羊胎盘中SOD提取条件及小分子肽的分离纯化的研究

羊胎盘中SOD提取条件及小分子肽的分离纯化的研究 羊胎盘中提取条件及小分子肽的分离纯化研究 林媛 研究生: 关一夫 导 师: 论文课题起止时间:至生旦二至兰生垒月 论文完成时间: 兰生垒旦 中国医科大学辽宁 年月中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地 方外,论文中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果,也不包含 为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料,与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 日期: 迎垃.厶:臣 论文作者签名:彝啦 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定,即:研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保 证毕业离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学,且导师为通讯作者,通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许 论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容保密 内容除外,以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名: 指导教师签名:目录 一、摘要 中文论著摘要一 英文论著摘要.. 二、英文缩略语?一 三、论文 前言日百??‘ 第一章胎盘中提取条件的优化 实验材料与方法??.. 实验结果??.. 第二章胎盘中小分子肽的研究 实验材料与方法??.. 实验结果??.. 第三章总结 讨论结论四、本研究创新性自我评价??.. 五、参考文献??.. 六、附录 综苤?. 在学期间科研成绩?.. 致谢 个人简介??..?中文论著摘要? 羊胎盘中提取条件及小分子肽的分离纯化研究 目 的 胎盘又名“紫河车”为常用中药,民间常将其煮烂食之。传统中医 理论认为胎盘性甘、咸、归肺、肝、肾经,功能为补气、养血、益精,可用作滋 补、养颜、强壮之药。现代医学研究:胎盘除含有多种免疫球蛋白、活性肽 之外,还含有干扰素、激素、磷脂和多种多糖等。从八十年代开始,我国许多学 者便开始从健康产妇的胎盘中提取一种小分子活性物质即胎盘活性因子或称胎盘 肽,经研究证明胎盘肽对机体有增强抵抗力和免疫力的作用。研究家畜胎盘肽的 主要目的是将家畜胎盘中丰富的生物活性肽传递给动物或人,以增强动物或 人体 的生物功能,从而探索出一种充分利用动物胎盘的新型免疫调节剂。本实验 从羊 胎盘中分离及小分子肽,为以后的新型药品研发奠定了一定的基础。 方法 自然界真核生物中绝大部分为. ,其分子量为左右,故本 实验利用超滤方法,将羊胎盘截留为??分子量片段,首先将 .的分子片段通过改变温度、孵育时间和浓度来检测 活性的变化,从而选择比较好的条件来提取羊胎盘中的。本实验还将上述 ??分子量片段利用层析纯化和双酶水解的方法得到我们所需要的目 的片段小分子肽,并对这两部分小分子肽进行测序。 结 果 利用超滤方法截留羊胎盘提取液.,通过改变温度、孵育时间、 浓度选取最适条件来提取羊胎盘。还利用层析纯化的方法获得了两 段小分子肽片段,并对其成分进行鉴定。经实验发现,温度为、孵育时间为 及.在浓度为.%时,同工酶谱显示此段截留的羊胎盘样品具有三种同工酶,分 别为、、,其中 活性最高, 并得到其粗提物为。实验中还对两种检测的活性方法进行了比较,发现邻 苯三酚法对粗酶中的活性测定更为准确。本实验还成功获得了两段小分子肽 段分别为酪蛋白和辅酶一部分。 结论 本实验优化了羊胎盘中提取条件,实验发现羊胎盘具有三种同工酶 其中 活性最高,其次为,,经聚乙二醇萃取得到其 粗提物为。实验中还对两种检煲的活性方法进行了比较,发现邻苯三酚法 对粗酶中的活性测定更为准确,为以后粗酶活性的准确测定提供依据。 本实验成功获得了两段小分子肽段,为以后新型药品的研发奠定了一定的基 础。 关键词 羊胎盘;超氧化物岐化酶;小分子肽 英文论著摘要””., , ,, . , ,,, . ’ .. .. , . , ,仃. , . 沁 ,, .. 。, .%. , .. : . . ,. , .;; ?英文缩略语论文? 羊胎盘中提取条件及小分子肽的分离纯化研究 刖 昌 胎盘是哺乳类动物在妊娠时为胎儿供应养分,供胚胎生长的特殊器官,其组 织细胞内含胎儿生长所需的物质成分,俗称衣胞或胎衣,中医称为紫河车。胎盘 作为传统中药,历来被视为大补之品,在我国已有几千年的历史,现代医学研究 证明:胎盘含有多种免疫球蛋白、活性肽、激素、酶及酶抑制因子、细胞因子等 生物活性物质及氨基酸、微量元素与维生素等成分,具有抗氧化、抗疲劳、调节 免疫和延缓衰老等功效口。。 目前胎盘类产品的制备主要以人胎盘为原材料,以胎盘为原料制成的中成药 在中医临床上广泛应用,人胎盘生物活性物质具有增强人体的体液免疫和细胞免 疫的功能,可用于治疗免疫功能低下、恶性肿瘤等多种疾病,是一类具有较好应 用前景的生物活性免疫调节剂和免疫促进剂。临床中应用其治疗慢性支气管炎、 肝炎、消化性溃疡及慢性溃疡,母乳缺乏症,不孕、不育,抗感染作用和抗变态 反应作用等,另外,紫河车对改善睡眠、治疗神经性头痛和贫血,以及结核患者 的久病体虚有很好的营养作用口。 人胎盘肽是从健康产妇胎盘中提取的具有免疫等多方面药理活性物质,近 年来,胎盘的神奇功效越来越被人们了解并接受,但是,由于人类胎盘来源有限 和伦理道德的争议,并且胎盘归产妇个人所有,这样导致人胎盘的利用上很难进 入新药研发的新阶段,因而对动物胎盘的开发应用自然而然的成为一种新的选择。 动物的胎盘活性物质的利用起始于世纪初,瑞士科学家卡尔教授首次发现 羊胚胎细胞中有一种能使细胞恢复活力的神奇物质,卡尔教授因此而获得诺贝尔 奖。年,日本京都医院的山岛教授从羊胎盘中提炼出具有划时代意义的羊胎 素后,对羊胎盘提取液的研究引起了广大学者的浓厚兴趣。徐桂花畸等对人和羊 胎盘进行对比分析认为羊胎盘与人胎盘结构相似,通过对羊胎盘进行定量分析, 羊胎盘中含有种常见的氨基酸,其中种为必需氨基酸,动物实验表明,羊胎盘 提取物能对小鼠的免疫功能具有显著的增强作用,显示了羊胎盘中蕴含丰富的免 对分离的每个峰做紫外吸 疫调节物质。黄洁,李晓波?等用 收扫描,分析结果表明羊胎盘的营养结构与人类胎盘基本一致。杨秀芳 、许代娣嘧等人将胎盘中的小分子活性物质进行提取,通过血清溶血素 的测定可以明显提高小鼠抗抗体的生成,这与蔡英姬?等人以羊胎素所做的 试验所得溶血值的结果相同,可以认为有相似的免疫活性。羊胎盘以其合理的自 然结构、特别丰富的营养成分含量成为动物胎盘的首选种类。另一重要原因是, 羊胎盘不会感染肝炎病毒,不会与人类产生交叉感染,其他动物胎盘包括人胎盘 很可能带有这种病毒,在大批量生产中,只要有一只胎盘带有病毒,产品的危害 是可想而知的,而使用羊胎盘,相对较安全,也有实验表明,羊胎盘粉为无毒、 】。 无致突变作用的物质,为此产品的开发及利用提供了安全、可靠的依据 研究表明羊胎盘复方制剂具有免疫调节、抗氧化和缺氧耐受的作用卜,如 普丽新胶囊以羊胎盘冻干粉与人参皂甙配伍,中医上形成了补气与补血的完美结 合,达到气血双补之功效。贵阳黔峰生物制品有限责任公司生产的肌注胎盘多肽 注射液辅助治疗中晚期恶性肿瘤,临床应用表明胎盘多肽注射液是一种生物免疫 调节剂,能提高机体免疫能力,减轻或降低化疗引起的毒副作用恶心呕吐、口 腔粘膜炎及外周神经毒性,对化疗有一定的辅助治疗作用 。内蒙古神元生物 工程股份有限公司历经年艰辛研制、开发的兽药新产品一羊胎盘转移因子注射液, 具有增强猪、禽机体免疫力租抗病力的作用,有助于提高猪、禽生产性能。此外, 胎盘多肽注射液具有抗衰老及美容、改善睡眠和改善精液质量、抗病毒等功效 等发现动物组织中具有类吗啡活性的小肽以来,从各种生物资源中 分离出来许多具有生物活性功能的小肽并进行了系统研究。大量文献表明这些活 性肽在细胞生理及代谢调节上发挥重要作用,有些生物活性肽,如类吗啡因子和 酪蛋白磷酸肽,等已经作为保健食品和药物实现 了工业化生产,并取得巨大的经济效益,展示了生物活性肽非常好的开发和应用 前景,成为目前世界上药物及保健品研究的热点。但目前国内尚无能大量开发与 生产多肽产品的企业,进口多肽中间体原料居高不下,提高了我国多肽产品的成 本,严重制约了生物多肽这一新兴产业在我国的发展。我国是一个畜牧业大国, 每年羊胎盘产量上万吨,大部分的羊胎盘被随意丢弃或被母羊直接吃掉,没 有充 分有效的开发出其应有的商业价值。从一只羊胎盘中提取出的小分子生物活 性多 肽的价值远远大于一只羊本身的价值,因此很有必要对其进行研究。 第一章胎盘中提取条件的优化 实验材料与方法 一实验试剂与实验器材 .实验材料 羊胎盘羊胎盘 个置于.。冰箱冷冻室,使用时于前一夜取出置于冰箱冷 藏室解冻。 .实验试剂 无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、碳酸钠、氯化钠、冰乙酸、 丙酮、雎巯基乙醇、硫酸铜?、硫酸锌?、聚乙二醇 、邻苯三酚、盐酸。 .实验器材 计 ;电泳仪型,北京六一仪器厂;恒温水浴锅 ;电子分析 ,巩英市英峪予华仪器厂;冷冻离心机 天平,中国江苏常熟长青仪器仪表厂;数显恒速强力电动搅拌器;冷冻干 燥机..,上海比朗仪器有限公司;组织匀浆机,上海思 伯明仪器设备有限公司;紫外分光光度计.:多功能酶标仪 ;透析袋;手术器械;组织匀浆机;高速分散匀质机.; 中空纤维柱.,.北京旭邦膜制备有限公司。 二实验方法 .样品处理 融化胎盘 将冷冻的胎盘前一天放入。冷藏室,第二天流水解冻。 去除筋膜 洗净血液后流水冲洗胎盘,用%乙醇预先擦拭剪刀等实验器材,剪取胎盘 的子叶及去除血管和筋膜,剩余组织的重量为.。 组织匀浆 档重复,重复三次,将 向组织中加入的缓冲液,档停, 组织倒出,:体积匀质。 抽提 搅拌器用%乙醇擦洗,在。冰柜中以抽提。 离心 ,,。,沉淀量为,取出上清液的体积为。 过膜 向上清液中加入 ,经和中空纤维分离,过膜后得到 .的体积为。 .温度试验 试验分组进行,每组取溶血液,反应温度分别选为?、?、?、 。、。、。、?、。、 、 将溶血液缓慢加热至所选反应温度, 保持,冷却至室温,再,离心,取上清液,测体积,测定 活力,观察上清液的颜色及混浊度,判断其去除杂蛋白效果。 .不同孵育时间对活力影响 从上述试验结果中选择出最佳温度作为试验反应温度,各取原液分别进 行,,,不同时间孵育,冷却后,,。, 离心,量取上清液体积,测定蛋白浓度及活性。 .、存在下的试验 预先准备铜锌盐溶液%的硫酸铜、%的硫酸锌。试验分组进行,每组 取 ,孵育后的离心上清.,分别加入、.%、.%、. %、.%、.%、.%的不同浓度的铜锌盐溶液,搅拌 ,静置, 离心?,,,取上清液计算体积,蛋白定量和活性的检测, 观察上清液的颜色及混浊度。 三.电泳结果 四同工酶谱活性鉴定 五两种方法测定活性的比较 六加入%冻干 二.实验结果 一温度对活力及除去杂蛋白的影响 不同反应温度对活力的影响及红细胞除去效果见表及图.。 /组 表,温度对活力的影响 温度? 上清液体积 总活力上清混浊度 比活力/. . 混浊 . . 混浊 . . 混浊 . . 稍混浊 . . 清亮 . . 清亮 . . 清亮 . . 稍混 . . 稍混 . . 稍混 注:表中数值为三次结果的平均值 / ?时,总活力最高,但比活过低且上清液呈现混浊状态,而反应温度在? 时,上清液清亮,活力最高./,总活力下降不明显,故选 用?。当反应温度超过。时,活力逐渐下降,原因是由于温度过高最终 导致蛋白质变性,因而的活性下降。故羊胎盘的提取时,最好选用的温 度为?.?。 二不同孵育时间对活性的影响 不同孵育时间对活力的影响见表及图.。 组 表,不同孵育时间对活力影响 注:表中数值为三次结果的平均值 / 图.,不同孵育时间对活力影响 从实验结果中不难看出,在孵育时间为时的活力.、 ./达到最高。 三不同浓度的.盐溶液对活性的影响 从温度试验结果中选择出最佳温度,孵育时间为,加入不同浓度的 盐溶液,结果如表和图.。 表,不同浓度一盐溶液对活力的影响 /组 注:表中数值为三次结果的平均值 /以弥补于胎盘处理过程中造成的离子缺失;但当.盐溶液浓度高于 .%时活力逐渐降低,可能是被替换,致使活力受影响。 四电泳结果及酶谱 誉 蕊 ‘一。‘?。?。二‘潮 ‘?????????? 图,?电泳图 图,同工酶谱图 图中我们可以看到四条比较清晰的电泳条带,分别是,,, 。同工酶谱图显示,,条带具有活性称为 的同工酶,其中活性较强,?棚?活性次之。 五活性检测方法比较 邻苯三酚法 羟胺方法 去巡 ? ./ ./ 。.%. ./ ./ 表,活性检测方法比较 邻苯三酚法与羟胺方法进行活力检测结果比较发现羟胺方法不适合对粗酶 活 性进行鉴定,文献中也有相关报道,等认为法羟胺方法有些缺点,特 别是不能用于测定粗酶,因其中可能含有细胞色素氧化酶或细胞色素过氧化 酶而 干扰反应。 六回收率计算 样品 总活力 总活力回收率 七加入%冻干 』签垫 图,不同浓度 对萃取效果影响 实验结果显示%有利于的萃取,每个胎盘的粗提物为., 产率为.%。 第二章胎盘中小分子肽的研究 一.实验材料与方法 一实验试剂与实验器材 .实验材料 羊胎盘置于. 冰箱冷冻室保藏,使用时于前一夜取出置于冷藏室。 .实验试剂 无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、碳酸钠、氯化钠、冰乙酸、 .巯基乙醇、银染相关试剂、硫酸铵、氯化钡、胰蛋白酶/芝、木瓜蛋 白酶/窑、蛋。 .实验器材 计 ;电泳仪.型,北京六一仪器厂;恒温水浴锅 ,巩英市英峪予华仪器厂;冷冻离心机 ;电 子分析天平,中国江苏常熟长青仪器仪表厂;数显恒速强力电动搅拌器; 冷冻干燥机一.,上海比朗仪器有限公司;组织匀浆机, 上海思伯明仪器设备有限公司;组织匀浆机;高速分散匀质机 .;摇床;中空纤维柱.,.北京旭邦膜制备有限公司; 黼 二实验方法 融化胎盘 将冷冻的胎盘前一天放入冰箱,第二天流水解冻。 去除筋膜 洗净血液后用水冲洗胎盘,用%乙醇预先擦拭剪刀等实验器材,剪取胎盘的 子叶及去除血管和筋膜。 组织匀浆 向组织中:加入缓冲液,档停,档重复,重复三次,把组织 倒出,:体积匀质。。 抽提 搅拌器用%乙醇擦洗,在。冰柜中以进行。 冻融 .?冰箱中反复冻融三次。 煮沸 按体积:向匀浆液中加入蒸馏水煮沸,冷却至。左右,调节至 .。 酶解 加入双酶木瓜酶./,胰酶。/酶解,?摇床作用 。 离心 高速冷冻离心,,,弃沉淀,取上清。 硫酸铵沉淀 取清液,缓慢加入形成%浓度的硫酸铵溶液。 离心 高速冷冻离心,,,弃沉淀,取上清。 硫酸铵沉淀 继续缓慢力/. 形成%浓度的硫酸铵溶液。 离心 高速冷冻离心,,,取沉淀,弃上清。 重悬 蒸馏水重悬沉淀。 层析纯化除盐柱,柱,柱,分子筛 冻干 小分子电泳检测 质谱分析 二、实验结果 除盐柱 图, 平衡液:蒸馏水 洗脱液:蒸馏水 流速:/ 结果:经过初步除盐柱除掉样品中存在的盐,收集穿透峰中蛋白样品 图,柱强阴离子交换柱 平衡液: 洗脱液:含 流速:/ 结果:将图收集的溶液进一步过柱,收集穿过峰,进行下一步层析分离图,.强 阳离子交换柱层析 平衡液: 洗脱液:含 流速:/ 结果:经过柱清洗之后,可以收集到两部分目的片段,如箭头所指 柱 图,目标过 平衡液:蒸馏水 洗脱液:蒸馏水 结 果:此时收集到的箭头所指的肽段即目的片段 ‘ ‘口 。 ??丽??二面??弋?卜面??百??;:二?面?” 柱 图,目标过 平衡液:蒸馏水 洗脱液:蒸馏水 结果:此时收集到的箭头所指的肽段即目的片段 ?图目标小分子肽段的电泳图 图,目标分子肽段电泳图 降堋 蝴.;’, ?的哟 删 圳 咖 .? 脚?瞄 ? ?哪 涨钿 仆拍’ 油‘ 惜’ 科 鲫:; 舯 ?? / .. .? ?’ ? 亡. 帖靠 成 . : ..., 秘 引鹕 所 .. 神 加 、, .艚 所 .. 秘 ? . . , .. 仆 伸 ‘’ . .. 如 ?‘. , . ? ? ?.?. ‘ 仲? 伯一 瓢 . 筋 ?: . 暑昌 ,町 .钟 :,.《 . ’ .? 图,目标分子肽段测序 剽孵 ?璺 囊函;蒿黼鎏 髦耄隧糯瓣蠢器嚣 芝激 。 .瞧琴剐鬻哮睁 ”爹 :辍攀。霪影 :: 擎?辫?姆鬻擘辫。薹霪重鎏 溪豢鬻磐; 辫:躺《潴 淡强戳 簿.约辐 ;麓?泌 舀葶 ;霁 辫,丞 篱? 瓣 霪《.强? 耄 忿 戮搿溅 粼.诏 夔 辚螽?晶茂 辫.衢国 鬻筠 翳。瓣孽 瀚,瓣 霪 釉黝黼黝翔默黻 巷 瓣辩蹬固烈麓麓釉鞠薹瞪 弱. 璎.辫 潋?.嚣弱笠貉、妫器鞫鞘》洲磁争剥熬耋瓤 蠢 筠 豁乏黝副粒?斛雾 恶箨 螽。了 嚣蠢,巷 图,目标分子肽段测序 测序结果显示,得到目标.的结果是泛素的一部分,目标.的结果为. 酪蛋白。 讨论 胎盘是哺乳类动物在妊娠时为供应养分,供胚胎生长的特殊器官,其组 《本 织细胞内含胎儿生长所需的物质成分,俗称衣胞或胎衣,中医称为紫河车。 草纲目》中记载:胎盘性甘、咸、入肺、肝、肾经,功能为补气、养血、益精, 可用作滋补、养颜、强壮之药。是一种源于生命体的活性物质,能消除生物 体在新陈代谢过程中产生的有害物质,对人体不断地补充可以使人体具有抗 衰老的特殊效果。 本实验利用超滤方法截留羊胎盘提取液,为能够获得较高活 性的,我们对羊胎盘提取液进行了不同提取条件的优化,发现在反应温 度在时,总活力最高,但是单位活力过低且上清液呈现混浊状态,而在 反应温度在?时,上清液清亮,单位活力最高.,总活力下 降不明显,故在反应温度在?时为实验所需要的合适温度。当反应温度超过。 时,活力逐渐下降,原因是由于温度过高最终导致蛋白质空间结构受到破坏, 故而的活性下降。提取羊胎盘的时候,最好选用的温度为?.。羊 胎盘液对于作用时间也有一定要求,当孵育时间为时候,的活性最大,若孵育 时间过长则会降乇的活性。另外,在不同浓度梯度的十一盐溶 液存在时,随着浓度的升高,活性出现先增高后下降的现象,当 盐溶液浓度在.%,活性会保持在最高点,此时的一盐溶液起到 了促进作用,当浓度超越这个临界点之后,活性急剧下降,有可能是重金属 离子的毒性作用导致活性降低。 利用层析纯化和双酶水解的方法,得到了两段小分子肽段,经过我们验证之 后他们分别是【.酪蛋白和泛素的一部分,得到两部分肽段之后,可以对它们 进行 进一步的研究,这就为下一步的研究奠定了基础。 结论 本实验通过超滤方法对羊胎盘进行截留,优化了羊胎盘中提取条件,经 实验发现,温度为。、孵育时间为及盐溶液浓度为.%时, 同工酶谱显示.羊胎盘样品具有活性,且其具有三种同工 酶,分别为,,,其中的活性最高,并得至粗 提物为。实验中还对两种检测的活性方法进行了比较,发现邻苯三酚法测 定粗酶活性更为准确,本实验还成功获得了两段小分子肽段分别为酪蛋白和 辅酶一部分,为以后用动物胎盘来进行免疫调节试剂的研制奠定了基础。 ?本研究创新性的自我评价? 首次从羊胎盘中提取,从文献报道中可以看出以前动物的提取大多是 从动物的血液中获得,导致造价高,体积大的缺点,我国是一个畜牧业大国, 每 年羊胎盘产量上万吨,大部分被废弃掉或者没有得到有效充分利用。从一只 羊胎 盘中提取出的小分子生物活性多肽的价值远远大于一只羊本身的价值,因此 很有 必要对其进行研究,从而实现废弃物资源化。 本实验的提取不采用传统工业中氯仿和其他有机溶剂萃取的方法,氯仿 是一种常见的环境污染物,有麻醉性,有毒,被认为是致癌物质,又存在着 半衰期短、稳定性差,具有抗原性且较难保存等缺陷,本实验用与 共价修饰,除可使半衰期延长外,还可抗酸、抗碱、抗蛋白酶解、无毒性。 首次从羊胎盘中提取两种小分子,为进一步的酪蛋白和泛素功能研究奠定基 础。酪蛋白磷酸肽有促进矿物质的吸收、防止龋齿、促进受精、提高免疫和 诱导 某些肿瘤细胞凋亡等功能,所以近年来成为研究的热点之一。?参考文献, . ”, :? . .“ 商宪库,牟德华.胎盘的营养价值及其在食品工业的应用.山西食品工业,,: ?. 刘淑兰.中药紫河车的临床应用.中国中药杂志,,:., . ., , :?. :?. 徐桂花.羊胎盘全粉的开发与研究.甘肃畜牧兽医,, 黄洁,李晓波.红外光谱法和反相高效液相法鉴别人胎盘和羊胎盘.中药材,, :. 杨秀芳,牡丹,吴明鑫.活化羊胎素的提取与应用开发.宝鸡文理学院学报,, :.. 许代娣,李琪.胎盘免疫调节因子的研究现状.广西医科大学学报,,: .. 蔡英姬,柳明洙.羊胚胎盘肽的制备及活性测定.延边大学医学学报,, :.. 尹幸念,解国梁,王莉侯,永庆羊.胎盘粉的毒理学研究.内蒙古医学杂志,, . 张淑二,张运海,陶勇,章孝荣.羊胎盘复方制剂对小白鼠免疫功能和缺氧耐受力的影响 .中国生化药物杂志,,:. 谷玉,张淑二,孙亮,章孝荣,刘旭光.羊胎盘复方制剂对小鼠免疫功能的影响.中 国中医药科技,,:?. 李冀宏,杨秀珍,王庆徽,周珊珊,徐文弟.胎盘银杏叶蜂胶复方制剂对高脂大鼠血清总 胆固醇、含量及脾重的影响.齐齐哈尔医学院学报,,:?. 贵阳黔峰生物制品有限责任公司.生产胎盘多肽注射液辅助治疗中晚期恶性肿瘤的临床 疗效观察.中国医疗前沿,,:?. 胎盘多肽注射液与激光及阿昔洛韦片联合治疗复发的尖锐湿疣的临床观察.中国 医药指南,,:?. 王善辉,葛利江.羊胎盘肽对犬血清活性水平的影响.黑龙江畜牧兽医, ,:?. 喻国华,刘建国.胎盘多肽注射液联合促精汤改善精液质量的临床观察.新中医, ,. ?综述? 胎盘的综合利用与开发 摘要:胎盘是哺乳类胎动物在妊娠时为胎儿供应养分,供胚胎生长的特殊器 官,其组织细胞内含胎儿生长所需的物质成分,俗称衣胞或胎衣,中医称为紫河 车。《本草纲目》中记载:胎盘性甘、咸、入肺、肝、肾经,功能为补气、养血、 益精,可用作滋补、养颜、强壮之药。 现代医学研究证明:胎盘含有多种免疫球蛋白、活性肽、激素等生物活性物 质及氨基酸、矿物质等成分,是一种非常理想的免疫调节剂和营养美容保健品【。】。 从八十年代开始,我国许多学者便开始从健康产妇的胎盘中提取一种可透析性小 分子活性物质即胎盘活性因子或称胎盘肽,经研究证明胎盘肽对机体有增强抵抗 力和免疫力的作用。 关键词:羊胎盘;超氧化物岐化酶;小分子肽;废弃物资源化 一、人胎盘的成分 人胎盘成分复杂,经分析测定已得到证实的包括以下几种: .蛋白质:主要是丙球蛋白,它的主要作用在于增强免疫力,抵御多种病毒 对细胞的侵害】,具有抗菌,抗毒素,抗病毒等多种等多种免疫功能及免疫调 节 作用;还有白蛋白及妊娠所需要的多种糖蛋白等多种蛋白组分。 .激素:紫河车中含有多种激素,主要有绒毛膜促性腺激素【’】,促肾上腺皮 质激素释放激素,红细胞生成素,催乳素【】,雌二醇,雌酮,生长抑素等。 .酶及酶抑制因子:包括膜基质金属蛋白酶,库尼特性蛋白酶抑制剂,溶菌 酶【,组胺酣,激肽酶【,碱性磷酸酶【,催产烈 ,人胎盘谷胱甘肽.转移 酶,他们在胎盘形成和胎盘中各物质相互调控中起重要作用。 .细胞因子:包括干扰素一.】、白细胞介素、集落刺激因子 一.、肿瘤坏死因子一耵师,人胎盘免疫调节因子,又名 胎盘肽【 、白血病抑制因子、表皮生长因子】、转化生长 因子..、胰岛素样生长因子等。 .核酸:核酸是人体细胞核的基本物质,对细胞的生长和增殖,特别是维护 皮肤组织的正常代谢、促进皮肤细胞的活力以及增强损伤细胞的修复起着重 要作 用,决定了细胞的衰老进程。 .氨基酸:根据刘月新等人的报道,人胎盘中共含有种氨基酸,其中含 量最高,占氨基酸总量的.%,必需氨基酸种,约占氨基酸总量的.%】。 胎盘提取液中的氨基酸主要以多肽的形式存在【‘。 .微量元素和维生素:人胎盘的酸水解液经原子吸收分光计测定,含有、 、、、、、、等人体必需元烈,并含有微量维生素、乙酰胆 碱等。 二、胎盘的研究局限性和解决方法 胎盘作为传统中药,在我国已有几千年的历史,无论是根据祖国医学的长期 实践经验,还是从现代科学的研究结果看,胎盘及其提纯物质或制剂胎盘素确实 有抗氧化、抗疲劳、调节免疫和延缓衰老等保健作用【】,并正在被开发应用。 目前胎盘类产品的制备主要以人胎盘为原材料,近现代研究发现,人胎盘具 有人体所需的大部分生命活性物质,在人体的免疫调节中发挥着重要作用。人们 通过动物实验及临床应用发现,人胎盘生物活性物质具有增强人体的体液免疫和 细胞免疫的功能,可用于治疗免疫功能低下、恶性肿瘤等多种疾病,是一类具有 较好应用前景的生物活性免疫调节剂和免疫促进剂。临床中应用其治疗慢性支气 管炎、肝炎、消化性渍疡及慢性溃疡,母乳缺乏症,不孕、不育,抗感染作用和 抗变态反应作用等,另外,紫河车对改善睡眠、治疗神经性头痛和贫血,以及 结 。 核患者的久病体虚有很好的营养作用【 人胎盘肽 是从健康产妇胎盘中提取的具有免疫功 能等多方面药理活性【,近年来,胎盘的神奇功效越来越被人们了解并接受,但 是,国家已经明文规定禁止进行人胎盘买卖活动,并且个人胎盘归产妇个人所有, 由于社会伦理道德和材料来源的局限性,大量利用人胎盘作为加工原料是不现实 的,极大地限制了人胎盘的深入研究与开发。因为这样的一些原因,人胎盘的来 源将会大受限制,满足不了医药、食品等多方面的需求,对动物胎盘的研究开发 就具有重要意义。 三、胎盘的研究的现状 自从年日本京都医院山岛教授从羊胎盘中成功地提取出羊胎素后,对羊 胎盘提取液的研究引起了广大学者的浓厚兴趣。羊胎盘用作美容和提高机体免疫 力的保健食品己具有悠久的历史。徐桂花【】等对人和羊胎盘进行对比分析认为羊 胎盘与人胎盘结构相似,通过对羊胎盘进行定量分析,羊胎盘中含有种常见的 氨基酸,其中种为必需氨基酸,动物实验表明,羊胎盘提取物能对小鼠的免疫功 能具有显著的增强作用,显示了羊胎盘中蕴含丰富的免疫调节物质。 对分离的每个峰做紫外吸收扫描, 黄洁,李晓波】等厍 分析结果表明羊胎盘的. 和. 时的峰,在有最大吸收,与多 肽的紫外吸收相同;而. 时的峰在和有最大吸收,这与蛋白 质的紫外吸收相符;人胎盘在. 、. 和. 时的吸收峰与羊胎 上紫外吸收也很相似,可以认为是相 盘相比,保留时间基本一致, 同组分。杨秀芳】、许代娣等人将胎盘中的小分子活性物质 进行提取,通过血清溶血素的测定可以明显提高小鼠抗抗体的生成,这与蔡 英姬【】等人以羊胎素所做的试验所得溶血值的结果相同,可以认为有相似的免疫 活性。此外,羊胎盘的营养组成与人类胎盘也基本一致,营养结构最接近人胎盘, 其合理的自然结构特别丰富的营养成分含量成为动物胎盘的首选种类。另一重要 原因是,羊胎盘不会感染肝炎病毒,不会与人类产生交叉感染,其他动物胎盘包 括人胎盘很可能带有这种病毒,在大批量生产中,只要有一只胎盘带有病毒, 产品的危害是可想而知的,而使用羊胎盘,相对较安全。 】等发现动物组织中具有类吗啡活性的小肽以来,从各种生物资源中 分离出来许多具有生物活性功能的小肽并进行了系统研究。大量文献表明这些活 性肽在细胞生理及代谢调节上发挥重要作用,有些生物活性肽,如类吗啡因子和 酪蛋白磷酸肽,等已经作为保健食品和药物实现了 工业化生产,并取得巨大的经济效益,展示了生物活性肽非常好的开发和应用前 景,成为目前世界上药物及保健品研究的热点。但目前国内尚无能大量开发与生 产多肽产品的企业,进口多肽中间体原料居高不下,提高了我国多肽产品的成本, 严重制约了生物多肽这一新兴产业在我国的发展。我国是一个畜牧业大国,每年 羊胎盘产量上万吨,大部分的羊胎盘被随意丢弃或被母羊直接吃掉,没有充分有 效的开发出其应有的商业价值。从一只羊胎盘中提取出的小分子生物活性多肽的 价值远远大于一只羊本身的价值,因此很有必要对其进行研究。 四、生物活性肽的研究 生物活性肽是由个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的对生物体生命 活动过程具有多种功能的化合物。它主要有三种来源:存存于生物体中的各 类天然活性肽; 消化过程中产生或蛋白质水解产生的活性肽; 通过化 学方法、酶法、重组技术合成的生物活性肽。长期以来,人们一直认为蛋白 质只能以游离氨基酸的形式才能被消化吸收利用,其实动物肠道对蛋白质的利用 并不能以游离氨基酸形式被吸收的。这些肽类物质是介于蛋白质和氨基酸之间的 分子聚合物,能够直接参与摄食、消化、代谢过程,其吸收机制优于蛋白质和氨 基酸,且具有氨基酸和蛋白质不可替代的生理功能。它可作为药物、疫苗、诊断 试剂、酶抑制剂及药物先导化合物.】。科学家们研究发现了具有免疫调节、降 血压、抗病毒、抗肿瘤等功能的活性肽【‘‘】,它们多用于医疗、保健和食品等 行业。大量的国内外研究结果表明:生物活性肽是涉及生物体内多种细胞功能的 生物活性物质。 目前,在生物体内己发现几百种不同的生物活性肽,它们具有不同的结构和 生理功能。其中有很大一部分存在于生物体内的天然成分,要研究清楚它们的生 理功能,就必须从复杂的机体组织中分离纯化出来。因此,对活性肽以及天然活 性多肽分离纯化方法与功能的研究一直是人们比较关注的重点。 活性肽的分类 近几十年以来,虽已从各种生物中分离的生物活性肽有几百种之多,但目前, 生物活性肽还没有较为一致的分类方法。生物活性肽按照来源来分可分为外源性 和内源性生物活性肽;按照功能来分可分为生理活性肽和食品感官肽。 外源性生物活性肽是指非机体生成的,以肽的形式被吸收后具有生物活性的 肽类物质,如动物乳汁可提供多种活性肽,包括乳源性表皮生长因子、 转化生长因子等。 内源性生物活性肽是指生物体自身的组织或器官产生的对其本身具有生理调 节作用的肽类物质,主要包括体内一些重要的内分泌腺分泌的肽类激素,如生长 激素释放激素、促甲状腺素、胸腺肽、胰岛素等;由血液或组织中产生的组织激 肽,如缓激肽。生理活性肽和食品感官肽都是按其生物学功能而得的肽类。其中 生理活性肽包括免疫调节肽、抗高血压肽、抗血栓肽、抗菌肽、阿片肽、阿片拈 抗肽、酪蛋白磷酸肽等;而食品感官肽又包括苦味肽、酸味肽、甜昧肽、碱 性肽 等。 五、生物活性肽的功能 自年和首次发现活性多肽物质促胰激素以来,人们对活性 肽的功能展开了广泛的研究。随着各种活性肽的不断发现,其研究日益受到各国 学者的关注。生物活性肽是沟通细胞与细胞之间、器官与器官之间的重要化学信 使, 通过内分泌、旁分泌以及神经分泌等作用方式传递各种异信息,从而调节生 长、发育、繁殖、代谢和行为等生命过程。因此,对生物活性肽的研究具有重要 的理论意义和实践意义。 .生物活性肽的抗菌功能 抗菌多肽又称抗微生物肽,广泛分布于自然界,在原核生物和真核生物中都 存在。抗菌肽、干扰素、白介素及生物防御素等活性肽能够激活和调节机体免疫 反应,能够显著提高人体外周血液淋巴细胞的增殖,从而起到抗微生物的作用。 抗菌肽具有广谱的抗菌活性,大多数对革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用,有些则 对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均起作用。抗菌肽对某些真菌、原生动物, 尤其 对耐药性细菌有杀灭作用,并能选择杀伤肿瘤细胞。从一些动物模型的实验结果 可以看到,当宿主感染病原菌时,体内抗菌肽的数量会相应增加,如当猪感染沙 门菌时,的表达量会比平时增力倍。研究表明牛蛙皮肤中分离的抗菌 肽在体外对有明显的杀灭作用,对.也有抑制作用【。 .生物活性肽的免疫调节功能 胸腺肽在胸腺微环境中连续诱导胸腺细胞分化发育为细胞,早期促进胸腺内 的骨髓干细胞转化为淋巴细胞,后期协助干细胞分化为辅助性细胞、抑 制性细胞和杀伤性细胞等不同的功能亚群,并促进细胞的成熟。 其中,胸腺肽在促进淋巴细胞成熟的同时,也增加抗原或丝裂原激活后细胞 分泌的干扰素、干扰素?.、.等淋巴因子水平,同时增加细胞表面淋巴 因子受体水平。 最近研究还发现,胸腺肽可以通过调节海马神经元内兴奋性突触的传递进 而影响中枢神经系统的神经生理功能【,它还可直接激活肿瘤相关的巨噬细胞, 把它活化成杀伤肿瘤的状态【。 由骨组织中蛋白质降解得到的活性肽类物质含有丰富的酪氨酸及有助于黑色 素生成的营养物质,而且这种肽物质具有很强的免疫力和调节内分泌的功能。对 由自身免疫低下和内分泌障碍等因素引起的白癜风治愈效果好。另外,活性肽可 增强肝细胞活力,有效地调整淋巴细胞亚群的功能。增强体液免疫和细胞免疫功 能的作用,从根本上提高人体免疫力,是治疗预防各种肝病病变的理想营养品。 .生物活性肽的抗氧化功能 目前使用的抗氧化剂大多是化学合成物,虽然抗氧化效果良好,但对人体肝、 脾、肺有害,具有蓄积性致癌作用。因此,人们逐渐把目光转向天然抗氧化剂, 如抗坏血酸、生育酚、儿茶精类等,生物体内天然抗氧化肽主要为含量很低的肌 肽和谷胱甘肽。肌肽是一种具有极强抗氧化性的天然二肽,结构为一丙氨酰.. 组氨酸,主要存在于动物的肌肉和脑等有氧代谢活跃的组织内。 肌肽具有很强的抗氧化活性,能够抑制氧自由基、金属离子等催化的脂类氧 化,因而具有广泛的细胞保护作用,能延缓细胞的衰老和功能的衰竭,在抵抗衰 老、激发免疫活性以及神经传导方面具有一定的生物学功能。郭刻等试验发现, 肌肽能有效抑制脂质氧化产物丙二醛的生成,当肌肽浓度在./时,抑制率 可达.%。等报道,在肌肉匀浆中加入一定剂量肌肽可显著降低蛋白 羟基化。】等研究发现,在、的反应体系中,肌肽对清蛋白的羟基 化有抑制作用,并且对蛋白的保护作用随浓度的增加而增加。 除此之外,生物活性肽还具有抗病毒、抗肿瘤、降血压、促进钙铁吸收等多 种生物学活性。随着研究的不断深入,将有更多的生物活性肽及其功能将被 发现。 .神经活性 等使用抗软体动物四肽...?,的抗血清,从 小牛大脑中首次检测到了一个八肽序列,亦称为神经活性肽 。随后,也在大鼠的脊索背角、丘脑下部、延髓桥和垂体中间突 起中获取了这种活性寡肽,主要执行神经递质和神经调质的功能。一些研究 表明:在阿片诱导的痛感丧失和吗啡耐受及禁戒方面也起很重要的作用,所 以常被用作吗啡调节活性肽【。 等从日本章鱼脑提取液中得到两个活性寡肽.: .?和:?,并证明它们作为神经肽/神经激素 参与心血管系统的刺激性调型。 .降脂降压 程广伟研究大豆活性肽对高脂饲料喂饲的大鼠血脂的影响,认为大豆活性肽 可有效降低高脂大鼠三酰甘油、总胆固醇的含量,对肝脏、脾脏、肾脏无损 伤功 能【。 姜瞻梅以牛乳酪蛋白为原料,获得了均具有抑制作用的活性抑制肽。该 乳源抑制肽以安全性高、无副作用等优点在高血压的防治中具有十分重要的 研究价值和实用价值【明。 .抗病毒抗肿瘤,诱导细胞凋亡 黄晓明【删等应用新生牛牛脑活性肽.处理人神经母细胞瘤?? 细胞,实验结果显示, /新生牛牛脑活性肽.能有效抑制人神经母细 胞瘤.细胞增殖活动,生长抑制率高达.%:细胞周期检测出现亚细 胞凋亡峰,细胞凋亡率达.%;琼脂糖凝胶电泳显示出现细胞凋亡典型的 梯状条带:染色显示细胞核内出现浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光:光 学显微镜和电子显微镜下可见典型的细胞凋亡特征。 刘艳琴【】等利用细胞病变抑制法测定了蚯蚓寡肽的体外抗伪狂犬病毒 作用,用/染色法和琼脂糖凝胶电泳法分别测定了蚯蚓寡肽对细胞 凋亡的影响。结果显示,蚯蚓寡肽可以抑制感染细胞;还可以诱导细胞 凋亡,且具有浓度效应,浓度越高,细胞凋亡率越高。 .抗疲劳 有人制备了蛋清中的寡肽,认为其具有辅助治疗肝硬化、改善肝昏迷和精神 状态以及降低血胺、改善术后病人的蛋白质营养状态和抗疲劳等作用【】。 六、活性肽的制备 .活性肽的溶解 多肽源于蛋白质,因此提取活性多肽时首先应对其溶解。溶解过程中细胞破 碎和固液分离是整个过程的第一步,也是分离纯化阶段的重要的环节,溶解 程度 的高低直接影响产物的纯度和回收率。 组织匀浆??匀浆是组织破碎的常选方法。其原理是通过固体剪切力破碎细 胞,使细胞中的多肽或蛋白质进入溶液中,以便后一步的提取。匀浆器有内切式 组织匀浆器、玻璃匀浆器、刀片式组织破碎匀浆器和用于大规模生产的压匀浆器 四种类型。 酶解:酶解法就是利用生物酶将细胞壁或细胞膜消化溶解掉,使细胞内容物 释放出来。用此法裂解细胞时应根据样品的细胞结构和化学组成来选择合适的酶, 酶解时要控制温度、和酶的用量。该法专一性强,操作条件温和,回收率也高。 近年来,酶解方法己广泛应用于蛋白质或多肽的溶解。李妍【】等人用酶解法制备 乳清蛋白多肽,张玲华】等人用酶解法制备大豆蛋白多肽,皮钰珍【用双酶水解 法制备鹿胎盘活性多肽都取得了成功。 此外还有超声波破碎、珠磨法、冻融法、渗透压冲击法等。 .提取 提取是在分离纯化之前将经过溶解的细胞置于溶剂中,使被分离的生物大分 子充分释放到溶剂中,并尽可能保持其原来的状态,不丢失其天然活性的过程。 蛋白质和多肽一般都易溶于水,稀盐溶液和缓冲液对蛋白质和多肽的溶解度大并 且稳定。提取时要注意盐浓度、温度和等因素的影响。对于难溶于水、稀盐、 稀酸或稀碱中的蛋白质或多肽,常需用不同比例的有机溶剂提取。常用的有 机溶 剂有丙酮、异丙醇和正丁酮等,这些溶剂可以与水互溶或部分互溶,同时它们 有 亲水性和亲脂性,因此常用来提取含有非极性侧链的蛋白质或肽类。 七、活性肽的分离纯化方法 采用何种方法分离纯化活性肽取决于它的理化性质,常用的方法有透析法、 超滤法、电泳法、柱层析法、高效液相色谱法等。 .透析法 葛瑞宏等用透析法分离出了羊胎盘肽, .用透析法从蛋白质和 多肽的混合液中将它们进行了成功的分离。 .超滤法 周国华,浩洪龙【等采用超滤法从牛和羊的胎盘中分离到了胎盘肽, 等利用超滤膜技术,在线透析改变缓冲液的条件,大大缩短了分离纯化 的时间。 .电泳法 电泳就是利用在电场作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质,以及分 子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样 品 进行分离鉴定或提纯的技术。蛋白质电泳分为聚丙烯酰胺凝胶电泳、等 电聚焦电泳、毛细管电泳、双向电泳等技术。 .色谱分离技术 .从家蚕的丝素中分离纯化出了丝素 倪莉【采用凝胶过滤色谱 肽。亲和色谱是根据连接在固定相上的配基与其作用的配体之间的特异亲 和性的差异而分离物质的层析方法。对生物活性肽类物质分离,目前主要应用其 单抗或生物模拟配基与其亲和。掣利用亲和色谱柱分离纯化出了组织血浆 纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽。 固定金属亲和层析是近年来发展起来的一种亲和方法。此柱可通过配位键鳌 合侧链含有、、、、和;肽,纯化效果也较好。蛋白均用 此方法分离到纯度较高的产品。 离子交换色谱是按物质所带电荷的差异而加以分离的一种方法,可分 为阳离子交换色谱与阴离子交换色谱两大类。根据所需分离的多肽类物质的性质 选择适宜的离子交换剂与洗脱条件,对分离效果影响最大的两个因素是洗脱剂的 值和离子强度。 高效液相色谱是世纪年代末发展起来的新型分离分析技术,它的出现为 肽类物质的分离提供了有利手段。近年来,被成功用来分离、鉴定和纯化及 制备生物活性肽。分离效果好,速度快,样品容量大,回收率高,尚庆坤【】 应用制备型高效液相色谱技术,分离虻虫中的多肽组分,收集了种纯度较高的主