鸡蛋中臭鼻克雷伯氏菌的分离与鉴定

鸡蛋中臭鼻克雷伯氏菌的分离与鉴定 第23卷第6期 2011年l2月 黑龙江八一农垦大学 JournalofHeilongjiangBayiAgriculturalUniversity 23(6):5355 Dec.2011 文章编号:1002—2090(2011)06—0053—03 鸡蛋中臭鼻克雷伯氏菌的分离与鉴定 李玲,冷新丽:.胡婧.郭丽茹z.杨玉英 (1.天津农学院农学系,天津300384;2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院) 摘要:从市售鲜鸡蛋内容物中分离到一株革兰氏阴性杆菌,经形态学观察,培养特 性观察及生化试验鉴定该菌为臭鼻克雷伯 氏菌.药敏试验明该菌对先锋霉素,链霉素,氯霉素和庆大霉素敏感.动物实验结 果表明,该菌对小白鼠有致病力.一般情况 下臭鼻克雷伯氏菌属于条件致病菌,从鸡蛋中分离出致病菌株,在公共卫生方面具 有重要意义. 关键词:鸡蛋;臭鼻克雷伯氏菌;分离;鉴定 中图分类号:$482文献标识码:A IsolationandIdentificationofKlebsiellaOzaenaefromEggs LiLing',LengXinliz,HuJhag~,GuoLiruz,YangYuying~ (1.Departmentofagronomy,TianjinAgricultureuniversity,Ti蚰jin300384; 2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HeilongjiangBayiAgriculturalUniv ersity) Abstract:Agram— negativebacteriawasisolatedfromtheinteriorcontentsofaneggsoldinthemarket.Itwasiden tifiedonmot- phologicalcharacteristics,culturalCharacteristicsandbiochemicalreactionstobeKlebsiell aozaenae.Antibioticsusceptibilitytesting showedthatitwassensitivetOstreptomycin,cephaloridine,chloramphenicolandgentamyc in.Animalexperimentshowedithadviru- lencetomice.UndernormalcircumstancestheKlebsiellaozaenaeareopportunisticpathoge ns,itisimportanttopublichealthsafety. Keywords:eggs;Klebsiellaozaenae;separation;identification 克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性,兼性 厌氧杆菌.该菌属肠杆菌科克雷伯菌属【".主要有肺 炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae),臭鼻克雷伯氏菌 (K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhinoscleroma— tis).生物学性状为较短粗的杆菌,大小0.50.8× 1—2um,单独,成双或短链状排列.无芽胞,无鞭毛, 有较厚的荚膜,多数有菌毛.营养要求不高,有普通 琼脂培养基上形成较大的灰白色粘液菌落.本属细 菌55?30min被杀死.在培养基上可存活数周至 数月. 臭鼻克雷伯氏菌简称臭鼻杆菌,一般情况下臭 鼻克雷伯氏菌不致病,属于条件致病菌.引起慢性萎 缩性鼻炎,有恶臭,以及败血症,泌尿系感染等. 通过对市售的鸡蛋进行微生物学鉴定,对鸡蛋 进行了细菌的分离,培养及生化鉴定.结果从鸡蛋中 分离到一株革兰氏阴性杆菌,菌体呈短粗形,典型排 列为单独,成双或短链状排列,兼性厌氧菌,在血琼 脂上生长,菌落周围形成型溶血.经鉴定该菌为臭 鼻克雷伯氏菌.以前未见从鸡蛋中分离出臭鼻克雷 伯氏菌的报道.同时对该菌在营养琼脂,麦康凯和伊 红美兰培养基上进行培养,观察其在不同培养基上 的生长特性. 1材料 1.1试剂 生化管,购自杭州天和微生物试剂有限公司,生 理盐水,革兰氏染液,培养基按常规方法制备. 1.2药敏纸片 购自杭州天和微生物试剂有限公司(各种药 收稿日期:2011-06—28 作者简介:李玲(1957一),女,黑龙江八一农垦大学毕业,现主要从事微生物实验教 学与研究方面的工作. 通讯作者:杨玉英,女,教授,硕士研究生导师,E—mail:yalele258@sina.corn. 黑龙江八一农垦大学第23卷 物敏感由杭州天和微生物试剂有限公司提 供). 1.3实验动物 体重l8,22g健康小白鼠(购自牡丹江医学院实 验动物中心). 2方法 2.1样品的采集 从某超市销售鸡蛋的蛋筐下层无菌采集样品蛋 (2010年3月10日). 2.2样品的处理 鸡蛋标号,倒出蛋内容物,取下蛋壳膜,将蛋壳 碾成粉末,鸡蛋内容物充分搅拌均匀.取O.5g蛋壳 粉,1mL鸡蛋内容物分别放于消毒青霉素瓶内,按 10倍,100倍,1000倍,10000倍的稀释度,将上述 样品用无菌生理盐水稀释. 2.3细菌的培养 每个稀释度吸取0.1mL均匀涂布于鲜血琼脂平 板上,置37?恒温箱中需氧培养24h.观察培养结 果. 2.4细菌的分离纯化及培养特性试验 用接种环分别从细菌形态不一致的单个具有代 表性的菌落挑起少许革兰氏染色,根据菌落形态和 革兰氏染色,将剩余部分接种于血平板,置37?恒 温箱中培养24h.再将纯化的培养物接种于营养琼 脂,麦康凯和伊红美兰培养基上37?恒温箱中培养 24h,观察结果. 2.6生化试验 取上述纯化菌分别接种于葡萄糖,乳糖,麦芽 糖,甘露醇,蔗糖,靛基质,枸橼酸盐,硫化氢,尿素等 生化鉴定管,培养特性及生化特性鉴定,37?恒温箱 中培养24h.生化特性鉴定试验按参考文献[2】进行. 2.7动物感染试验 用无菌生理盐水将琼脂板上纯化的菌落洗下 后,以每只0.5mL腹腔注射小白鼠2只,同时以灭菌 生理盐水注射两只小白鼠作为对照,分别饲养观察 其症状,对感染试验出现症状或死亡的小白鼠进行 剖检,并采集病料进行分离. 2.8药敏试验 用生理盐水将菌落洗下,制成菌液涂布于营养 琼脂平板上,用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴 在营养基表面,置37?恒温培养24h,观察结果. 3结果 3.1培养特性观察 经培养蛋壳上未见该菌,蛋内容物里该菌对营 养要求不高,在37?条件下,需氧和厌氧培养的普 通琼脂平板上长出较大的灰白色粘液状菌落,用接 种环挑菌落,易拉成丝;在鲜血琼脂平板上,菌落周 围形成o【型溶血. 3.2镜检结果 显微镜下观察为革兰氏阴性,较短粗的杆菌,单 独,成双或短链状排列.无芽胞,无鞭毛,有较厚的荚 膜,多数有菌毛. 2.5涂片,染色,镜检3.3生化鉴定结果 将分离纯化的细菌制成菌液涂片,进行革兰氏对分离菌进行生化试验,结果如表1 所示,该菌 染色法染色,镜检观察菌体形态.的生化反应结果符合臭鼻克雷伯氏菌的生化特 性. 表1菌株的生化鉴定结果 Table1TheResultsoftheBiochemicalIdentifyingFeaturesofKlebsiellaOzaenae 注:"+"为阳性,"一"为阴性. 根据该菌株的菌落形态,大小,培养特性,生化 试验等结果,对照《伯杰氏细菌鉴定手册第八版》所 描述有关臭鼻克雷伯氏菌的特征,确定该分离菌为 臭鼻克雷伯氏菌. 第6期李玲等:鸡蛋中臭鼻克雷伯氏菌的分离与鉴定55 3.4动物感染试验 只注射生理盐水的小白鼠没有任何变化;接种分 离菌的小白鼠死亡.将上述死亡的小白鼠剖检采取病 理,进行细菌分离和生化试验,能得到原分离菌. 3.5药敏试验结果 将臭鼻克雷伯氏菌均匀接种在普通培养基上, 将药敏片按一定距离贴好,在37?培养24h,分离 细菌药敏试验结果如表2所示. 表2分离细菌药敏试验结果 Table2TheResultsofdrugsensitivitytestsofKlebsiellaOzaenae 注:R,耐药;I,中敏;S,敏感. 4讨论 食品蛋内外所带的微生物来源有二个途径:一 是有些母鸡不健康,生殖器官的杀菌作用减弱,来自 肠道或肛门中的微生物可以侵入输卵管,能最后污 染食品蛋;二是鸡蛋经过泄殖腔排出体外受粪便污 染,排出体外后,由于贮存运输,销售等环境不卫生 受到微生物污染[314】.而且食品蛋经过一定的贮存温 度和时间后,微生物可通过蛋壳上无数的气孔进人. 鸡蛋虽然对微生物的侵入有一定自卫能力,但是随 着贮存时间延长,温度变化,这种能力逐渐减弱.最 后有毒有害的微生物侵人蛋内而得以繁殖【5l6】.蛋所 携带的微生物有金黄色葡萄球菌,白色葡萄球菌,大 肠杆菌和沙门氏杆菌等[71. 实验首次从鸡蛋中分离出臭鼻克雷伯氏菌.臭 鼻克雷伯氏菌分布于自然界,存在于水和土壤中,是 一 种条件致病菌,一般情况下臭鼻克雷伯氏菌不致 病,发病与寄主防御功能缺陷及诱发因素有关,可引 发慢性萎缩性鼻炎,有恶臭,以及败血症,泌尿系感 染等.其易感性因素有:?各种降低免疫功能的慢性 病,如慢性支气管炎,肝硬变,糖尿病和恶性肿瘤等. ?肾上腺皮质激素和其他免疫抑制剂的应用.?广 谱抗生素的使用致正常菌群变化.?各种器械操作 和创伤性诊疗技术(如各种导管,气管切开等,为细 菌入侵创造了条件)嘲.在不利的饲养管理条件下,如 鸡群拥挤,鸡舍潮湿,粪便清理不及时,加上春季气 温转暖,通风换气不良都是导致发生此病的因素.应 引起有关部门的重视,特别是医药卫生部门,避免蛋 源性细菌感染的发生. 参考文献: [1]陆承平.兽医微生物学[M].3版.北京:中国农业出版 社,2001. [2]东秀珠,蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].科技出版社, 2o01. [3]李晓东.蛋品科学与技术[M].北京:化学工业出版社, 2005. [4]周永昌.蛋与蛋制品工艺学[M].北京:中国农业出版 社,1994. [5]HumphreyJJ.Contaminationofegsshellandcontentswith salmonellaenteritidis【Jj.FoodMicrobil,1994,21:31—40. [6]王红宁,马孟根,魏永,等.规模化鸡场种蛋蛋壳,鸡蛋内 容物的总细菌数,大肠杆菌数,沙门氏菌数测定[J].中 国家禽,2001,24(23):9-11. 17]HumphreyTJ,GreenwoodM,GilbertRJ,eta1.The sur2vivalofSalmonellasinshelleggscookedundersiI?u— lateddomesticconditions[JJ.EpidemiologyandInfec- tion,1989,103:35-45. [8]谭红专.现代流行病学[M].北京:人民卫生出版社, 2O01.