是癌 肿坏死时形成的溃疡而后发生溃疡感染引起肠道感染的结果。因毒素刺激 结肠产生排便习惯改变，排便次数的改变，有时腹泻与便秘交替出现，排 便前可有腹部绞痛，便后缓解。如癌肿位置较低或位于直肠，可有肛门坠 痛、排便不畅或里急后重等直肠刺激症状。粪便常不成形，混有黏液、脓 血，有时含血量较大常被误诊为痢疾、肠炎、痔出血等。 (3)腹部肿块: 一般形状不规则，质硬，表面呈结节状，是否活动根据部位不同而不一致。 横结肠和乙状结肠癌早期有一定的活动度及轻压痛。升、降结肠癌如已穿 透肠壁与周围脏器粘连，慢性穿孔形成脓肿或穿破邻近脏器形成内瘘时， 肿块多固定不动，边缘不清楚，压痛明显，腹膜炎严重时引起板状腹(此 时急诊开腹，术中发现肿瘤手术往往效果较差)等等临床症状。但如果发 现出血、包块时往往已是结肠癌晚期治疗效果基本不太满意。对于有以上 临床表现的患者如不行系统检查往往误诊，临床大夫对于怀疑肠道病变的 患者需根据病史、体征、全身情况等行诊断及手术评估，有些高龄患者早 期没有明显临床表现，但中晚期确诊时或病灶已转移或身体基础条件差等 已无手术意义。其中结肠腺癌是结肠腺上皮来源的常见消化道恶性肿瘤。 结肠腺癌是结肠癌中最常见恶性肿瘤分类。 恶性肿瘤最主要的生物学特点是局部浸润和远处转移，并且是恶性肿 瘤局部浸润压迫临近器官和远处转移引起的全身器官衰竭是导致患者死 亡的主要原因。肿瘤是由一个转化细胞不断增生转化形成的，一个的恶性 20 研究论文 肿瘤的发生、发展史可大概分为几个阶段:细胞转化为恶性?转化细胞的 克隆性增生(抑制细胞失控)?局部浸润?远处转移。在此过程中，恶性 转化细胞的内在特点如肿瘤的生长分数、肿瘤血管形成等等因素共同影响 肿瘤的发生和发展。在整个过程中肿瘤的肿瘤血管形成为其演变过程中占 有重要地位，肿瘤新血管的形成即为肿瘤生长提供营养支持又为肿瘤的血 道转移提供途径。所以很多学者研究肿瘤亦同时研究肿瘤血管形成的机 制，意图从肿瘤血管方面抑制肿瘤的生长、发展。同理如果有因子可促进 肿瘤血管形成，便为促肿瘤生长因子。恶性肿瘤的形成是一个长期的多因 素形成的分阶段的过程，要使细胞完全恶性转化形成肿瘤，是多个基因的 转变，包括多个癌基因的突变和机体肿瘤抑制基因的失活，以及凋亡调节 和 DNA修复基因的改变。 本人通过阅读诸多前者文献发现 OPN和 CD44v6在肿瘤的 很多环节 中起到促进肿瘤发展的作用，但 OPN与 CD44v6在结肠腺癌的表达情况 及与结肠腺癌的关系报道与研究情况较少。OPN和 CD44v6在人体内通过 包含的 RGD序列与 CD44v6受体相互作用共同促进肿瘤的发展。所以本 1、 OPN在结肠腺癌中的表达 意义实验通过同时检测 OPN和 CD44v6在结肠腺癌中表达，从而为随着医学分子生物学的很大的进步，近年来对于肿瘤的病因与发病机 结肠腺癌 制的研究有了长足的进展。但是肿瘤的发生发展是异常复杂的，目前了解 诊断提供两者新的肿瘤标记物。 的可能只是冰山一角，还有许多未知的领域。但以下几点是迄今比较肯定 的:?肿瘤从遗传学上的角度上来说是一种基因改变并伴有遗传性的疾 病。?肿瘤的形成是瘤细胞单克隆性扩增的结果。?环境的和遗传的致癌 因素引起的细胞遗传物质(DNA)改变的主要靶细胞基因是原癌基因和 和肿瘤抑制基因。原癌基因的激活和(或)肿瘤抑制基因的失活共同出现 可导致细胞的恶性转化。?肿瘤的发生不只是单个基因突变的结果，而是 一个长期的、分阶段的、多环节、多种基因突变积累的过程。?机体的免 疫监视体系在防止肿瘤发生上起重要作用，肿瘤的发生是免疫监视功能丧 失的结果。很多肿瘤患者死亡是由于远处转移而治疗效果不满意而至使患 者死亡或生活质量低。而另外则是术后复发而引起的不良后果。这两种原 因皆是晚期肿瘤引起。在大部分部位的肿瘤中早期肿瘤尤其结直肠癌根治 21 研究论文 术效果往往较好。所以早期诊断、早期治疗直接影响患者治疗的预后的生 存率及生活质量。 OPN是近年来发现的一种与恶性肿瘤的发展，转移有关的磷酸化蛋 白。1979年 Senger等第一次报道一种与恶性转化有关的一种包含 RGD(精 氨酸-甘氨酸-门冬氨酸)整合素结合区的磷酸化糖蛋白。后来 Franzen等从 骨组织中分离出一种磷酸蛋白,其特性与 Senger等发现的磷酸蛋白基本相 似因为它是一种细胞在骨基质中的产物，并能在细胞与基质中的矿质形成 一种桥连，人们将其命名为 OPN(骨桥蛋白)。OPN最早发现在骨基质和 牙齿中，后来一些学者在巨噬细胞、肾脏、被激活的 T细胞、内耳、蜕 膜、平滑肌、胎盘等不同的组织细胞中也发现了 OPN。近年来 OPN作为 一种新型的细胞因子,OPN由于在早期细胞免疫应答、肉芽肿炎症、组织 再生、肿瘤发生及转移等等中的起到作用而加倍引起学者关注。OPN是 一种与恶性转化有关的磷酸化蛋白,富含唾液酸,对应的基因位于染色体 4q13[3]，分子量为 41. 5kD。研究表明 OPN的过表达与肝癌、乳腺癌、胃 癌等肿瘤的恶性程度、转移、早期复发等有关，OPN阳性患者的预后较 阴性患者差[4、5]，前列腺癌伴骨转移患者血清中 OPN表达水平明显高于 无转移发生的患者。有实验发现将 OPN基因导入良性或低度恶性的肿瘤 细胞株中,发现细胞的侵袭性增加[6]。 OPN在多种肿瘤中表现出高表达。说明 OPN可能在肿瘤的发生发展 过程中起到了一定作用。有文献报道 OPN在抑制细胞凋亡[7、8、9] 、血管再 生[10]、细胞侵袭[11]、肿瘤转移[12]中都起到了重要的作用。此文献证明了 OPN在肿瘤的发生过程中起到了促进作用。其中细胞凋亡是指在正常的 生理或病理状态下，遵循自身的程序，自身结束其生命的过程生命的过程。 细胞凋亡作为细胞的一种保护性生理性消亡方式，对多细胞生物体的生存 和发展起着重要的作用，它在组织重建和抗感染、抗肿瘤以及老化等过程 中具有重要意义。通过细胞凋亡生物体清除机体内受损或突变细胞以保证 机体内环境的稳定以及在一定程度上防止肿瘤的发生。细胞凋亡的失控， 可能是肿瘤、神经退化性疾病以及免疫缺陷性疾病等多种疾病的病因，如 果没有细胞凋亡的失控变异细胞将会被及时清除肿瘤就不会发生。血管再 生是指从已存在的血管网络的内皮细胞分化而形成新的血管。血管再生包 括以下过程:血管内皮细胞的迁移和增殖、血管基底膜的降解、蛋白溶解 22 研究论文 酶的表达及其对细胞外基质的降解、新形成细胞外基质的重排和内皮细胞 ,13 , 血管壁的形成 。肿瘤的生长、转移依赖于血管再生所提供的氧和必要 的营养物质。如果没有血管再生，肿瘤生长一定程度到就停止生长进入休 ,14 , 眠期。而不会再用肿瘤的后期发展。 OPN含有特异的 Arg-Gly-Asp序列( RGD)，通过这个序列 与其生 长所需的微环境--细胞外基质相结合，从而在肿瘤的进展中发挥重要的作 用 ,15,目前已证实 OPN的过度表达与多种肿瘤转移有关。在肝癌、肺癌、 结肠癌、直肠癌、甲状腺乳头状癌、食管癌、乳腺癌、胆囊癌等肿瘤中伴 有转移者 OPN的表达水平明显高于没有转移者。在肝癌的研究中发现 [16]，OPN mRNA的过表达与肿瘤的分化、分级差及早期复发有密切关系, 并且可以作为判断预后的指标和预测早期复发的标志。Co ppola等[17]的研 究表明，在大肠癌、肾癌、膀胱癌中，OPN的表达与肿瘤临床分期显著 相关。各种研究明显表现出 OPN与肿瘤的发生发展有重要关系，但是其 在肿瘤发展过程中明确具体的机制尚不明确。 在本实验中，我们通过对正常结肠组织、结肠腺瘤组织、结肠腺癌组 织的 OPN免疫组织化学法染色发现，OPN主要表达于癌细胞胞质中，呈 强染色或中等染色，巢状或片状分布,部分腺腔上皮细胞和血管内皮细胞 亦呈中等染色，间质细胞中无或弱染色。OPN在 80例结肠腺癌组织中 58 例表达，阳性率 72.5%。在 30结肠腺瘤组织中 7例表达，阳性率 23.3%。 在正常结肠组织中 0例表达，阳性率 0.00%。通过本实验我们发现 OPN 在腺癌组表达明显高于另两个对照组。通过三者间两两比较经统计学证明 为了进一步研究OPN与结肠腺癌的关系，我们应用了统计学方法分析 OPN在结肠腺癌中表达对于结肠腺瘤与正常结肠组织中的 OPN表达有统 了OPN与结肠腺癌的临床病理之间的关系。结果表明OPN与结肠腺癌标本 计学意义(P<0.001)。 的年龄、性别无明显的相关性(P>0.05)。在结肠腺癌?+?期与?+?期 的比较中我们发现OPN的阳性表达率分别是56.6%和88.0%，两者之间存 在明显的差异(P<0.005)，体现出OPN表达在随着结肠腺癌的发展而升高。 同时OPN在有淋巴结转移的结肠腺癌中表达的阳性率是87.5%，而无淋巴 结转移的阳性率是62.5%(P<0.005)，说明OPN在结肠腺癌中的表达与淋 巴结转移成正相关。在结肠腺癌分期组与结肠腺癌有无淋巴转移组中都体 23 研究论文 现出OPN与肿瘤的转移有着密切关系。OPN与结肠肿瘤的关系已经得到了 一定程度的认知， Martinez等通过长期对小鼠肠腺瘤的相关研究发现， OPN的高表达往往是肠细胞肿瘤化的前兆事件，OPN可能是从促进肿瘤细 胞增长和抑制肿瘤细胞凋亡两方面促进肿瘤的发生及进展。为寻找 OPN 与结肠癌恶性程度的关系Wang等,18,通过RT-PCR、Western blot及免疫组 化方法对结肠癌细胞系及无瘤细胞系的对比研究发现，人类结肠癌细胞系 在转录及翻译时都有较高的OPN水平表达，OPN的高表达显著可能增加了 结肠癌的淋巴与血行转移性，与此同时往往肿瘤 TNM的分期较差，差异 具有显著的统计学意义。有研究显示 OPN至少可以调节两个细胞外基质 (extracellular matrix ECM)降解蛋白酶,19 ，当细胞侵袭ECM时，它可以 引起肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶从而降解细胞外基质，引起肿瘤细胞的 , 转移。有研究表明OPN作为前列腺癌的生长和发展的旁分泌和自分泌的调 节剂,重组OPN通过结合H因子能使前列腺癌的肿瘤细胞生存下来。肿瘤的 发生、发展是一系列过程，在结肠腺癌中OPN可能参与一个或多个环节和 因素的发生、发展，并且与结肠腺癌的淋巴结转移的相关。如果考虑结肠 病变镜检目测病变组织不确定而咬检标本有 OPN的表达的病变可考虑结 肠腺癌。并且OPN高表达往往证明结肠腺癌的临床分期较晚。因此 OPN 可以作为结肠腺癌早期检测及预后的肿瘤标记物。 二 CD44v6在结肠腺癌中的表达意 义。 CD44系列是发现较早的参与肿瘤发生、发展过程的蛋白。CD44是分 布极为广泛的细胞表面跨膜蛋白。同时属于免疫球蛋白超家族，其在细胞 外基质中与透明质酸结合，维持组织或器官的结构，促进细胞浸润和介导 细胞迁移[20] ,CD44v6作为其配体在这个过程中起到重要作用。CD44是一 种分布广泛的细胞表面粘附分子,根据基因外显子表达方式的不同,编码 两种不同类型的蛋白即标准型(CD44s )和变异(CD44v )，CD44s在生理状 态下在细胞及基质间的粘附，介导细胞的转移[21]。CD44v主要出现在病 理过程中。已有的研究表明CD44v具有促进肿瘤生长、转移的作用，可能 与以下几方面作用有关:(1)介导淋巴细胞与高内皮小静脉( HEV)结合， 使淋巴细胞归巢。(2)激活淋巴细胞并调节淋巴组织再循环?，介导内皮 细胞与淋巴细胞的黏附。(3)参与同周围细胞和细胞间质成分如组织液、 糖蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白、硫酸软骨素和透明质酸的 24 研究论文 黏附作用。(4)参与了细胞的迁移和增生过程，促进肿瘤转移。离体侵袭 和转移模型实验表明CD44表达影响肿瘤细胞迁移，MMP-2生成，侵袭， 肝素结合因子的产生和透明质酸降解[22]。CD44v6已被证实是一种与肿瘤 转移相关的蛋白[23]。近年来有研究表明CD44v6有可能是β-cat-TCF/LEF复 合体的靶向基因。广西医科大学韦敏怡、张增锋等用免疫组化 SP法检测 了81例鼻咽癌组织中 CD44v6蛋白产物表达，结果显示 CD44v6表达率为 72.8%。51例颈淋巴结转移阳性组CD44c6蛋白表达率(82.4%)高于30例 阴性组(56.7%)(P<0.05)。说明CD44v6在鼻咽癌淋巴结转移过程中起重 要作用，CD44v6的表达可作为临床预测淋巴结是否转移和估计预后的重 要指标[24]。 在本实验中，我们通过对正常结肠组织、结肠腺瘤组织、结肠腺癌组 织的 CD44v6免疫组织化学法染色发现。CD44v6主要在癌细胞胞膜上表 达，胞质内偶见棕黄色颗粒，间质中几乎无阳性细胞。CD44v6在 80例 结肠腺癌组织中 64例表达，阳性率 80.0%。在 30结肠腺瘤组织中 11例 表达，阳性率 25.6%。在正常结肠组织中 1例表达，阳性率 5.00%。通过 本实验我们发现 CD44v6在腺癌组表达明显高于另两个对照组。通过三者 为了进一步研究CD44v6与结肠腺癌的关系，我们应用了统计学方法 间两两对照经统计学证明 CD44v6在结肠腺癌中表达对于结肠腺瘤与正 分析了CD44v6与结肠腺癌的临床病理之间的关系。结果表明CD44v6与结 常结肠组织有统计学意义(P<0.001)。 肠腺癌标本的年龄、性别无明显的相关性(P>0.05)。在结肠腺癌?+?期 与?+?期的比较中我们发现CD44v6的阳性表达率分别是66.6%和 82.1%，两者之间存在明显的差异(P<0.005)，体现出CD44v6表达在随着 结肠腺癌的发展而升高。同时CD44v6在有淋巴结转移的结肠腺癌中表达 的阳性率是93.7%，而无淋巴结转移的阳性率是 70.8%(P<0.005)，说明 CD44v6在结肠腺癌中的表达与淋巴结转移成正相关。在结肠腺癌分期组 与结肠腺癌有无淋巴转移组中都体现出CD44v6与肿瘤的转移有着密切关 系。近年来研究发现CD44v6的异常表达与许多人类恶性肿瘤的发生、发 展和侵袭转移及预后密切相关[25]。CD44受体则因胞外区有10个剪接有差 别的外显子而有多种亚型。带有可变的外显子 6- 15的受体分子记为 CD44v6-15.Standard CD44 ( CD44s)不会导致肿瘤转移 ,而其可变亚 25 型 , 研究论文 特别是CD44v6被认为是在淋巴瘤、肝癌、胆囊癌、乳癌、肺癌、胰腺癌、 结直肠癌和胃癌中存在转移的蛋白标记[26]。CD44v6的表达与淋巴转移有 关,淋巴转移阳性者 CD44v6表达率明显高于无淋巴转移者 ,随着肿瘤分 期的发展，CD44v6表达率增加，反映了CD44v6是一种标记肿瘤进展尤其 是后期浸润与转移的分子标记物，可能在肿瘤的预后估计和治疗指导中有 较好的应用价值。CD44v6可能是通过促进癌细胞的血管内皮细胞(VEC) 与细胞外基质的粘附，从而促进了肿瘤向基质的浸润，改变肿瘤细胞骨架 蛋白的聚集和分布，从而影响肿瘤细胞的迁徙运动能力，最终导致肿瘤转 移的形成。血管内皮细胞是一种的专有的上皮细胞，由一层扁平细胞所组 成。血管内皮细胞是形成血管内壁的主要成分，是血管管腔内血液及其他 血管壁(单层鳞状上皮)的接口。内皮细胞是沿着整个循环系统，由心脏 直至最小的微血管。肿瘤细胞可通过VEC行远处的血道转移，而CD44v6 的生长、浸润和转移有关[27-29] 通过影响VEC而影响肿瘤的远处转移。已有大量研究表明。在许多肿瘤如大肠癌、乳腺癌、胃癌等均CD44v6与肿瘤 发现有过度表达[30-32]。有文献报道CD44v6更易在晚期的NSCLC中表达， 说明在晚期肿瘤中CD44v6更加活跃[33-35]。本实验结果与关于CD44v6和肿 瘤关系研究实验及已发表文献的大部分结果相符合。因此本实验认为 CD44v6参与了结肠腺癌的发生、发展、恶变及转移过程。 3、 OPN及CD44v6在结肠腺癌中的表达相关性及意义 已有的研究发现OPN可能是通过诱导CD44v6的表达而导致肿瘤侵 袭、转移。OPN通过包含的RGD序列与整合素avβ3、CD44v6受体相互作 用，从而作用于肿瘤发生、发展。有研究推测双变量相关性分析显示,OPN 和CD44v6的表达有显著相关性,表明两者在肿瘤的侵袭转移中起协同作 用。郜玉峰等 [36]关于OPN和CD44v6在肝癌中表达及意义的研究认为,OPN 和CD44v6的表达有相关性,OPN表达增加可使得CD44v6表达上调。某些 学者推测其机制是肿瘤细胞分泌的OPN与其受体CD44v6结合,使肿瘤细 胞发生趋化黏附和浸润及肿瘤的转移,同时它能避免肿瘤细胞宿主免疫系 统的识别和杀伤作用,从而导致肿瘤的进展和转移,但其确切的发生机制 还有待于进一步研究。肿瘤生长方式特有的是演进和异质化。当恶性肿瘤 在生长过程中变侵袭性越来越强的现象称为肿瘤的演进，其中包括有肿瘤 生长加快、浸润侵袭周围组织和远处转移等等步骤。这些生物学现象的出 26 研究论文 现与肿瘤的异质化有关。肿瘤的异质化是指一个克隆来源的肿瘤细胞在生 长过程中形成在它的对机体凋亡的对抗、侵袭能力、生长速度、对激素的 反应、对药物的敏感性等方面有所不同的亚克隆的过程。由于这些不同， 肿瘤在生长过程中得以保留了那些适应存活、生长、浸润与转移的亚克隆 从而使肿瘤越来越难以控制。肿瘤生长过程中重要的一步是凋亡细胞的失 控。其中有一条途径为肿瘤免疫逃逸(Tumor escape)。肿瘤免疫逃逸: 是指肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统监控、识别和攻击避免正常 凋亡，从而使肿瘤细胞得到在机体内生存和增殖的现象。机体免疫系统具 有免疫监视功能，当体内出现癌变的细胞时，机体本身免疫系统能够识别 非正常肿瘤细胞并通过免疫机制清除这些“非正常”细胞，从而抵御肿瘤 的发生发展。然而，癌变的细胞在一些情况下可通过多种机制逃避机体的 免疫监视，在体内快速增殖，形成肿瘤。也就是说:一方面，机体可通自 身和获得性免疫抵抗肿瘤的发生;另一方面，肿瘤细胞可通过多种机制逃 避机体免疫的识别和攻击;肿瘤的发生、发展及转归结果取决于这两方面 的总体作用，当肿瘤细胞逃避了自身免疫系统的识别攻击肿瘤即发生了。 从以上分析我们看以得出OPN与CD44v6在结肠腺癌的发生、发展的过程 中在多个环节中起到了重要作用。而癌变的细胞可能同时也促进OPN与 CD44v6的分泌。两者关系可能是相互促进共同发展。肿瘤发生和转移中 基质来源的肿瘤,通常与OPN表达增强有关。OPN是通过刺激细胞信号转导 促进肿瘤恶性发展并且加强了肿瘤转移性细胞的生存。细胞信号转导是指 细胞外因子通过与受体的结合，而引起细胞内环境的生物化学反应及蛋白 间相互作用，直到细胞生理反应所需基因开始表达和各种生物学效应完成 的过程。现在研究表明，细胞内有多种信号转导途径和方式，各种方式和 途径间又有多层次多种类的相互交叉及调控，是一个十分复杂宏大的网络 生理系统。细胞凋亡是一个主动的依赖细胞信号转导的过程，可由多种 因素诱导，诱导因素多数可通过激活死亡受体而引发细胞凋亡的生理机 制。死亡受体是存在于细胞表面的肿瘤坏死因子。它们与对应的配体或抗 体结合后活化发生生理作用，其胞浆区便可以与信号转导蛋白结合，其中 一种就是与含有死亡结构域的胞浆蛋白结合。使细胞膜表面的死亡信号传 递到细胞内引发凋忘。OPN通过对细胞信号转导而促进结肠腺癌的生长。 以上论述可表明OPN-CD44v6轴在结肠腺癌的转移中起一定的作用,这 27 研究论文 [37-39] 一作用在甲状腺乳头状癌、结肠癌、肝癌转移中已有报道 。有研究表 明虽然尚不能认为OPN、CD44v6是鼻咽癌患者独立的预后指标,但至少 可以认为两者阳性表达与鼻咽癌预后不良相关,这有利于我们临床上综 合判断鼻咽癌患者的预后[40-42]。Tahara[43]在他的研究中认为OPN和 CD44v6的共表达跟淋巴管侵袭或淋巴远距离转移在侵袭型胃癌显著相 关,OPN和CD44v9在肿瘤中共同的相互作用与淋巴转移有关。本研究与其 他部位肿瘤的研究都证明了OPN-CD44v6轴在肿瘤发展中的协同作用，在 转移中的促进作用。CD44的研究时间较长、较深入亦较广泛。已知其为 分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，主要参与异质性粘附，即肿瘤细胞 与宿主细胞和宿主基质的粘附，异质性粘附在肿瘤细胞侵袭转移中起促进 作用。本研究通过统计学相关性检测证明在结肠腺癌中OPN和CD44v6成 正相关。CD44v6在结肠腺癌表达中随着OPN的升高而升高(P<0.05 r=0.252)。从而可能可以证明OPN通过上调CD44v6的表达来促进肿瘤的 转移。两者在结肠腺癌中的高表达与标本的性别、年龄无关，而与标本的 淋巴结的转移相关。与已有的研究结果大致相符，虽然OPN与CD44v6在 肿瘤发生、发展过程中具体作用方式尚未特别明确，但两者在肿瘤中的作 用基本明确。因此两侧联合检测有可能更加有利于结肠腺癌的诊断，对临 床的早期诊断、早期治疗更有帮助。 结 论 1、结肠腺癌中 OPN和 CD44v6的表达高于结肠腺瘤组和正常结 肠组 织，说明 OPN和 CD44v6参与结肠腺癌的发生、发展。 2、 OPN和 CD44v6与结肠腺癌的患者的年龄、性别无关而 与淋巴转 移有关。提示 OPN和 CD44v6高表达与肿瘤分期相关。 3、OPN和 CD44v6在结肠腺癌中表达成正相关，说明 OPN和 CD44v6 共同参与了结肠腺癌的发生、发展。两者表达的联合检测有可能成为 结肠腺癌诊断的敏感指标。 参考文献 28 研究论文 ,1,Moertel CG, Fleming TR, Macdonald JS, et al. 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CD44等的细胞受体结合，可激活与肿瘤进程相关 33 综 述 的信号通路，从而对肿瘤进程产生影响,已有大量研究发现 OPN在人类多 种恶性肿瘤中高表达，如肺癌、乳腺癌、食道癌、子宫内膜癌、胃癌、恶 性胸膜间皮瘤等, 2,。一些研究已经发现抑制 OPN的表达能够减缓肿瘤的 生长、迁移及侵犯速度, 2,。OPN与结肠肿瘤:OPN与结肠癌的关系已经 得到了一定程度的认识，Martinez等,3, 通过常年对小鼠肠腺瘤的相关研 究发现，OPN的失常高表达往往是肠细胞肿瘤化的先兆事件，OPN从促 进肿瘤细胞增长及抑制肿瘤细胞凋亡两方面促进肿瘤的生长及进展。OPN 与结肠癌恶性程度:Wang等,2,通过 RT-PCR Westenr blot及免疫组化方法 对结肠癌细胞系及无瘤细胞系的对比研究发现，人类结肠癌细胞系在转录 及翻译水平都有较高的 OPN表达水平，OPN的高表达显著增加了结肠癌 的淋巴与血行转移率，同时肿瘤,,,的分期较差，差异具有显著的统 计学意义。有统计表明 OPN mRNA高表达患者的无病生存时间及总体生 存时间也明显低于 OPN mRNA低表达患者。 1.2 OPN在结肠腺癌中的研究 Yeatman等,4, 在综合研究新的有关肿瘤和肿瘤发展的标志物时，通 过基因表达图谱技术筛选大约12000个基因，最终确定OPN为临床上结肠 癌首选的生物学标记。Agrawal等,5,使用混合样本的基因表达图谱研究结 肠癌相关的众多肿瘤标志物时发现OPN的表达与结肠癌的进展关系密切， 并且在肿瘤发展不同时期的表达有明显差异。Irby等,6, 在体外研究中发现， 内源性和外源性的OPN都可以增强结肠腺癌细胞的运动性和侵袭能力，并 且可以降低细胞间的黏附，从而促进肿瘤的生长及转移。四种不同的结肠 癌细胞株经稳定转染OPN后可明显提高在体内的致瘤性，这种作用是通过 提高肿瘤细胞增殖能力和微血管密度来实现的，而这两者与转染后 OPN 的表达呈正相关。OPN在原发结肠癌中的表达高达正常结肠组织的15倍， 。丁凌等通过研究也 而在肝脏中的结肠转移癌则为正常组织的27倍,7, ,8, 发现，OPN定位于结肠癌细胞、肝转移细胞及转移灶旁的肝细胞质中，而 在无结肠癌的正常结肠组织及肝细胞中无表达或低表达。通过对人类肝 癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞及其周围基质中OPN表达的研究表明， 高水平OPN蛋白的表达与肿瘤的恶性程度和侵袭有相关性,9-11, 。还有很 多研究表明OPN与结肠腺癌的发生、发展有密切的关系，并与结肠癌的发 生发展成正相关。 34 综 述 2.1 CD44v6研究现状 CD44v6是人类CD44基因位于11号染色体短臂，全长约50kb，共由20 个高度保守的外显子组成，每个外显子的长度为70-210bp不等，中间由长 短不一的内含子分隔。CD44基因的20个外显子按照DNA转录方式不同可分 为组成型外显子(C)和变异型拼接外显子(V)两大类。其中CD44v6是 黏附分子家族的重要成员,它是细胞表面的一种跨膜糖蛋白,CD44v6有 可能是通过促进癌细胞影响血管内皮细胞与细胞外基质的黏附,促进肿瘤 向基质的浸润,影响肿瘤细胞骨架蛋白的聚集和分布 ,从而影响肿瘤细 胞的迁徙运动能力。CD44v6是黏附分子家族的重要成员,是细胞表面 [12] 的一种跨膜糖蛋白,CD44v通过V区外显子选择剪接产生多种不同的变异 体,与许多恶性肿瘤的浸润和转移密相关其中 CD44v6可能通过促进癌 肿瘤细胞骨架蛋白的聚集和分布细胞与血管内皮细胞与细胞外基质的黏附,从而影响肿瘤细胞的迁徙运动能力。 ,促进肿瘤向基质的浸润 ,影响 [13] CD44v6的表达大部分出现在肿瘤发展的后期,其表达与结肠癌的浸润与 转移有关;也有学者发现其表达与结肠癌的临床分期、组织学类型和预后 无关。我们的研究表明,CD44v6在结肠癌组织中特异性地表达,而在正常 组织和癌旁组织中无表达。CD44v6的表达与淋巴转移有关,淋巴转移阳性 者CD44v6表达率明显高于无淋巴转移者,随着病期的发展,CD44v6表达 率增加,反映了CD44v6是一种标记肿瘤进展尤其是后期浸润与转移的分 子标记,可能在肿瘤的预后估计和治疗指导中有较好的应用价值。 CD44v6可能通过促进癌细胞与血管内皮细胞与细胞外基质的粘附 ,促进 肿瘤向基质的浸润,影响肿瘤细胞骨架蛋白的聚集和分布 ,从而影响肿 瘤细胞的迁徙运动能力,最终导致转移瘤的形成。 2.2 CD44v6与结肠腺癌的关系 CD44v6有可能是通过促进癌细胞与血管内皮细胞与细胞外基质的黏 附,从而促进肿瘤向基质的浸润 ,影响肿瘤细胞骨架蛋白的聚集和分布 , [12] 而影响肿瘤细胞的迁徙运动能力 。CD44可与透明质酸结合，也被视为 透明质酸的受体，可与透明质酸、纤粘连蛋白及胶原结合，介导细胞与细 胞外基质之间的黏附，参与细胞对透明质酸的摄取及降解，并能与细胞骨 架蛋白结合，参与细胞伪足形成，促进细胞迁移 ,14-15,CD44v6在这个过程 中起到了重要作用。而OPN与CD44的结合目前被认为可促进免疫细胞的 35 综 述 归巢，同时促进肿瘤细胞转移进入各种其他组织。在此，OPN及CD44已 与肿瘤转移的功能互相关联起来 ,16,。Wielenga[17]对不同时期结肠癌肿瘤 细胞CD44表达类型进行分类研究后发现,在结肠癌早期不含V6的CD44 蛋白表达增加,而在肿瘤的进展期,CD44v6蛋白表达增加,并在肿瘤的 早期转移中起重要作用国内外有许多文献报道CD44v6与结肠腺癌的关系， 都证明CD44v6与结肠腺癌的发展过程密切。恶性肿瘤细胞的—个基本生 物学特征就是可以脱离原发生长部位，侵袭到周围组织进而形成转移。 CD44作为细胞表面跨膜黏附蛋白在这一恶性转变过程中起着重要的作用 ,18,。研究发现结肠癌CD44v8-v10表达明显高于癌旁组织，在结肠癌肝转 移患者中,CD44v8-v10的表达明显高于无肝转移者,肝转移灶中 CD44v8-v10的表达明显高于原发灶,说明CD44v8-v10在结肠癌肝转移中 可能发挥重要作用.CD44v6的分析和检测有助于根据病理标本预测分化 [ 20] 转移潜能,是反映预后的良好指标,19,。Yanagiwwa等 对83例胆囊 癌标本进行抗 CD44抗体的免疫染色证明 CD44v6蛋白表达与组织学分 级有密切的关系。CD44可与透明质酸结合，也被视为透明质酸的受体， 可与透明质酸、纤粘连蛋白及胶原结合，介导细胞与细胞外基质之间的黏 附，参与细胞对透明质酸的摄取及降解，并能与细胞骨架蛋白结合，参与 细胞伪足形成，促进细胞迁移 ,21-22,。Qu等,23,通过免疫组化和RT,PCR 方法研究上皮性卵巢癌中CD44的表达情况，结果发现CD44v6在良性肿 瘤和卵巢癌中的表达有统计学差异，CD44v6的高表达成为恶性肿瘤的一 个特性。众多研究都表明CD44v6在肿瘤的发生、发展中起到了作用作用。 3、实验方法 免疫组化方法 4、研究展望 结肠癌是人类肿瘤的高发肿瘤，全球结直肠癌以每年2%的速度增长， 其中我国每年的增长率 4.2%。我国的每年的发病率已居世界第一。结肠 腺癌是结肠癌中最常见病理恶性肿瘤之一。早期做出正确的诊断对疾病的 治疗与预后有重要的临床意义。 CD44v6受体通过与OPN配体结合，激 活OPN介导的信号传导通路，从而介导肿瘤细胞的侵袭转移，在肿瘤细胞 ,24, 。前已在结肠癌、宫颈癌、胆囊癌、鼻 的发生、发展中起重要作用 咽癌等等各种肿瘤组织细胞中发现OPN和CD44v6的表达量与肿瘤的进 36 综 述 展程度和预后密切相关 ,25,。OPN与CD44v6以往的研究中已证明与结肠腺 癌的发生发展及转移有密切关系。并且很多文献也说明了OPN与CD44v6 在肿瘤中相互作用相互联系。通过本研究希望可以通过对OPN-CD44v6联 合检测对临床结肠腺癌的早起诊断、治疗提供帮助。为患者减轻病魔的折 磨。 参考文献 ,1,Kurisetty V,Johnston P，Rudland P，et al.Identification of genes differentially expressed between benign and osteopontin transformed rat mammary epithelial cells,J,(BMC Res Notes，2009，2(1) : 15. ,2,Wang LK,Wang H,Zhang SW,Clinical significance of the upregulated osteopontin mRNA expression in human colorectal cancer[ J] .Gastrointest surg ,2010,14(1):74-81. ,3,Martinez.C,Churchman M,Freeman.T.et al.Osteopontin provides early proliferative drive and May be dependent upon aberrant c-myc.Signalling in murine instestinal tumours.Exp Mol Pathol,2010.88.(2):272-277. ,4,Yeatman TJ，chanmbers AF.Osteopontin and colon cancer progression 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