为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!

人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化干预作用研究(可编辑)

2017-11-27 40页 doc 69KB 16阅读

用户头像

is_637320

暂无简介

举报
人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化干预作用研究(可编辑)人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化干预作用研究(可编辑) 人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维 化干预作用研究 徐州医学院 硕士学位论文 人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化的干预 作用研究 姓名:卜林 申请学位级别:硕士 专业:内科学(肾脏病学) 指导教师:尹忠诚;孙东 2012-05徐州医学院硕士学位论文 人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维 化的干预作用研究 中文摘要 目的 建立小鼠单侧输尿管梗阻 ,模型,观察 . 外源性人羊水干细胞 ,移植对...
人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化干预作用研究(可编辑)
人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化干预作用研究(可编辑) 人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维 化干预作用研究 徐州医学院 硕士学位 人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化的干预 作用研究 姓名:卜林 申请学位级别:硕士 专业:内科学(肾脏病学) 指导教师:尹忠诚;孙东 2012-05徐州医学院硕士学位论文 人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维 化的干预作用研究 中文摘要 目的 建立小鼠单侧输尿管梗阻 ,模型,观察 . 外源性人羊水干细胞 ,移植对 小鼠肾脏微血管损伤及继发低氧的干预作用以及对肾小管上皮 细胞的增殖和凋亡 的影响,探讨移植对肾脏血管新生的影响及改善。肾刚质纤维化的作用及机 制,旨在为肾脏纤维化的干细胞治疗提供新的方法和思路。 方法将从北京中科院干细胞库购买到的羊水干细胞种子细胞复苏后,培养至第 代时,免疫荧光及免疫细胞化学方法鉴定其表达干细胞表面标志物一,采用 .荧光标记后备用。雌性裸小鼠只,随机分为组:正常对照组、 单侧输尿管梗阻模型.生理盐水组、单侧输尿管梗阻模型.羊水干细胞移植 组,每组各只。各组小鼠均行左侧输尿管结扎术,正常对照组 不对小鼠做任何处理。模型建立后,即通过尾静脉向组和组小鼠体 内分别注射等量生理盐水和。各组小鼠分别于术后第、、、天处死, 收集静脉血和肾脏标本。全自动血生化分析仪检测。肾功能指标血肌酐 ,和尿素氮 ,;冰冻切片行荧光共聚焦显 微镜观察在肾组织中的定植;及染色观察肾组织病理改变; 免疫组化和免疫印迹检测血管内皮细胞生长因子 ,、低氧诱导因子. ,、转化生 长因子一 .,.的表达;通过免疫组化 观察管周毛细血管 ,密度的变化;通过、 和染色观察肾小管上皮细胞增殖和凋亡情况。 徐州医学院硕士学位论文 结果 .细胞培养至第代时,免疫细胞化学示.;。荧光标记后 的荧光显微镜下可见胞浆内有红色荧光。.羊水干细胞的移植后定位:在 移植后第天,梗阻侧肾脏冰冻切片荧光仍可见.细胞存在。.、 染色观察肾脏基本组织结构示:组各时间点小鼠肾组织结构形态『常, 而各组出现不同程度的肾小管扩张、萎缩、空泡变性,炎症细胞浸润,间质 增宽,随着梗阻时间的延长,间质纤维化程度逐渐加重。但组小鼠梗阻侧 肾脏各时间点病理改变均较组减轻,差异均有统计学意义.。.免疫 组化和免疫印迹结果显示:组和组密度在第、、天较同期 对照组表达明显减少,组较同期组相比,表达明显增多,差异 有统计学意义尸.。第天时,组和组表达呈轻度增高 趋势,随梗阻时间的延长,各组的表达降低,而组较组 改善明显,差异均有统计学意义.。组和组.的表达在 、、天均较同期对照组显著增加,但组表达明显低于组,差异 均有统计学意义.。组和组.的表达在第、天均 较同期对照组显著增加,但组表达明显低于组,差异均有统计学意 义.。.血生化检测结果显示:各时间点组、组和组小 鼠血清肌酐值、尿素氮值差别不大,差异无统计学意义尸.。.、 和染色结果示:组和组在、、天的细胞增殖数量均较 同期对照组显著增加,而组较同期组增加明显,差异有统计学意义 .。组和组在、、天的细胞凋亡数量均较同期对照组显 著增加,但组较同期组明显减少,差异有统计学意义.。 结论 .模型小鼠存在肾脏微血管损伤及其继发引起的组织缺氧,而 密度下降,会使组织缺氧加重。损害引起的缺血缺氧与肾间质纤维化密切相 关。小鼠肾脏表达下降可能是肾脏损伤的原因。 .移 植可以定位到受损‘肾组织,其保护机制可能是通过提高。肾脏的表达、促进 肾脏血管新生、减少肾脏. 【及.的表达,促进肾小管上皮细胞增殖、 徐州医学院硕士学位论文 减少凋亡,从而改善肾间质纤维化。 关键词人羊水干细胞;单侧输尿管梗阻;管周毛细血管;’肾间质 纤维化徐州医学院硕士学位论文 ? ,. , . , ,, . ,. / , :,? , ,., , . ,., , . . ..? , 【. 徐州医学院硕士学位论文. 、 一: , . .. , ., , , ,,..、.,.. ., ? ,.. , 一 ,, 一,.. ,, ,.. ,..、 ,,. ,.., ,., ,。. 徐州医学院硕士学位论文 . .., , ? , , , ’ ; ;; 徐州医学院硕士学位论文 缩略词表 缩略词 英文全称 中文全称 成体干细胞 尿素氮 慢性肾脏病二氨基联苯胺 双蒸水 ?? 上皮细胞一间充质转分化内皮祖细胞 胚胎干细胞 ‘ 人源羊水干细胞?’’??‘ . 苏木素一伊红 . 【 . 低氧诱导因子一 一 【 免疫组织化学 间充质干细胞 光密度磷酸盐缓冲溶液 管周毛细血管 徐州医学院硕士学位论文 。。‘。 血管紧张素. .系 肾间质纤维化 血肌酐 转化生长因子. 单侧输尿管梗阻 血管内皮生长因子 徐州医学院硕士学位论文 ??一 日 舌 慢性‘肾脏病 ,作为全球主要的公共健康问题,严 重危害人类的身体健康【,。近年来国内外有关资料显示,的发病 率和患病率 均明显上升。既往研究多注重于肾小球硬化在进展中的作用,然而, 等【,峙旨出,肾间质纤维化 ,是肾小球疾病中的相 对独立事件”,其程度与。肾功能减退的相关性比肾小球硬化与肾功能减退的相关性 更为密切。刈质纤维化是进展的共同途径和最终结局,因此延缓和防治肾脏 纤维化是防治进展的关键。尽管为寻求有效的治疗的方法付出了很大 的努力,但是需要透析和肾移植的患者数量仍在持续增加。此外,治疗手段的有 限和供体肾脏的缺乏,均使得寻求有效治疗的新方法迫在眉睫。 治疗性干细胞的研究是当前再生医学和修复医学领域中的热门话题。近年来, 在治疗肾脏疾病的过程中,干细胞已经成为具有应用前景的治疗手段之一】,它 为肾脏病的治疗开辟了新的道路。然而,研究表明,不同来源的干细胞在临床应 ,和胚胎干细胞 用中均存在其优势和缺陷。成体干细胞 ,的应用均存在很大的局限性四。确切来讲, 不容易获得,而且不能有效的传代培养;的应用则存在伦理学争 议及致瘤性 【】。尽管脐带血 ,已被证实可以作为胚胎间充质干细 胞的来源,但是其中的问充质干细胞含量较低旧。在此前的研究中四,我们发现 ,移植入模型小鼠的肾脏后 将内皮祖细胞 能减轻梗阻侧的肾间质纤维化,然而,的分离和培养很困难。近来有报道称, 肾脏自体干细胞能够取代受损的肾小管上皮细胞【,然而,同其他器官相比,肾 脏的再生能力较弱【”】。因此,必须寻找一种能够应用于治疗的人类干细胞新来源。 。来源于羊水的干细胞可 羊水通常应用于产前诊断,其中含有多种细胞类型【 通过妊娠中期羊膜腔穿刺获得,不会对胎儿造成损害,且通过诱导后可以向个徐州医学院硕士学位论文胚层分化。羊水干细胞 ,的多能性介于 和之间,%以上的表达转录因子.,它是被公认的多能干 细胞标志物‘ 】。由于具有容易获得、在体外增殖迅速、培养过程中不需要饲养 层细胞、低致瘤性和不涉及伦理学争议等优点,已经成为细胞治疗领域中 颇有前景的干细胞源【】。之前的研究证实,有助于不同类型肾损伤后的 , 修复。等【峙艮道称,同间充质干细胞 相比,具有更强的抗肾小管细胞凋亡的作用。 模型是公认的研究肾间质纤维化的经典模型,被越来越多的研究应用 。因此,本研究中我们亦以模型裸小鼠为研究对象,以肾小管周围毛细血 管 ,密度、血管内皮生长因子 、转化 ,、低氧诱导因子.. .,. 生长因子 ?,以及。肾小管上皮细胞的增殖 和凋亡情况为观察指标,研究移植对‘肾脏血管新生及肾间质纤维化的影响 并探讨其作用机制,并提出移植能够促进肾脏血管新生,促进肾小管上皮 细胞增殖并阻止其凋亡加剧,.进而减轻肾脏纤维化的假说。我们推测,移 植有可能改善肾脏的缺血缺氧状况,促进。肾小管上皮细胞增殖并阻止其凋亡加剧, 进而延缓其慢性纤维化的进程,旨在为临床治疗提供有效的策 略。 徐州医学院硕士学位论文 和方法 材料 .试剂: ?培养基 公司 胎牛血清 进口分装 胰蛋白酶 美国公司 培养板及培养瓶 美国公司 ?分子探针 美国 公司 抗.兔多克隆抗体 北京博奥森生物技术有限公司 抗兔多克隆抗体 武汉博士德有限公司 抗兔多克隆抗体 武汉博士德有限公司 公司 抗. 【兔多克隆抗体 美国 公司 抗.兔多克隆抗体 美国 武汉博士德有限公司 兔多克隆抗体 美国 公司 公司 抗兔多克隆抗体 美国 凋亡检测试剂盒 上海碧云天生物技术研究所 北京中杉金桥有限公司 标记山羊抗兔抗体 兔二步法检测试剂盒 北京中杉金桥有限公司 显色试剂盒 北京中杉金桥有限公司 北京中杉金桥有限公司 枸橼酸盐缓冲盐溶液 北京中杉会桥有限公司 福州迈新生物技术不发有限公司 染色试剂盒 /显色试剂盒 上海碧云天生物技术研究所徐州医学院硕士学位 论文 上海碧云天生物技术研究所 裂解液 试剂盒 上海碧云天生物技术研究所 .主要仪器: 倒置显微镜 日本奥林巴斯公司 日本奥林巴斯公司 显微镜 .、、、 微量移液器 德国公司 上海雷磁公司 .精密计 型微量电子天平 上海精科天平厂 。孵育箱 公司 高速低温离心机 公司 摄像系统 日本公司 .型双目光学显微镜 日本公司 .冰箱 日本公司 微波炉 广东顺德格兰士电器有限公司 枪式电动匀浆器 美国 公司 型电泳仪 北京六一仪器厂 .电泳槽 美国伯乐公司 .转膜仪 美国伯乐公司 . .数显电热恒温水温箱 上海跃进医疗器械厂 一水平摇床 北京市六一仪器厂 型病理漂烘仪 常州市中威电子仪器厂 石蜡切片机 . .型电脑自动组织脱水机 常州市中威电子仪器厂 微量加样器 上海大龙医疗设备有限公司 .冰箱 美国公司 分光光度计 日本岛津公司徐州医学院硕士学位论文 防脱玻片 北京中杉金桥有限公司 超净操作台 苏州净化设备公司 .免疫印迹相关试剂的配制 .. 电泳缓冲液 ,.?. 试剂 剂量 浓度 . . . .% ..半干转缓冲液 ,... 试剂 剂量 浓度 . .% ..洗液 ,. 试剂 剂量 浓度 . ...% ..,. 剂量 浓度 试剂 ....封闭液 脱脂奶粉 徐州医学院硕士学位论文 方法 . 细胞培养、鉴定 .. 培养 将从北京中科院干细胞库购买到的羊水干细胞种子细胞复 苏后,离心并加入 .培养基,其中含%胎牛血清、/碱性 成纤维细胞生长因子、/谷氨酰胺、%双抗,轻轻吹打混匀制成 单细胞悬液后,接种到的培养瓶中,置于。、%的温箱中培养,待 细胞达到.%融合后,用.%的胰酶.消化,按:传代培养,每~ 更换一次培养基。传至第代时,进行干细胞特定标志物鉴定。根 据 等方法,取第代细胞接种到孔板,待细胞生长至%融合时用%多 聚甲醛室温固定细胞,洗涤次×,用.%.通透化处 理,然后用室温漂洗次×,后用含%山羊血清的封闭液封闭 ;加入兔抗人.多克隆抗体工作浓度为:为一抗,。 呼育过夜; .%的室温漂洗次后滴加标记的山羊抗兔二抗工作浓度 为:,室温孵育小时以上,再用.%的.室温漂洗次,荧光显 微镜下观察干细胞基因表达情况。 .. 生长曲线测定原代培养细胞达%以上融合后,液洗涤,胰 酶消化传代,并标记为。取生长状态良好的第代细胞,用胰酶消化后,制备 成单细胞悬液,调整细胞浓度为.×个/,接种到孔板上,每孔., 置于。、%的培养箱中继续培养,隔天换液。从第天起每隔随机取 孔细胞进行计数,计算:细胞数大格细胞数之和/××稀释倍数。取其 平均值作为当天观察到的细胞数,绘制细胞生长曲线并不同培养时间下细胞 的镜下特点。以时间为横轴,以细胞数量为纵轴,绘制细胞生长曲线。 .. .标记取生长状态良好的第代细胞,.%的胰酶. 消化后,转离心,弃去上清液,调整细胞悬液密度为./,加入 /的.工作液,。孵育,。孵育,洗涤次备用。 .. .标记的检测将细胞用.%的胰酶.消化,洗涤, 徐州医学院硕士学位论文 转离心,洗涤次,按..步骤标记细胞,将培养基重悬的细胞滴至玻 片上注意避光,在荧光显微镜下观察细胞的荧光标记情况。 . 实验动物 选用雌性裸小鼠只,?周龄,体重为.,由徐州医学院实验动物 中心提供,整个实验过程均在实验动物中心屏障系统中进行。实 验期问自由饮水、 摄食,饲料为徐州医学院实验动物中心提供的无菌饲料,适应性 喂养周后进行 实验。只雌性裸小鼠随机分为组,『常对照组、单侧输尿管梗阻 模型. 生理盐水组、单侧输尿管梗阻模型.羊水干细胞移植组,每组各 只,每组又分为个时间点天、天、天、天,每个时间点只动物。 .动物模型的建立 按照】等人的方法制备模型。 %水合氯醛./腹腔注 射麻醉小鼠后,将其仰卧位固定后暴露腹部,常规各皮并用碘伏 消毒。取左侧旁 正中切口剪开腹壁,暴露左侧输尿管,在其中上/处小心游离输尿管,号丝线 结扎后,在其间剪断输尿管以防逆行性感染,然后关闭腹腔。组每只小鼠 同时经尾静脉注射细胞总数为. 个的.标记过的细胞悬液; 组注射生理盐水;『常对照组不对小鼠做任何处理。各组小鼠分别于术后第 、、、天处死,收集静脉血,切除左肾,冷生理盐水冲洗干净,取部分肾组 织置于%中性福尔马林固定,部分肾组织置于.。保存备用。 .血生化检测 术后第、、、天各组随机处死只小鼠,每只取静脉血,在高速离 心机上离心,吸取血清,在全自动生化分析仪上检测血清尿素氮 ,。 ,、肌酐 . 肾脏病理检查 常规石蜡包埋,组织切片进行苏木素一伊红?,、 染色,光学显微镜观察。 .. 染色徐州医学院硕士学位论文 标本石蜡包埋,连续切片,厚度。贴附于载玻片上,。烤箱烘烤 小时。 常规脱蜡至水:二甲苯 ;二甲苯 ;%乙醇 ;%乙 醇 ,依次浸泡。 苏木素染色,蒸馏水洗,如染色程度合适,则置于.%盐酸酒精中分 化数 秒,蒸馏水洗。 %氨水返蓝,蒸馏水洗次。 伊红染液中浸染数十秒,光学显微镜下观察染色合适程度,蒸馏 水× 次。 梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 .. 染色 切片脱蜡处理至水。 滴加一滴复合染液试剂染色。蒸馏水冲掉染液。 滴加一滴磷钼酸试剂染色,甩干。 滴加一滴苯胺蓝试剂染色,蒸馏水稍冲。 滴加一滴分化液试剂分化秒。 无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 胶原纤维、粘液、软骨、神经纤维呈蓝色;肌肉、弹力纤维呈红 色;神经轴 索呈红色;纤维素呈紫红色;红血球呈橘红色;胞核呈蓝褐色。 染色观察切片中肾间质纤维化的程度,蓝色为胶原纤维。按照以 前的 文献的方法【】计算肾间质面积,即每个标本在高倍镜×下随机 选取个视 野,每个视野分别测量肾问质相对面积,即肾间质面积与统计场 面积的比值。 .免疫组化 组织切片进行、.、.、、及免疫组化 染色,光学显微镜下观察表达情况。 .. .染色 徐州医学院硕士学位论文 标本石蜡包埋,连续切片,厚度“。贴附于载玻片上,。烤箱烘烤 小时。 常规脱蜡至水:二甲苯 ;二甲苯 ;%乙醇 ;%乙 醇 ,依次浸泡。 双蒸水冲洗、浸泡次,每次。 %过氧化氢浸泡,消除内源性过氧化物酶的活性。 双蒸水冲洗次,每次。 .放入微波炉中高火加热, 抗原修复:将切片浸入枸橼酸盐缓冲液 大火,小火。抗原修复盒掀盖,自然冷却到室温。 ,浸泡次,每次。 磷酸盐缓冲液 每个组织滴加约,按:稀释抗体稀释液的抗体,超 过标本边缘,置于湿盒内冰箱过夜。 取湿盒至恒温烤箱,复温。 冲洗次,每次。 滴加辣根酶标记羊抗兔多聚体,孵育。 冲洗次,每次。 滴加约二氨基联苯胺,底物工作液显色, 显微镜下控制显色时『白,自来水冲洗,苏木素复染,盐酸酒精分 化,饱和碳酸锂 返蓝,常规酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 每次实验均设阴性对照。以缓冲液代替一抗做阴性对照。 .. . .染色 染色方法:一抗为:稀释抗体稀释液的. 【抗体工作液,二抗为 辣根酶标记羊抗兔多聚体,余同..。 .. .染色 . 染色方法:一抗为:稀释抗体稀释液的.抗体工作液,二抗为 辣根酶标记羊抗兔多聚体,余同..。徐州医学院硕士学位论文 .. .染色 染色方法:一抗为:稀释抗体稀释液的抗体工作液,二抗为辣 根酶标记羊抗兔多聚体,余同..。 .. 、染色 染色方法:一抗为:稀释抗体稀释液的抗体工作液,: 稀释的抗体工作液,二抗为辣根酶标记羊抗兔多聚体,余同..。 .. 染色 切片常规脱蜡至水 将一烧杯盛的. 、.的柠檬酸缓冲液,加热至。,迅 速放入切片,使用%功率、微波照射,加入双蒸水~。 作迅速冷却,将玻片移至~。。 洗×次。 。 加%正常牛血清室温 将反应混合液加在切片上,?温育。 洗×次。 %甲醇液室温阻断。 ?温育。 加转化剂,。温育。 洗×次。 显色。 苏木素淡染,常规脱水,透明,中性树胶封固 .免疫组织化学分析 免疫组化分析:根据的染色结果,每张切片随机选取个高倍 视野倍,每个视野代表.的区域面积。任何黄褐色染色与相邻微血 管分开的内皮细胞或内皮细胞簇作为一个可计数的微血管。计数 后取其平均值得 出每张切片的密度值。徐州医学院硕士学位论文 、、一免疫组化分析:每张切片随机选取个高倍视野 倍,利用. .软件计算其积分光密度值,取其平均值。、 及染色分析:随机选取个互不重叠的高倍视野,计数增殖和凋亡 细胞的阳性表达,取其平均值。 . 免疫印记 ..蛋白提取液制备 取置于一。保存待用的梗阻左侧肾组织加入裂解液,冰浴中匀浆, 以 ,离心,所得上清即为细胞蛋白提取液。 ..蛋白浓度的测定 按法,以牛血清白蛋白为品。根据样品的体积数和所测质量 数,调 整浓度为/的蛋白质悬液,体积差值以匀浆缓冲液补充,然后加入 /体 积的蛋白上样缓冲液×,密闭置于沸水中煮沸变性后置于.。保存备用。 ..蛋白免疫印迹 ... 检测 .... .聚丙烯酰胺凝胶电泳? 安装垂直电泳装置按照厂方说明书进行,并制备分离胶和浓缩胶; 灌注分离胶:小心将分离胶沿电泳装置一侧注入玻璃板上留空间为齿长度 ,以双蒸水 ,封顶,待分离胶完全聚合后约 倾倒出覆层液体,用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺, 用吸水纸吸净残留液体; 灌注浓缩胶:将配置好的浓缩胶注入玻璃板内分离胶的上部中间,小心插入 梳子,待浓缩胶完全聚合后约拔出梳子; 样品上样:将凝胶固定于蛋白电泳槽内,加入×.甘氨酸电泳缓冲液,排 出凝胶底部玻璃板之间的气泡和未聚合的丙烯酰胺。加样前先将样品在沸水中煮 沸片刻使蛋白质充分融化和溶解,小心按预定顺序加样每孔含总蛋白, 为避免电泳的边缘效应,凝胶两侧的加样孔加入等体积的废样,蛋白质同 徐州医学院硕士学位论文 时上样电泳; 垂直电泳恒定电压:将电泳槽与转移电泳仪相连,凝胶初始所加电压为 /,当样品电泳至浓缩胶和分离胶交界处,将电压调整为/ ,继续电泳直至溴酚蓝到达底部停止电泳,关闭电源卸下玻璃板,取出分 离胶。 ....蛋白质转膜半干转 准备的硝酸纤维素膜 ,膜张及相 应大小的滤纸张; 将膜和滤纸浸入半干转电泳缓冲液中; 裁剪分离胶距分离胶和浓缩胶交界线.处下裁,按照阳极 一滤纸?膜一凝胶一滤纸阴极的顺序逐层安装半干转电泳转移装置,注意 尽量排除每层之间所有气泡; 半干转电泳恒定电流:将电转仪与电源连接,在恒定电流条件 下进行转膜。 ..... 检测蛋白 取出膜放入平皿中,加入封闭液 ,置于脱色摇床上室温振摇小 时或者放置于。过夜; 回收封闭液,加入一抗:置于脱色摇床上室温振摇小时或 者放置于过夜; 回收一抗,加入洗涤缓冲液振摇洗涤×次,加入酶标碱性磷 小时: 酸酶标记山羊抗兔二抗,置于。 回收二抗,加入洗涤缓冲液振摇洗涤次, 振摇 洗涤; 弃,加入显色缓冲液, ,混匀后加入 ,常温 振摇显色,反应达到要求后流水洗涤终止反应。 所得显色条带经图象处理仪行激光扫描图象保存。 徐州医学院硕士学位论文 ...检测. 一抗为:稀释抗体稀释液的一 【抗体工作液,二抗为碱性磷酸 酶标记山羊抗兔抗体,余同...。 ...检测? 一抗为:稀释抗体稀释液的.抗体工作液,二抗为碱性磷酸 酶标记山羊抗兔抗体,余同...。 . 分析 用 医学图文分析系统分析图像,测定其光密度 , 值。以为参照,测定上述蛋白的相对表达量。 .统计学处理 采用.统计软件,计量资料用均数士标准差描述士;组间均数比 较采用单因素方差分析。以.为水准,当.时,差异有统计学意义。徐州医学院硕士学位论文 结 果 的培养、鉴定及标记 倒置显微镜下观察可见,大多呈长梭形或针尖状,部分呈多角形和圆 形,细胞核较大,居中,有时可见双核,呈圆形或椭圆形,核仁明显,细胞分布 均匀。此后,随着细胞增殖,集落出现融合,排列无明显方向性,呈漩涡状或火 山口状生长图,,。 细胞培养至第代时,消化贴壁细胞,用干细胞首要标志物一对贴壁细胞 进行免疫细胞化学染色,镜下可见细胞胞浆内红色荧光,证明培 养的细胞为 图。 .标记的荧光显微镜下检测结果可见细胞胞浆内有红色荧光, 说明已经被.标记图。移植后第天,共聚焦倒置显微镜 下仍可见.阳性细胞存在图。 生长曲线测定 生长曲线呈形,接种后~为潜伏期,细胞生长缓慢,可见少许 分裂相细胞;第起进入对数生长期,维持~,此期可见分裂相明显增多, 细胞出现伸展增殖;第一达到高峰,以后进入平台期图。 小鼠的一般状态观察 组小鼠进食可,精神及灵活性较好。组小鼠一般状态恶化,活动明 显减少、进食少,精神及反应性灵活性均较差。与组小鼠比较,移植 组小鼠一般状况明显好转,活动增多,进食亦增加。 梗阻侧肾脏外观的改变 解剖后可见组小鼠肾脏大小形态基本正常,颜色暗红,质地均匀,皮髓 分界清晰。各组小鼠可见梗阻侧肾脏均明显增大,肾盂肾盏明显变形扩张, 肾脏缺血变得苍白,皮质缺血受压变薄,皮髓分界不清,且随造模时间延长上述徐州医学院硕士学位论文 改变逐渐明显。至第天时左肾几乎失去『常外观,胞膜紧张呈半透明状,内见 淡黄色半透明液体充盈,剖开后见内容物流出,仅剩极薄一层,质韧,且肾盂肾 盏结构消失,表明模型建立成功。 血生化检测结果 、、、天各时间点组、组及组小鼠值、值 差别无统计学意义.,表。 肾脏病理改变 和染色结果图,表显示:组各时白点小鼠肾组织结构 形态『常,而各组出现不同程度的肾小管扩张、萎缩、空泡变性,炎症细胞 浸润,间质增宽,随着时间的延长,质纤维化程度逐渐加重。但组小鼠 左肾各时间点病理改变均较组减轻,差异均有统计学意义尸.。 免疫组化和免疫印迹 . 免疫组化和免疫印迹 免疫组化图,表结果显示:免疫组化染色棕黄色细胞作为阳性 表达细胞,组肾脏表达丰富,主要表达于集合管上皮细胞和肾小球足 细胞,特别是近髓及髓放线处的肾小球足细胞及小管上皮细胞, 部分内皮细胞也 可表达,胞浆着色。组及移植组第天较同期对照组表达轻度增高, 但差异无统计学意义扮.。随造模时间的延长,组及组第天、 天和天表达较同期组明显减少,但组较同期组表达 检测分析 增多,值比较差异有统计学意义.。蛋白 图也证实,随着梗阻时间的延长,组及组表达较同期 组明显减少,但组较同期组表达增多,差异有统计学意义 .。 . .免疫组化和免疫印迹 免疫组化结果显示图,表:组各时问点肾小管上皮细胞仅有微弱 .表达,部位主要位于皮髓交界处的近曲小管上皮细胞。术后第天, 三个徐州医学院硕士学位论文 实验组。表达无明显差异.。术后第天,组、各组肾 小管上皮细胞. 【表达开始增加,随梗阻时间的延长,.表达进一 步增强, 与同期组相比差异有统计学意义.,但组较同期组表达 减少,值比较差异有统计学意义尸.。.免疫印迹图与免疫 组化具有相似的变化趋势,与同期组相比,组.蛋白表达水平 明显减少,差异有统计学意义.。 . .免疫组化和免疫印迹 免疫组化结果显示图,表:组肾小管上皮细胞胞浆内可见少量. 阳性染色。术后第天,组和组一在肾小管上皮细胞胞浆中的 表达明显增多,随梗阻时间的延长,.表达进一步增强,与同期组 相比 差异有统计学意义.,但组较同期组表达减少,值比较 结果与免疫组化具有相 差异有统计学意义.。.免疫印迹图 似的变化趋势,与同期组相比,组.蛋白表达水平明显减少, 差异有统计学意义尸.。 . 免疫组化 免疫组化图,表结果显示:蛋白阳性表达为黄褐色,位于 的内皮细胞胞膜、胞质。组表达丰富,分布均匀,显示相同的尺寸 和形态,在大部分问质中规律排列。各组病变呈局灶性分布,随造 模时 间延长,密度逐渐降低,排列紊乱。术后第天,组和组 指数较组开始减少,随梗阻时间延长,表达进一步减少,与同期 组相比差异有统计学意义尸.,但组较同期组表达增多, 密度值比较差异有统计学意义尸.。 . 、和染色 增殖染色、染色图,,和凋亡染色图 ,结果显示:组和组在第、、天的细胞增殖数量均较 同期对照组显著增加,而组较组同期增加明显,差异有统计学意义 徐州医学院硕士学位论文 尸.。组和组在、、天的细胞凋亡数量均较同期对照组显 著增加,但组较组同期明显减少,差异有统计学意义尸.。徐州医学院硕士学位论文 论 讨 近年来,慢性。肾脏病已被公认为主要的公共健康问题。有研究表明, 也是心血管疾病【】和脑中风发作‘的高危因素。因此,研究和寻找新的有效 治疗的方法至关重要。间质纤维化是进展的共同途径和最终结局。目前 的研究证实,肾脏问质纤维化程度与‘肾功能减退的相关性,比。肾小球硬化与肾功 能减退的相关性更为密切,且成为’肾小球疾病中的“相对独立事件”。多种机制参与 肾脏纤维化的发生与发展,主要包括系膜细胞、成纤维细胞活化,上皮.间充质转 ,,单核、淋巴细胞浸润,细胞凋亡 分化 和众多的促纤维化因子参与。针对这些机制建立的临床干预方法延缓了的进 展,但不能完全阻止发展至终末期肾脏病。因此,研究和寻找防治 肾脏纤维化的新靶标以及改进当前的治疗方法对于进一步改善患者的预后至 关重要。 近来的研究表明,慢性缺氧和小管间质损伤是引起肾脏纤维化的主要因素, 而’肾脏微血管损伤是引起慢性缺氧和小管间质损伤的重要原因。等‘‘研究 发现肾脏微血管病变导致的功能丧失及其数目的减少与肾问质纤维化程度高度正 相关。人类和动物模型也显示广泛的小管损伤、问质纤维化与管周毛细血管的丢 失关系密切。 近年来,干细胞被应用于肾脏损伤后的治疗。大量的研究表明,充质干细 胞有助于肾脏受损后的修复【,卜。然而,目前将这些细胞应用于人类尚 存在伦理学和政治上的阻碍【】。同其他种类干细胞相比,羊水干 细胞具有很大的 优势,并且正成为应用于临床的新的干细胞源【 。本实验,我们重在研究 移植在肾脏血管新生及改善肾间质纤维化中的作用及其机制。 损伤可导致肾小管血供减少【。本实验中,我们通过免疫组化计 数来衡量的形态和密度。是一种高度糖基化的型跨膜蛋白,主要在血 徐州医学院硕士学位论文 管内皮细胞表达【。在血管内皮细胞标记物中,更具有敏感性和特异性,且 易于观察。抗原在血管形成期间参与了内皮细胞的粘附和/或转移;同时它还 能加速血管内皮细胞聚集成血管?,所以染色阳性可以代表内皮细胞 走行。抗原的表达水平会随着幼稚细胞的分化成熟而逐渐下降,故的 高表达既反映密度的增加,又反映了新生内皮细胞的大量产生。本实验结果 显示,各组病变呈局灶性分布,随造模时间延长,密度逐渐降低, 排列紊乱。术后第天,组和组指数较组开始减少,随梗 阻时间延长,表达进一步减少,但组较同期组表达增多,表明 移植有助于受损肾脏微血管内皮的修复。 肾组织切片和染色结果显示,随着梗阻时间的延长,肾问质纤维 化面积逐渐增大,而移植组肾小管形态结构明显好于模型组,问质 纤维化相对面积明显降低,进一步从形态学角度证明了移植可以改善 小鼠肾脏病理损害,减轻问质纤维化。 属多潜能细胞因子家族中的一员,它是目前已知的促进血管新生作用最 显著的因子,在『常的肾脏生理和病理状态中,扮演着重要角色。近年来研究发 现,能够减轻炎症造成的肾小球损伤‘,促进肾小球毛细血管的修复并阻 止肾脏病的进展】。本研究结果显示,随着肾脏损害的进展,组和 组的蛋白表达总体上进行性减少,但组较组减少更为显著。 组和移植组在术后第天蛋白的表达轻度增高,可能为机体 的代偿反应,早期表达和分泌增高有利于受损微血管的修复。有研究证明, 可以分泌,和.等生长因子【】,因此组蛋白 表达水平的减少可能是多种因素共同作用的结果,包括缺氧和。的表达【】。 麻艳艳等【在内皮祖细胞改善肾脏纤维化一文中指出,自身可分泌等 细胞生长因子从而促进血管新生。本实验表明,移植有助于肾脏血管新生, 然而自身是否可以分泌等细胞生长因子以促进新生血管形成还有 待进一步研究。徐州医学院硕士学位论文 低氧是导致血管生成失调的一个重要因素。损伤可导致慢性局部缺血和 低氧出现【,进而促进纤维化进展【】。低氧诱导因子一的【亚单位 ?,?是迄今为止发现的唯一一个在缺氧状态下发挥活性的 特异性转录因子,是细胞低氧的可靠标记物,是反映低氧状态的一个敏感指标‘, 细胞内氧浓度对.的表达进行着精细的调节,随着氧浓度的下降,其表达增 加,并且表现在多个水平上,包括转录水平和蛋白水平,但主要是蛋白水平的改 变‘。本研究结果显示,对照组. 几乎无表达,相反,随着梗阻时间的延 长,病变进展延续,组和组的一?蛋白表达增强,而移 植组.仅的表达量较同期组明显减少。因此,本实验表明移植 有助于改善小鼠肾小管间质缺氧状态。 一,是公认的最重要的 转化生长因子. 致纤维化细胞因子,在肾间质纤维化进展过程中起着重要作用【?。进展的最 终结局是肾功能下降以及肾脏进行性硬化。研究证实,一旦肾实质大量丢失,血 管紧张素.醛固酮系统? ,即被激活,进而诱 导.和细胞外基质产生【,进一步加重肾实质的损害及丢失。本实验结果显 示,组和组.蛋白在肾小管上皮细胞胞浆中的表达较对照组明 显增多,且随梗阻时间的延长,.表达进一步增强,但组较同期 组表达减少。 本研究中,我们以血清肌酐和尿素氮值来评价组小鼠的。肾功能变化。血尘 化检测结果显示,各时间点小鼠的血清肌酐和尿素氮值在各组比较中差别不大, 无统计学意义,考虑可能与损伤后非梗阻侧。肾脏代偿有关【。 本研究中,我们以裸小鼠为研究对象,以避免或减少注入小鼠体内 后引起的排斥反应。裸小鼠为免疫缺陷鼠,它们缺乏淋巴细胞,然而淋巴细 胞和细胞均正常,这就保证在受到外界刺激时裸小鼠仍具有一定的免疫能力 。在将注入小鼠体内之前,我们用.标记以示踪其在一肾脏内的定 位。冰冻切片染色显示,在术后第天,仍可见到.阳性细胞存在,且主徐州医学院硕士学位论文 要定植在肾小管上皮和问质中,这表明,经体外注入的能够到达梗阻侧 的肾脏并且在其中定植【?。 此外,我们在研究中通过观察肾小管上皮细胞的增殖和凋亡情况来评价 对受损肾脏的治疗作用。结果显示,可以促进肾小管上皮细胞的 增殖,阻止其凋亡加剧。我们推测这种作用机制可能与旁分泌作用有关, 但仍需进一步研究。 不同种类。肾脏损伤的修复机制各异。有报道证实,将注入受损的肾脏 后会引起炎症细胞因子的产生增加,从而改善急性损伤状态【】。在缺血诱导的小 。此 管损伤模型中,肾脏固有内皮细胞的增殖被认为是参与其修复的主要机制‘ 外,旁分泌作用已被证实参与了急性肾损伤的修复四。然而,肾脏受损后的具体 修复机制尚待进一步研究。 在此订的研究中【,我们将移植入模型小鼠体内,结果证明,梗 阻侧肾问质纤维化得到了减轻。在本实验中,我们发现与相比,有 着更强的修复肾脏微血管的能力,而且问质纤维化程度较减轻,表明 有着比更大的临床应用潜能。等‘也指出,同相比, 可以改善受损肾脏的形态和功能,具有更强的抗凋亡作用。 综上所述,小鼠模型存在肾脏微血管损伤及其继发引起的组织缺氧, 移植可以通过增加密度和蛋白表达,下调.仪和一 蛋白表达来延缓肾间质纤维化的进展,达到治疗的目的。此外,移植还可 以促进肾小管上皮细胞的增殖和阻止其凋亡加剧。因此,我们推测,能够 为临床治疗慢性肾脏病及其他脏器疾病提供一个有效的治疗策略。徐州医学院硕士学位论文 结 论 本实验条件下 .模型小鼠存在。肾脏微血管损伤及其继发引起的组织缺氧,而密度下降, 会使组织缺氧加重。 .损害引起的缺血缺氧与肾问质纤维化密切相关。小鼠肾脏表达 下降可能是肾脏损伤的原因。 .在小鼠肾问质纤维化过程中,经尾静脉注射的可以定位到梗阻 侧 肾脏,从而延缓间质纤维化的进展。其机制可能是通过提高表达、 改善 损伤、下调一和.表达引起。 .可以通过促进受损肾小管上皮细胞的增殖以及阻止其凋亡加剧 来实现 对受损肾脏的修复。 徐州医学院硕士学位论文 论文图表 麓芬。? , , 、 。 ,??二.一、 。‘/,一 \‘、 ,/ .\ ’\ ’..: .,.’. ‘ ,一一’’,/二:??~~ 菩一敏鬻越 ,,醅憨 、.譬 图.的培养、鉴定和标记。第代高倍镜下形态.细胞呈 长梭状,细胞核较大,有时可见双核.培养天后形态×.细胞形态 呈针尖状,生长无明显的方向性。 培养天后形态×.细胞密度增加, 呈火山口状或旋涡状生长。表面标志物染色×.细胞表达千细胞首 要标志物一。 ?标记.移植肾组织冰冻切片免疫荧光双染 ×.第天仍可见?阳性细胞定位于梗阻侧肾脏。徐州医学院硕士学位论文 嘲裁叠景 .一×坊怒弧一一 培养时问图 生长曲线。生长曲线呈形,接种后~为潜伏期,细胞生长 缓慢,可见少许分裂相细胞;第起进入对数生长期,维持~,此期可见分裂相明 显增多,细胞出现伸展增殖;第~达到高峰,以后进入平台期。 徐州医学院硕士学位论文 ??’。::瓣麓攀二羹。舅? 窭 疗一 。一 ?薯 协 ? ?口图各组小鼠和染色图片放大倍数均为倍。?:染色:.正常 对照组:肾小管和肾问质基本正常; .组第天:肾间质明显纤维化,绝大部分 肾小管毁损,结构消失。.组第天:肾间质纤维化有所改善,基质成分减少, 可见肾小管结构。?:染色:.对照组:肾小管、肾间质基本正常。. 组第天:肾间质纤维化明显,肾间质面积扩大,肾小管出现不同程度的萎缩与扩张。. 组第天:病变较组有所改善,部分肾小管管腔扩张,问质纤维化不明显, 有炎细胞浸润。各组小鼠肾间质纤维化面积比较?表示与同期组比较., 表示与同期组比较.。徐州医学院硕士学位论文 一 ..:. ,. ‘ .‘ ’ .’巴:气。、冬 . 。~, .. :、‘? ’ ?:??『: ’、, ~’? 鍪鬻? 夏 ????????????一一???????????????????????????????? 【堡垒堕 旦堕堕 里垒垒 墨垦一。:山 一 图各组小鼠免疫组化染色图片放大倍数均为倍。.正常对照组: 肾小管 胞浆中表达丰富;.组第天:表达明显减少。.组第天: 肾小管胞浆中表达较组明显增多。.各组小鼠平均光密度值比较 ? 表示与同期组比较氏.,拌表示与同期组比较.。徐州医学院硕士 学位论文 鬻,糍? 簿粼 囹 ? 口 ? . . ? . . ’零 ’, . ’‘ 一? 徐州医学院硕士学位论文 。.,臻.....,:., 二一鑫 匣 . ? 口 口 . . .. . .一譬卜 . . 一一 . 口.一曲.口 图各组小鼠免疫组化染色图片放大倍数均为倍。.正常对照组: 肾小管 上皮细胞、问质细胞可见?微弱表达:.组第天:?表达明显增多, 主要集中在肾间质纤维化区域和肾小管上皮细胞。.组第天:病变 较组有 所改善。一在肾问质及肾小管上皮细胞有少量表达。 .各组小鼠? 平均光密 度值比较?表示与同期组比较.,撑表示与同期组比较.。 徐州医学院硕士学位论文.’.‘、’ ‘?, ’ ?. ? . ? ? ., ? ? ? ? 。.., , ? ? ...,.. ? 。. ,.. ‘ . ? ., 、.:、. ;一.., ? . ?, . ,.? . .... ?...一.一 一一‘ . .? . ??,, ???? ? . 卜. ... ,. ?,.‘.” .彳..、.,. 、 ‖, ,..一..? ,一?.‖乏板 、 ’...、.,;.誊? .一 ,。?.:,.?泠一 同 价协.一协卜乱】空价舢?图各组小鼠免疫组化染色图片放大倍 数均为倍。.正常对照组: 大量表达,尺寸及形态规则,大部分呈规律排列; .组第天:表达 明 显减少,减少,甚至缺乏。.组第天:有较多表达,尺寸及形态 较组有所改善。.各组小鼠密度值比较?表示与同期组比较.,拌 表示与同期组比较.。 ,,..?...一。徐州医学院硕士学位论文 ?’ 一 。’ ..?。?? 鼽.’ ? ? 。,??.? .? : ?? ? ? ? ? ? ? ’? ? 、 ?. ? .。. ‘?‘ ’ ?’?? ’? 。 ?? ? ?’: ’。? ?? .: ?? ? ? ?? 。? .。? :? . ?口、? ’ ‘ ? ’一“???’? ? ..’ 、 ’ , ?? . ? 、? ? ’ ?? ? ?, ? ? ? ,??. ?? 一, . ~?.,『 ?? 、叭 ’口 ?? ? .. ‘? .’ ’? 画 ? 厘 ? ? ? ? ? ? ?一 ?? .?? ? ? 一,。’,。 ‘ ? 乏 ?? ? ???. “ 口 , ?’ ? ? ? 、? ??。 ? ? ? ? ? ? :..?芦 ? ‘ ~’ ? 一。?? ? ’ ? ? ’ ’. ? ? ?., ‘?? ?? ? ? ...一 ?、.???。 ,《’ .?, ?.一。、一 :?。 ‘, ...’?“ ..二。‘. ? ?’’ ? ’ ? ?:??:‘ ? ? 豢影 ?‘气 : 乏‘二..:一?。?’..:? ..暑:..’’.....一‘.:..“::.毒,‘.,?‘ 、??.一?、 ?::’?‘‘: 产、 文一? ..》广。、:。乙。。??、: 二 。.::?一:.:? ,?’『.?二..’,..‘:.。.。 。 . ,’ . ,?.,‘? ,:,‘。 :’。二。 ’‘。。..‘‘’, ?气~ 嚣?摹 . 图肾小管上皮细胞增殖和凋亡检测结果放大倍数均为倍。染色?, 染色?:,.对照组可见少量的肾小管上皮细胞增殖;,.组第天: 镜下可见增殖的肾小管上皮细胞较对照组增多;, 组第天:镜下 可见增殖的肾 小管上皮细胞明显增多,且多位于远端小管上皮。染色.:对照组 仅有少量的 肾小管上皮细胞凋亡;.组第天:镜下可见肾小管上皮细胞凋亡较 明显;. 组第天:镜下可见凋亡的肾小管上皮细胞较组明显减少。
/
本文档为【人羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化干预作用研究(可编辑)】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索