茯苓多糖口服液产品资料

茯苓多糖口服液产品资料 茯苓多糖口服液药效学试验资料 茯苓是一种传统中药～又是名贵食用真菌。茯苓中含有丰富的 β-茯苓聚糖～羧甲基茯苓多糖为β-茯苓聚糖改造后的衍生物～我们将其制成茯苓多糖口服液,简称CMP口服液,～对其进行了如下实验研究。 (一) 对免疫功能的影响 1、 茯苓多糖口服液对免疫器官重量的影响 2、 茯苓多糖口服液对抗体溶血素的影响 3、 茯苓多糖口服液对巨噬细胞吞噬功能的影响 4、 茯苓多糖口服液对天然杀伤细胞,NK细胞,活性的影响 5、 茯苓多糖口服液对肿瘤坏死因子含量的影响 6、 茯苓多糖口服液对白细胞介素-2(IL-2)活性的影响 (二) 茯苓多糖口服液对肿瘤作用的实验研究 1、 对小鼠肉瘤,S,的抗癌作用 180180 2、 对小鼠爱氏腹水瘤,EAC,的抗癌作用 实验 (一) 药物: 茯苓多糖口服液由本院中药所资源室提供～批号930904 80mg/10ml/支～药液浓缩至9.6mg/ml,给药量为120mg～240mg/?～相当于临床用量的5、10 倍。 1 (二) 动物: 昆明种小鼠～18,22g～雌雄各半～由湖南省卫生防疫站动物实验中心提供。 昆明种小鼠～18,19g～雌雄兼用～由同济医科大学医学动物中心提供。 NIH纯种小鼠～20?0.5g～雌雄兼用～同济医科大学医学动物中心提供。 (三) 瘤株: 爱氏腹水瘤,EAC,ESC,,S180由同济医科大学肿瘤研究室提供。 (四) 试剂: 环磷酰胺:由上海十二制药厂生产,批号901202,使用当天用生理盐水配成所需浓度75mg/kg～ 5-Fu:天津和平制药厂生产,批号921004,。 豚鼠血清:由湖南生物药厂动物中心提供。 SDS:,十二烷基硫化钠,SICMA产品。 实验方法与结果 (一) 对免疫功能的影响 1、 对免疫器官重量的影响: 将18-22g小鼠,雌雄兼用,随机分为四组～每组12只动物。生理盐水组和生理盐水加环磷酰胺组～CMP口服液组分别按120mg,240mg/kg灌胃给药～各组灌胃均为等效量体积～除生理盐水组外～所有动物于第7天鸡血红细胞致敏～致敏前后各皮下注射环磷酰胺1次～连续给药10天～次日放血～处死动物～称取胸腺、脾脏重量。结果表明～240mg/kg组与环磷酰胺组比较胸腺、脾脏重量明显增加～经统计学处理～有非常显著性差异。,结果见表I, 2 , 表?:茯苓多糖口服液对小鼠免疫器官重量的影响( ?SD) X 脏器系数,mg/10g, 剂量 动物数 体重 组别 ,g/kg, ,n, ,g, 胸腺 脾脏 生理盐水 25ml 12 25.5?3.98 74.01?18.69 106.43?23.45 ??????生理盐水+Cy 25ml 12 24.63?2.35 28.49?8.81 64.58?27.93 ??????GMP口服液+Cy 120 12 25.89?3.93 29.30?7.07 57.34?21.13 ※※※※※CMP口服液+Cy 240 12 23.34?3.37 42.91?8.09 103.45?28.98 注:与生理盐水组比“???”P<0.001 与生理盐水+Cy组比“※※”P<0.01,“※※※”P<0.001 2、 对抗体溶血素产生的影响 分组及给药方法与实验1相同。血清抗鸡红细胞溶血素抗体含量测定按《中药药理实验方法学》“血清溶血素测定方法”进行。稀释血清加鸡红细胞悬液及稀释豚鼠血清～温育,:分钟后离心～比色测定光密度。以光密度读数作为判定血清溶血素的指标～比较各组的差异。结果表明～茯苓多糖口服液240mg/kg组光密度值明显升高～与NS+Cy组比～P<0.01有非常显著性差异。120mg/kg组与NS+Cy组比光密度略有升高～但无统计学差异。,见表?, — 表?:茯苓多糖口服液对抗体溶血素产生的影响( ?SD) X 剂量 动物数 组别 OD值 mg/kg n 生理盐水 25ml 12 0.260?0.09 ???NS+Cy 25ml 12 0.130?0.02 ???CMP口服液+Cy 120 12 0.140?0.006 ※※???CMP口服液+Cy 240 12 0.157?0.02 注:与生理盐水组比:“???” P<0.001 与NS+Cy组比:“※※※” P<0.01 3、 对腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响: 分组及给药方法同前～实验前4天腹腔注射0.5%淀粉生理盐水溶液～每 3 鼠0.5ml～实验时按《药理实验方法学》中小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验方法进行。实验时每鼠腹腔注射2%鸡RBC悬液1ml～30分钟后～处死动物～剪开腹部皮肤～经腹膜注入NS 2ml～轻揉鼠腹部1分钟～取腹腔液制片～4%,V/V,Giemsa磷酸缓冲液染色计数。 — 表?:茯苓多糖口服液对巨噬细胞吞噬功能的影响( +SD) X 剂量 动物数 组别 吞噬百分率 吞噬指数 mg/kg n 生理盐水 25ml 12 67.75?8.72 1.93?0.52 ??????NS+Cy 25ml 12 40.08?11.22 0.81?0.31 ??????CMP口服液+Cy 120 12 50.42?10.09 1.01?0.21 ※ ?※※※CMP口服液+Cy 240 12 57.67?11.63 1.51?0.52 ※※ 注:与生理盐水组比:“???”P〈0.001 “?”P〈0.05 与NS+Cy组比:“※”P〈0.05 “※※”P〈0.01 “※※※”P〈0.001 4、 对NK细胞活性的影响 ? 对正常动物NK细胞活性的影响 选用20-22g昆明种小鼠～随机分为三组～生理盐水组～药物茯苓多糖口服液组120、240ml/kg组给药～各组均为等容量溶液灌胃给药～连续给药12天～末次给药的次日处死动物测定NK细胞的活性。 NK细胞活性采用“3H释放法”。颈椎脱臼处死小鼠～无菌条件下制备脾细胞悬液～将细胞调至所需浓度～即为效应细胞,E,悬液。取原制备的靶细胞,T,悬液～E悬液各0.1ml加入96孔u型培养板中～E/T比取100:1～每个样品设三个平行孔。用培养基代替效应细胞作为自然释放～用SDS代替效应细胞作为最大释放。培养板臵CO温箱孵育18hr后～从各孔吸取0.1ml2 上清液臵小塑管中～r计数器测CPM值。 4 结果表明～给药高、低剂量组的NK细胞活性均高于对照组～但无统计学差异。,见表?, , 表?:茯苓多糖口服液对正常小鼠NK细胞活性的影响( ?SD) X 剂量 动物数 NK细胞活性 组别 mg/kg n ,%, 生理盐水 25ml 11 55.67?19.13 CMP口服液 120 11 65.24?9.63 CMP口服液 240 12 67.02?7.92 ? 对荷瘤动物NK活性的影响 取20?0.5gNIH纯种小鼠40只～雌雄兼用。在每鼠右腋皮下接种EAC 6瘤细胞2×10个细胞。接种后第二天～随机分为4组～每组10只动物～第1组为正常对照组～每只动物每日灌服0.6ml蒸馏水作阴性对照～第2组为5-Fu组～每日灌服15mg/kg作阳性对照～第3、4组为茯苓多糖口服液组～每日灌服剂量依次为100 200mg/kg。给药8日后处死动物～在处死前2日～每日动物腹腔注射6%淀粉肉汤1ml～连续2天～处死动物后应用LDH释放法测定NK细胞活性。无菌取出小鼠脾脏～常规制备脾细胞悬液～最后用完全营养 7液调整细胞浓度至1×10/ml。设NK试验孔、自然释放孔及最大释放孔。用1%的NP-40破坏靶细胞作为最大释放孔。按下表加样于40孔培养板～每个标本设3个复孔。 YAC-1细胞 效应细胞 完全营养液 1%NP-40 NK试验孔 100ul 100ul 自然释放孔 100ul 100ul 100ul 最大释放孔 100ul 其中YAC-1细胞传代培养24,48hr～使用前经洗涤后的完全营养液配 5 6成1×10/ml～效靶=100:1～效靶混合后～臵37? 5%CO孵箱中培养16hr～2 然后各孔吸取上清液100ul臵96孔培养板中～于37?预温～随后每孔加入100ul LDH底物混合液～放室温作用15分钟～加终止反应液后在490nm波长处用酶标检测仪检测各孔的OD值。各孔NK活性值计算如下: 试验孔OD值-自然释入孔OD值 NK活性%=————————————————×,::, 最大释放孔OD值-自然释放孔后 实验结果表明～服用茯苓多糖口服液剂量100,200mg/kg后～能明显增强荷瘤小鼠NK细胞活性。,见表?, — 表V:茯苓多糖口服液对荷瘤小鼠NK活性的影响( ?SD) X 剂量 动物数 NK细胞活性 组别 t值 P值 mg/kg n (%) 阴性对照组 10 12.01?1.93 5-Fu组 15 10 16.01?2.58 3.88 <0.01 CMP口服液 100 10 14.82?1.88 3.27 <0.01 CMP口服液 200 10 15.56+3.44 2.82 <0.05 5、 对荷瘤动物肿瘤坏死因子含量的影响: 荷瘤、分组及给药方法与对荷瘤动物NK细胞活性的影响相同。应用酶联免疫吸附,ELISA,法检测腹腔M中产生的TNF的含量。 ψ ? 小鼠腹腔M中的肿瘤坏死因子,TNF,的诱生 ψ a) 小鼠处死前2日～每天腹腔注射6%淀粉肉汤1ml/每只鼠～连续2天。 b) 处死小鼠～取腹腔中的M～洗涤2次～用完全营养液调整细胞浓度ψ 6至2×10/ml。 c) 取上述细胞悬液1ml～加入24孔细胞培养板中～贴壁2小时后用RPMI1640洗涤2次～加入终浓度为10ug/ml的LPS～培养16hr后～收集上清液。-20?冻存备用。 6 ? TNF含量的测定 a) 包板:将抗TNF单抗T和E,浓度均为1mg/ml,分别取5ul加入δ6 1240ul包被缓冲液中～稀释后二种抗体等量混合加入酶标板～每孔50ul～臵4?过液。 b) 封闭:包被好的板经洗涤后～加入封闭液,缓冲液,每孔100ul～37?放臵30分钟。 c) 封闭好的板洗涤后～加入按一定比例稀释,8个梯度,的TNF品和待检上清液～每孔50ul～臵室温1hr。 d) 加一抗:反应后的板经洗涤后～加入1:100稀释的兔抗TNF抗体～每孔50ul室温反应1小时。 e) 加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体: 上述反应的板经洗涤后加入1:100稀释的酶标记抗体～每孔50ul～室温反应40-60分钟～洗涤。 f) 加底物OPD显色:待等比释孔颜色梯度明显时～用2NHSO4终2止反应～在酶联检测仪各孔OD值。已知标准TNF含量与其相应孔OD值呈线性关系。根据所得OD值～经过相关分析～可得各待检孔的相应TNF的含量。 结果表明～茯苓多糖口服液能使TNF含量增高。当剂量在200mg/kg时～荷瘤小鼠中的TNF含量与对照组相比明显增高～经统计学处理P<0.05。,见表?, , 表?:茯苓多糖口服液对荷瘤小鼠TNF含量的影响( ?SD) X 剂量 动物数 TNF含量 组别 t值 P值 5mg/kg n ,×10ug/ml, 阴性对照组 — 10 8.05?1.46 5-Fu组 15 10 12.28?4.03 3.11 <0.05 CMP口服液 100 10 8.50?2.53 0.48 >0.05 CMP口服液 200 10 9.69?1.42 2.52 <0.05 7 6、 对正常动物白细胞介素-2(IL-2)活性的影响 选用20-22g小鼠～随机分为三组～对照组每天灌胃等容量生理盐水～两个给药组分别按120mg/kg,240mg/kg灌胃羧甲基茯苓多糖口服液～连续给药12天后～处死动物～无菌摘取脾脏～进行IL-2依赖细胞株,CTLL,培2养～CTLL细胞在培养基中于24孔板中传代。然后再96孔板中稀释标本～2 稀释度为1:2、1:4、1:6、1:32、1:64～体积0.1ml～每一稀释度2-3个复孔～将CTLL细胞从24孔板中吸入离心管中～加RPMI-1640～200×10分钟重复3次洗涤细胞～用含10%小牛血清RPMI-1640调整细胞浓度为 51×10/ml～将调整好浓度的CTLL细胞加入到已稀释标本的96孔板中～每 8空0.1ml～轻轻混匀～放到5% CO37?培养箱中培养17hr～加入H-Tdr 2 0.5uci/孔～继续培养6hr～用多头细胞收集器收获细胞～加入闪烁液～于Beckmen液闪仪上测cpm。以不同稀释度IL-2标本cpm值作直线回归～即用,=a+b×公式计算IL-2活性单位～用t检验进行组间比较。 实验结果表明～茯苓多糖口服液能明显提高IL-2的活性～与对照组相比～有非常显著性差异。,见表?) , 表?:茯苓多糖口服液对小鼠IL-2活性的影响( ?SD) X 剂量 动物数 IL-2 组别 mg/kg n ,刺激指数, 生理盐水 25ml 11 23.74?8.58 ※※※茯苓多糖口服液 120 11 44.03?8.26 ※※茯苓多糖口服液 240 12 36.96?10.65 注:与对照组相比:“※※”P<0.01,“※※※”P<0.001 (二) 抗肿瘤的实验研究 1、 对大鼠肉瘤S的作用 180 8 6 取S菌株～以生理盐水稀释至0.2ml中含5×10细胞数。接种到每只180 大鼠右前肢腋下～然后随机分为5组～每组10只动物。第1组为阴性对照组～每天灌胃等容量NS～第2组为5-Fu阳性对照组按20mg/kg灌胃5-Fu药液,第3、4、5组为茯苓多糖口服组～分别按100、200、300mg/kg灌胃药液在接种后24hr给药～每天一次～按常规求出肿瘤抑制率。 当抑制率>30%,P<0.05～动物死亡数<20%～动物体重下降率<15%时认为有效～结果见表?。 表?:茯苓多糖口服液对S瘤株的作用 180 剂量 给药途径 动物数,只, 体重变化率瘤重,g, 抑制率 - 组别 mg/kg ×疗程,天, 始/末 ,%, , ?SD, ,%, X 生理盐水组 25ml P0×8 10/10 44.5 1.34?0.32 ※※5-FU组 20 P0×8 10/10 35.35 0.54?0.43 59.70 ※※茯苓多糖口服液 100 P0×8 10/10 54.54 0.48?0.34 64.17 ※茯苓多糖口服液 200 P0×8 10/10 45.58 0.70?0.36 47.76 ※※茯苓多糖口服液 300 P0×8 10/10 35.54 0.51?0.53 61.94 注:与对照组相比:“※”P<0.05，“※※”P<0.01 第一次重复试验～分组～剂量～给药时间均与上同～结果见表? 表?:茯苓多糖口服液对S瘤株的作用 180 剂量 给药途径 动物数,只, 体重变化率瘤重,g, 抑制率 - 组别 mg/kg ×疗程,天, 始/末 ,%, , ?SD, ,%, X 生理盐水组 25ml P0×8 10/10 32.5 1.30?0.22 ※5-FU组 20 P0×8 10/10 21.98 0.67?0.14 48.26 ※※茯苓多糖口服液 100 P0×8 10/10 14.86 0.54?0.12 58.61 ※茯苓多糖口服液 200 P0×8 10/10 37.41 0.78?0.14 40.07 ※茯苓多糖口服液 300 P0×8 10/10 29.49 0.74?0.16 43.08 注:与对照组相比:“※”P<0.05，“※※”P<0.01 第二次重复试验～分组～给药时间均与上同。给药组灌胃茯苓多糖口服液分别为150、300mg/kg。阴性对照组～5-Fu阳性对照组给药同前。结果见表?。 9 表?:茯苓多糖口服液对S瘤株的作用 180 剂量 给药途径 动物数,只, 体重变化率瘤重,g, 抑制率 - 组别 mg/kg ×疗程,天, 始/末 ,%, , ?SD, ,%, X 生理盐水组 25ml P0×8 10/10 31.94 1.59?0.63 ※※5-FU组 20 P0×8 10/10 -1.0 0.375?0.21 76.4 茯苓多糖口服液 150 P0×8 10/10 31.22 1.17?0.47 26.7 茯苓多糖口服液 300 P0×8 10/10 39.3 1.15?0.20 28.0 注:“※※”P<0.01，与对照组相比 以上实验表明:口服茯苓多糖口服液100,300mg/kg 8天～对小鼠肉瘤S的抑制率分别为64.17%,40.07%～经统计学处理均有显著的抗癌作用。 180 2、 对EAC腹水型瘤株的作用。 荷瘤分组～给药时间均与对S瘤株的作用相同。给药组分别按150mg、180 300mg/kg灌胃茯苓多糖口服液～阴性对照组给等体积生理盐水～5-Fu阳性对照组按20mg/kg灌胃5-Fu药液。结果见表?。 表?:茯苓多糖口服液对EAC瘤株的作用 剂量 给药途径 动物数,只, 体重变化率瘤重,g, 抑制率 - 组别 mg/kg ×疗程,天, 始/末 ,%, , ?SD, ,%, X 生理盐水组 25ml P0×8 10/10 19.15 1.06?0.16 ※※5-FU组 20 P0×8 10/10 0 0.45?0.16 57.45 ※茯苓多糖口服液 150 P0×8 10/10 15.5 0.43?0.18 59.81 ※茯苓多糖口服液 300 P0×8 10/10 15.63 0.54?0.21 49.06 注:与对照组相比:“※”P<0.05 “※※”P<0.01 重复一次试验～分组～给药时间均与上同。给药组分别按300mg/kg,600mg/kg灌胃口服液～阴性对照组及5-Fu阳性对照组给药同前。结果见表? 10 表?:茯苓多糖口服液对EAC瘤株的作用 剂量 给药途径 动物数,只, 体重变化率瘤重,g, 抑制率 - 组别 mg/kg ×疗程,天, 始/末 ,%, , ?SD, ,%, X 生理盐水组 25ml P0×8 10/10 14.41 1.02?0.15 ※※5-FU组 20 P0×8 10/10 3.58 0.41?0.19 59.80 ※茯苓多糖口服液 300 P0×8 10/10 15.61 0.62?0.25 39.70 ※茯苓多糖口服液 600 P0×8 10/10 -8.8 0.51?0.28 49.90 注:与对照组比较 “※”P<0.05，“※※”P<0.01 以上实验表明～口服茯苓多糖口服液150,600mg/kg 8天～对EAC的抑制率分别为39.70,59.81%～经统计学处理～具有明显的抗癌作用。 小结 一、 环磷酰胺可使小鼠胸腺、脾脏的重量～产生溶血素的水平～巨噬细胞的吞噬能力明显降低。在给环磷酰胺同时～给茯苓多糖口服液则可对抗环磷酰胺的抑制作用～可明显提高小鼠胸腺、脾脏的重量～溶血素抗体含量～巨噬细胞的吞噬功能～大剂量组的作用尤为突出～表明该药在调节机体免疫功能～增强机体自身免疫能力方面有着重要的意义。 二、 NK活性细胞是机体的重要免疫监视细胞～在机体第一线防御机制中行使主要功能～他们不经致敏即可直接杀伤多种肿瘤细胞和带病毒细胞～还参与机体对免疫反应的调节。本实验结果说明～服用CMP口服液后能明显增强正常小鼠和荷瘤小鼠NK细胞活性～其作用与剂量相关～随着剂量的增加活性增强。 三、 口服茯苓多糖口服液剂量在100mg/kg时～荷瘤小鼠肿瘤坏死因子,TNF)含量与对照组相比较无差异～即对TNF含量无影响。当剂量在200mg/kg时～荷瘤小鼠中的TNF含量与对照组相比～有显著性差异。说明 11 茯苓多糖口服液对荷瘤小鼠的TNF有影响～TNF含量随剂量增加而增加～即TNF含量与剂量相关。 四、 白细胞介素-2(IL-2)的研究起来越引起人们的重视。它是重要的细胞因子～在免疫与炎症反应中均有重要的作用。它可以诱导T杀伤细胞～为肿瘤治疗提供新的手段。本实验结果说明～茯苓多糖口服液能明显提高正常小鼠IL-2的活性。 五、 茯苓多糖口服液对两种动物移植性肿瘤有不同程度的抑制作用。该口服液对S～EAC两种瘤株的抑制作用与口服5-Fu一样具有抑制作用。180 而抑制作用与剂量有关～使用剂量在100,600mg/kg为宜,本口服液毒性较低～长期服用对动物体重无影响。 综上所述～茯苓多糖口服液具有提高机体免疫功能～抗肿瘤的作用～故该口服液将成为疗效好～毒副作用低的保健新药。 参考文献 1. 徐叔云主编《药理实验方法学》人民卫生出版社 1992 2. 李仪奎～等主编《中药药理实验方法学》上海科技出版社 1992 3. 张罗修主编《免疫药理学》上海医科大学出版社 1990 4. 湖南医科大学《免疫学实验指导》研究生用 课题组长:高顺国 者:徐琳本 负 责 人:徐琳本 参加者:徐琳本 樊湘红 原始资料保存处:湖南省中医药研究员中药所重点实验室 试验日期:1993.10,1994.4 原始资料保存人:徐琳本 12 13