血小板抗体检查及配血操作规程

血小板抗体检查及配血操作规程 【目的】 Capture-P?是用来检测血小板IgG抗体的固相系统。可为血小板输注无效患者进行血小板配血。 【适用范围】血小板输注无效患者血小板输注前配血 检测原理】 【 Capture-P是一个固相抗体检测系统，是由 Rachel等人4、Juji等人5和Shibata 等人6发表的检测过程改良而来。患者或供体血小板首先结合于聚苯乙烯微孔表面。然后用它们来捕获患者或供体血浆中的血小板抗体。血清在结合有血小板的微孔中进行简短孵育，使抗体与血小板结合(如果抗体存在)。把微孔中游离的IgG冲洗掉，并加入结合抗 IgG 指示红细胞。进行离心，这样会使指示红细胞与结合于固定的血小板上的抗体接触。阳性检测中，在指示红细胞和结合血小板抗体间形成了抗免疫球蛋白G 桥联，从而阻止了指示红细胞向微孔底部的移动。作为这种桥联的结果，指示红细胞会形成一个汇合单层从而覆盖固定的血小板。相反，如果是阴性检测，当不存在血小板抗原-抗体反应时，指示红细胞的移动就不会被阻止，就会被离心到微孔底部，进而形成紧密压缩、清晰的细胞扣。可以使用事先经过冲洗和保存的血小板，这个步骤是可以选择的。使用血小板冲洗和储存溶液洗涤血小板，使之不含污染性血浆蛋白和非血小板细胞成分，这样的血小板可以用来制备 Capture-P检测微孔的单分子层。 【主要组成成份】 Capture-P 检测微孔板:1X8 微带板，坚硬 U 型底部，表面覆盖特异性血小板粘合剂。每个微带板可以进行 8个单独的检测。这些微带板保存于一个可重复性密封的铝箔袋中，铝箔袋中含有干燥剂和湿度计。微带板可以单使用，也可以多个使用。未使用的微带板、干燥剂和湿度计要立即谨慎重新密封于铝箔袋中，以免暴露于湿气中使粘合剂失效。 Capture 检测微孔的辅助试剂:(另行购买) Capture LISS:低离子强度溶液，含有甘氨酸、溴 甲 酚 紫 染 料 和 防 腐 剂 叠 氮 化 钠 (0.1%)* 。 Capture-P 指示红细胞:结合有兔抗人 IgG 抗体的红细胞悬液。红细胞悬浮在缓冲溶液(预先加入氯霉素(0.25 mg/mL)，新霉素(0.1 mg/mL)和庆大霉素(0.05 mg/mL))中。如果指示红细胞出现轻微的聚集，这是正常现象。 Capture-P 阳性对照血清(弱):含有血小板抗体。加入叠氮化钠(0.1%)作为防腐剂*。 Capture-P 阴性对照血清:不含有血小板抗体。加入叠氮化钠(0.1%)作为防腐剂*。进行 Capture-P 试验的组分(Capture-P指示红细胞 ，Capture LISS，Capture-P对 照 血 清，Capture-P 检测微孔)在有效期内可以交替使用，而不用管它们的批号(前提是这些组分都在有效期内)。 【储存条件】在不使用微带板时，在 1-10 摄氏度下保存。其它辅助试剂在 1,10 摄氏度下保存。 【样本要求】 血小板来源:源自供体血小板的样本应该采集于加有 EDTA, ACD, CPD或 CPDA-1 的容器内。不能使用已凝固的血样。样本采集后，富含血小板的血浆必须储存在20?至 25?。检测必须在 48 小时内进行。从血小板浓缩袋中取出的密封小辫片段必须在采集日期24小时内进行检测。 患者或供体血浆或血清:通过静脉穿刺来抽取血液样本。抽取的血样可以加入 EDTA, ACD, CPD,或CPDA-1，或者可以不加抗凝剂。检测应当尽快进行，降低假阳性或假阴性(因为样本污染或者储存不当造成)的机率。如果不能马上对血清或血浆进行检测，推荐将保存于 1-10?下或冷冻保存。不能使用收集于含有中性分离胶试管中的样本。这样的样本会导致假阳性结果的出现。 【提供的材料及试剂】 1. Capture-P 检测微孔 2( Capture LISS 3( Capture-P 指示红细胞 4( Capture-P 阳性对照血清(弱) 5( Capture-P 阴性对照血清 6( 源于供体或患者的血小板 7( 源于血小板供体和/或受血者的血浆或血清 8( 塑料移液管(注:不能使用玻璃移液管) 9( 10X75 毫米聚丙烯或聚乙烯试管(注:不能使用玻璃试管或聚苯乙烯试管) 10(适用于 96 孔板、硬质微孔板或微带板微孔的离心机和转子 11( 37?加热板或干热培养箱 12(磷酸盐缓冲液，pH 6.5-7.5(近似 15 毫米) 13(专用于微孔板的分配总管或移液管管理器 14(秒表或间隔计时器 15(照明表面 16. 记号笔 17(离心机 【检测方法】 1( 在检测前，把所有的检测试剂都置于 18-30?平衡。 2( 血样采集: 2.1 血清标本:患者自凝血1500rpm离心10min，获取上层血清。 2.2 待测血小板样本的制备: 2.2.1 浓缩血小板(PC):将机采血小板袋热合取下1-1.5cm的富含血小板的小辫，再转移至塑料试管(聚丙烯或聚乙烯)中。 2.2.2 富含血小板血浆(PRP): EDTA抗凝全血在2600rpm离心样本8min。使用塑料吸管把血小板富含血浆(PRP)部分移至塑料试管中。 3 操作步骤: 3.1 除去密封袋上 Capture-P 检测微孔的必需编号。检查密封袋中的湿度计。如果湿度计显示有湿气存在，此密封袋中的微带板就不能使用。 3.2 使用塑料移液管，在微带板微孔中分别加入 1-2 滴(50-100 μl)血小板样本(见图 1)。本组中的第一个微孔将作为阳性对照(弱)，第二个作为阴性对照。在第一行中剩余微孔中依次作为待检测供者血小板(PC或PRP)。 3.3 在45-65 x g转速下离心微孔板 5 分钟。使血小 板固定在微孔板的孔表面。 3.4 轻轻倒出上清，然后用生理盐水洗涤微带板3- 6 次，以去除为结合的血小板。(倒上清时应一次 性倒扣微孔板并拍打) 注意:过度或剧烈洗涤技术可能会造成血小板 层的移位或在固定血小板层上出现小洞。 3.5 立即向每个含有血小板的微孔中加入2滴(100 +10μl) Capture LISS。LISS呈紫色。 图1. Capture-P 检测微孔 注:倒出血小板超过1分钟，如果不加入如 LISS或 生理盐水之类的液体，微孔就会变干。干燥就会导致血小板单分子层的破裂。 3.6 向第一列中的第1个微孔中加入 1滴(50+5μl) Capture-P 阳性对照血清(弱)。向第 2 个微孔中加入 1 滴(50+ 5μl) Capture-P 阴性对照血清。 3.7 向第一列中微孔C和D与其他含有固定血小板测定微孔中，分别加入1滴(50+5μl)患者血清。 3.8 摇动微孔板以混合血浆和增效剂(通过重复轻叩微孔板的边缘来完成) 注:当血清存在时，Capture LISS 会由紫色变成天蓝色或土耳其玉色。如果 Capture LISS 还是保持紫色，就说明试验中血清被不小心漏加了。 3.9 在 37?下孵育微孔板 30分钟。孵育时间不要超过 60 分钟。 3.10 用生理盐水冲洗每个微孔并倾倒，重复6-8次，每次冲洗后要倾倒彻底。操作同3.4。 3.11 立即向每个含有血小板的微孔中加入1滴(50+5μl) Capture-P 指示红细胞。 3.12 在 700-900 x g转速下离心微带板1分钟。 3.13 将微带板置于照明表面上，来检测指示红细胞是否黏附。(阳性反应的特征是指示红细胞黏附于微孔底部表面。阴性反应的特征是在微孔底部形成一个紧密的细胞扣)。记录结果。 3.14 每一个检测结果都要跟阳性对照和阴性对照血清相比较，并与供体血小板对照进行比较。如果出现可疑反应(无规则的，非同心消失)或阳性对照和/或阴性对照血清不正确，必须进行重复检测。如果检测微孔和供体血小板对照微孔都是阴性反应，那么抗体检测试验就是阴性的。如果检测微孔呈现阳性反应而供体对照微孔不呈阳性，我们就认为检测呈现阳性。如果血小板样本抗体检测试验呈现出不同的结果，要重复进行检测。供体血小板对照呈现阳性会使相同血小板抗体检测阳性结果失效，因为供体血小板在检测前就可能结合有抗体。给出的g力是产生所需黏附程度的速度。对于每一个离心机都应当单独设定其适当的每分钟转速和时间。 反应稳定性:在最后离心分离后，检测结果就可以马上进行读取。因为阳性结果是持久的，微孔板通过离心后，可以被覆盖以避免蒸发，保存于1-10?，可以立即读取检测结果或者可以在检测后2天内进行重新读取。 质量控制:在每次使用时，利用阳性对照和阴性对照检测对Capture-P 检测体系的反应性进行评价。如果，在任何一轮检测中，阳性对照血清不能产生阳性结果和/或阴性对照血清不能产生一个阴性结果，此轮中所有检测都必须重复进行检测。对照血浆出现连续失败可能说明一种或几种检测试剂已经变质，或者检测操作不正确。 【检验结果的解释】 1.阳性试验: 包被有抗人球蛋白的指示细胞被结合到有抗体包被的微孔上，在微孔表面形成完整的细胞层，反应表面部分或全部黏附着指示红细胞。 部分或全部凝集=阳性 2.阴性试验:检测微孔底部有纽扣状指示红细胞聚集，并且没有容易检测到的黏附区域。 不凝集 = 阴性 【检验方法的局限性】 检测材料的细菌或化学污染、不恰当的孵育时间，不正确的离心、检测微孔冲洗不当或遗漏检测试剂或步骤都会导致错误结果的产生。在抗体检测过程中，必须保证有足够量的血小板覆盖于微孔上，因为不足量的血小板单分子层会导致检测结果假阳性。在单分子层制备过程中，不适当的离心时间或者转速会导致血小板覆盖度较差。此外，过度或剧烈洗涤微孔会导致固定于微孔底部的血小板数量的减少。在检测最后阶段加入指示红细胞前，如果使用了酸性、无缓冲盐水冲洗膜覆盖的检测微孔，很可能7会削弱抗原与抗体之间的反应。使用 PH6.5-7.5的生理盐水进行冲洗会得到最好的结果。含有较高数量血小板聚合体的样本会产生无规则黏附血小板片层(因为血小板聚合体也能像非聚合体血小板一样跟微孔表面结合)。在离心过程中，聚合体会抑制指示红细胞的正确沉降。如果使用的血小板在体内已经结合有 IgG 分子(也就是直接抗球蛋白试验阳性)，就会产生假阳性检测结果。在血小板供体对照试验中，这种血小板会产生阳性反应。如果使用的血小板与检测血清的 ABO血型不一致，就会产生假阳性结果。加入指示红细胞后，如果过度离心，会导致假阴性或可疑阳性结果(因为黏附指示剂层的破裂)。如果不能获得阳性对照(弱)反应，就说明检测微孔板过度离心。加入的指示红细胞数量超过指定数目可能会导致假阴性或可疑检测反应。离心机的减速因子可能会影响试验最终获得的反应类型结果。错误使用离心机的制动装 置使减速时间延长，这样会导致假阴性反应的产生。相反地，减速时间过短会导致错误检测结果的产生。没有完全凝结的血清样本会导致检测结果错误。这种样本在加入到 Capture-P 检测微孔中后，还会继续凝结。这种凝结的结果是在血小板单分子层上面产生了一层较薄的凝胶样物质。加入微孔中的指示红细胞会被这种物质覆盖，而在离心过程中无法进行正确确定阳性或阴性反应。离心完成后，指示红细胞会形成松散的纽扣状物体悬浮于检测微孔的表面。当微孔板倾斜角度不同时，纽扣状物体的位置会发生改变。用于制备血小板单分子层的浓缩血小板会影响血小板抗体检测试验的 结果。当血小板悬液中血小板含量太少时(低于10,000/立方毫米)，就会导致单分子层不完整。这会进一步导致假阳性结果的产生。如果血小板悬液中血小板含量过高(高于350,000/立方毫米)，就会导致假阴性结果的产生。血小板具有天然的粘性。当悬液中存在太多的血小板时，在制备单分子层的离心过程中，它们会相互黏附。在第一步洗涤时，他们不可能被全部冲洗掉。结果在最初的单分子层上就会留下第二层。然而，第二层并不像最初单分子层与微孔底部的偶联剂结合的那么紧密。在孵育和第二次洗涤后，第二层就会被洗掉并且它与抗血小板抗体相结合。当血小板悬液中血小板含量为 20,000/立方毫米时，能够提供充足的血小板以制备单分子层。这种悬液的外观看上去有点混浊。这个水平的血小板数目可以用肉眼直接进行估计，就像技术专家能够估计 2-4%红细胞悬液。含量超过350,000 血小板悬液可以加入防腐剂稀释剂(例如，血小板冲洗和保存溶液)进行稀释。加入的指示红细胞量太少、试剂不正确的混合或红细胞溶血都会导致微弱的假阳性结果。如果使用指示红细胞时温度低于 18 摄氏度，会导致微弱的假阳性结果。Capture-P 阳性对照(通过阳性结果)失效表明指示红细胞失效。没有一种检测方法能够检测出所有未预料的血小板抗体。 【产品性能指标】 由 三 个 独 立 实 验 室 进 行 的 临 床 评 价 表 明Capture-P固相体系能够检测血清或血浆中的血小板抗体。每一个实验室使用的临床样本在进行研究前，都根据参考程序(也就是，酶联免疫吸附试验，免疫荧光或淋巴细胞毒性试验)进行了特征化。Capture-P 固相体系能够检测人白细胞抗原A、人白细胞抗原B和血小板特异性抗A18原的抗体(Pl)。一些使用免疫荧光法检测为血小板抗体阴性的患者样本，使用Capture-P试验检测为阳性。使用酶联免疫吸附试验对这些患者浆液样本进行血小板抗体检测，结果为阳性。这些Capture-P阳性、酶联免疫吸附试验阳性、免疫荧光法阴性浆液的特异性没有进行确定。本产品的性能取决于对内含推荐方的贯彻程度。为保证适当的反应性和特异性，Capture-P固相体系的每一批产品在出厂前，都对参考 浆液(含有人白细胞抗原A、人白细胞抗原B和血小板特异性抗原的抗体)和不含有上述抗体的浆液进行了检测。 【注意事项】 仅用于体外诊断。本试剂含有0.1%叠氮化钠，并且被归类为有害物品(Xn)。如果吞食会造成 R22 级伤害。i叠氮化钠会与铅和铜导管反应从而形成爆炸性化合物。如果直接丢弃进水池中，要用大量的水进行冲洗，以免造成叠氮化物的堆积。所有试剂按具有潜在污染性的试剂进行处理。所有的血制品都应当作为潜在的污染物。获取产品的原材料必须根据美国食品及药物管理局所要求的检测方法检测为阴性才能使用。没有已知的检测方法能够保证取材于人血的产品不含传染性物质。铝箔袋中湿度计颜色由蓝色变为粉红色时，袋内的微带板就不能再使用了。微带板从包装袋中取出后必须在 30 分钟内使用。用于抗体检测过程中的血小板必须与测试中血清/血浆ABO血型一致。检测前抗原特征化血小板和未特征化血小板都可以用于检测。