人胎儿毛乳头细胞在聚羟基乙酸真皮支架上的生长特性观察

人胎儿毛乳头细胞在聚羟基乙酸真皮支架上的生长特性观察 人胎儿毛乳头细胞在聚羟基乙酸真皮支架 上的生长特性观察 西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2006Aug.;27(4) 人胎儿毛乳头细胞在聚羟基乙酸真皮支架上的 生长特性观察 王洪涛,陈璧,陶克,汤朝武,胡大海 (第~--V-医大学西京医院烧伤外科,陕西西安710032) ? 论着? 摘要:目的:观察人胎儿毛乳头细胞(FDPC)在生物可降解材料聚羟基乙酸(PGA)支架材料中的生长情况.探讨其作为组织工 :将二步法培养的FDPC接种于PGA支程皮肤种子细胞和真皮支架的可行性.方法 架材料上.并在体外立体培养,不同 时间点的细胞数量.分别用相差显微镜,石蜡切片和扫描电镜观察细胞的生长状况以及细胞和组织的黏附情况.结果:PGA材 料浸提液对于FDPC生长没有抑制.FDPC与PGA的黏附率为28.6%.细胞在支架上三维立体培养符合正常生长曲线.HE染 色和电镜显示细胞生长良好,形态正常,黏附牢固.结论:FDPC与PGA具有良好相容性和黏附性,可进一步研究以PGA作为 真皮支架构建组织皮肤. 关键词:人胎儿毛乳头细胞;聚羟基乙酸;生物相容性;组织工程 中图分类号:R644文献标识码:A文章编号:1007—8622(2006)o4—024.4一O3 ExperimentalstudyongrowthcharactersoffetaldermalfolliclecellsinpolyglycoHcacid WANGHong—tao,CHENBi,TAOKe,eta1.(DepartmentofBum,XijingHospital,FourthMilitaryMedical University,710032,China) Abstract:Objective:Tostudythebiocompadbilityofpdygty'colicacid(PGA)scaffoldswithf etaldermalfollicle cell(FDPC)anditsgrowthcharactersinPGA,thenprovidethepossibilityforfabricatinglivingtissueengineering skinwithhairfollicleandPGA.Methods:FDPCswereculturedinPGAscaffolds.CeUadhesionrateand proliferationweredetected,andthemorphologicalcharacterswereobservedwithmicroscopeandSEMafter seeding.Results:CeiladhesionrateofFDPCinPGAwas28.6%.andthecellsattachedandgrewwellonthe PGAscaffolds.Conclusion:TheresultsshowthatPGAhasagoodbiocompatibilitywithFDPC.anditmaybe feasibletodeveloptissue—engineeringskin. Keywords:Fetaldermalfolliclecell;Polyglycolicacid;Biocompatibility;Tissueengineering 种子细胞和种子细胞所赖于存在的支架材料是 体外构建组织工程皮肤研究过程中的两大核心技 术.而在支架材料研究中,人工合成的生物降解聚 合物因其来源广泛,机械性能良好,没有免疫源性而 成为研究热点.本文就人胎儿毛乳头细胞(FDPC) 在可降解生物材料聚乙醇酸(PGA)上的生长特性 进行了观察,探讨其组建构成组织工程化皮肤的可 行性. 1材料和方法 1.1主要材料和试剂:可吸收性聚羟基乙酸材料 收稿日期:2006—03—18 作者简介:王洪涛(1975一),男,医师,助教,Tel:029—84775298. Email:htw22cn@163.corn (商品名:Neoveil)是由日本郡是有限公司生产,为 非编织的修补用毛毡.标本为5,7月胎龄终止妊 娠人流胎儿头皮(家属知情同意).DMEM(GIBCO USA),胶原酶(GIBCOUSA),0.25%胰蛋白酶 (SIGMAUSA),胎牛血清(杭州四季青公司),MTr (SIGMAUSA),$520扫描电镜(HITACHI,JAPAN), CO孵箱及超净工作台等. 1.2FDPC的分离培养及传代:按丁国斌方法, 用剪刀将头皮下组织层剪下,相当于毛根中下段至 毛球水平,得到包括毛球,毛球内毛乳头,毛干下端 及周围结缔组织鞘的结构,PBS洗涤2次,加人 5g/L胶原酶37cI=消化8,10h,终止消化,用PBS 反复离心洗涤,得到的组织中包括分离的毛乳头,毛 西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2006Aug.;27(4)245 干下端及残存的部分外根鞘,置含100ml/L新生牛 血清DMEM培养基中培养,接近融合时0.25%(含 0.02EDTA)胰酶消化,1/3传代培养.本实验所使 用的为3—5代细胞. 1.3浸提液对FDPC细胞生长的影响:将PGA材 料切成2ll'Lrn×2mm小块,放人六孔培养板内,加入 含10%FCS的DMEM2ml浸泡24h,提取浸提液. 用96孔板培养FDPC,每~LJJtl1×10/ml细胞悬液 200l,37?,5%CO2,95%湿度下培养.隔日换液, 其中对照组为新鲜培养液,实验组为浸提液.分别 于换液后24,48,72h后吸取上清20l弃去,每孔 加入20MTr溶液(5g/L)置于C02孵箱中继续 培养4h,终止培养.小心吸弃培养液上清,每~LJJn 人二甲基亚枫150l震荡10min显色,在490nm 波长下,酶联免疫分析仪测吸光度OD值. 1.4FDPC在PGA材料中的生长曲线测定:将PGA 材料剪成直径5mill小块置于96孔细胞培养板底 部,加入DMEM200l,37?孵箱中过夜,吸出培养 基.每孔加入1×10/mlFDPC细胞悬液100,空 白孔同时加入l×10/mlFDPC细胞悬液100l作 为对照,37oC,5%CO:,95%湿度下培养.分别于 1,2,3,5,7,9,lld各取出一块培养板,吸出培养基, PBS洗涤2次,加入0.25%(含0.02EDTA)胰蛋白 酶100p,l37消化10rain,吸出细胞悬液,加入 DMEM100洗涤一次,收集细胞悬液,镜下记数, 画细胞生长曲线. 1.5FDPC在PGA上的生长情况:将PGA浸泡于 含10%的FCS的DMEM培养基中24h后,吸出上 清,按l×10/ml细胞密度滴加,37oC,5%CO2,95% 湿度下培养,每日观察细胞生长增殖,细胞形态及与 支架的黏附清况.接种4d和7d后,取出材料, PBS洗涤1次,浸泡于质量浓度为4%的甲醛溶液 中固定,常规石蜡包埋,HE染色. 1.6超微结构观察:在细胞接种PGA材料4d,7d 后取出材料,PBS洗涤1次,浸泡于3%戊二醛溶液 中固定,常规脱水,包埋.扫描电镜观察支架材料内 细胞黏附及生长情况. 2结果 2.1原代培养的细胞以毛乳头为中心呈放射状排 列,细胞以三角形,多角形为主,渐成梭形,传代后以 梭形细胞为主.对数生长期在3—6d.细胞周期分 析与成纤维细胞无显着差异,见图l. 2.2FDPC在PGA浸提液和对照组中随着培养时 间的延长,均出现增殖,并符合FDPC的生长曲线, 在培养不同时间里两组细胞MTr值无明显差异,见 表1. 表1FDPC在PGA浸提液中的生长情况(MTTOD值) 2.3FDPC接种PGA支架后24h的黏附率为 28.6%,3d左右进入对数生长期,生长曲线与对照 组相当但生长速度较对照组快,14d以后进入平台 期. 2.4相差显微镜观察:FDPC接种于PGA材料后细 胞成圆形,折光性强.12h后可见部分细胞黏附于 支架中,细胞伸展成多角形.24h可见部分细胞形 成梭形.3d可见细胞扩增,聚集,沿PGA纤维长轴 伸展.10d左右可见细胞相互融合,见图2. 图lFDPC原代培养48h 可见毛乳头贴壁并有细胞生长(X100) 图2FDPC接种PGA后3d 可见细胞沿支架纤维成梭形生长(×100) 2.5石蜡切片观察:FDPC在PGA支架上体外立体 培养3d后常规HE染色可见支架内散在细胞生 长,7d后HE染色可见支架内细胞数量增加,细胞 与材料黏附生长,见图3. 2.6电镜观察:FDPC接种支架材料后24h扫描电 镜观察见细胞已完全伸展,细胞间出现连接,细胞周 西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2006Aug.;27(4) 围可见基质分泌.培养4d后,细胞呈梭形,有伪足 包裹PGA纤维,细胞间连接紧密,与材料附着比较 牢固,见图4. 图3FDPC接种PGA7d后石蜡切片 100) 可见细胞与支架材料黏附生长(× 图4FDPC接种PGA4d后电镜下 可见细胞与支架材料黏附生长(×250) 3讨论 组织工程技术发展13新月异,目前研制开发很 多组织工程皮肤,而且有些已经商品化,应用于临床 后取得了较好的临床效果J,但目前的组织工程皮 肤面临着共同的难,即缺乏毛囊,皮脂腺等附属器 以及免疫排斥等J.韩军涛等分离培养了胎鼠 表皮干细胞并利用毛乳头细胞体内诱导干细胞形成 新生毛囊,为构建功能性组织工程皮肤提供新的思 路.本文分离培养FDPC细胞,并以此作为种子细 胞,在三维真皮支架上立体培养,以此为进一步研制 具有毛囊结构,免疫排斥低的组织工程皮肤奠定基 础. 细胞外基质即支架材料的研究是组织工程研究 中最重要的组成部分之一,其形态和功能直接影响 到所构成组织的形态和功能.而PGA在体内可以 完全降解,其降解产物为聚乙酸,是人体血液内本身 所固有成分,不会引起病理反应5J.目前广泛应用 于可吸收缝线,生物粘补材料等.DrewaT等将 成纤维细胞接种于PGA,成功修复鼠腹部巨大缺损 创面模型.本实验检测了FDPC在PGA浸提液培 养基中的生长情况,结果显示与对照组无明显差异, 证明PGA无细胞毒性,对细胞生长无抑制作用.通 过FDPC在PGA支架上的生长特性观察证明FDPC 在支架上生长良好,符合细胞的生长规律.但在支 架生长过程中,细胞形态与二维培养有一定差异,细 胞胞体较大,可能与支架材料表面结构有关,是否功 ,细胞 能有所改变尚待进一步研究.在接种24h后黏附率相对较低(28.6%),而且在移出PGA支架后 可见培养板底有大量细胞贴壁生长,可见支架材料 的孔隙率过大是导致黏附率低的直接原因.另外, 材料表面的疏水性也是一项重要原因.这些可 以通过材料的改性和预铺胶原等方法加以改进.虽 然黏附率相对较低,但细胞在三维支架中生长速度 较快,可能与细胞生长过程中没有接触抑制有关. 本实验中我们对细胞支架复合物进行了HE染 色和电镜观察,均显示FDPC与PGA具有良好的黏 附性,细胞生长形态正常,未见凋亡和分化的细胞. 因此可以以FDPC作为种子细胞,以PGA作为真皮 支架体外构建组织工程皮肤. 参考文献: [1]丁国斌,陈璧,汤朝武,等.组织工程皮肤中毛乳头细 胞体外培养条件的优化[J].中国临床康复,2004,8(8): 1450,1451. 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