一种适合杨树叶片的蛋白质提取方法

一种适合杨树叶片的蛋白质提取 一种适合杨树叶片的蛋白质提取方法 第31卷第3期 2007年5月 南京林业大学(自然科学版) JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalSciencesEdition) Vo1.3l,No.3 Mav,2007 一 种适合杨树叶片的蛋白质提取方法 袁坤,王明庥,黄敏仁 (国家林业局,江苏省林木遗传和基因重点实验室(南京林业大学),江苏南京210037) 摘要:高质量的蛋白样品制备是进行双向电泳的前提条件.杨树叶片中因含有丰富的多酚,色素,多糖等物 质,给蛋白质的提取带来了困难.为了找到一种适合杨树叶片的蛋白质提取方法,以南林895杨为实验材料, 采用三氯乙酸一丙酮沉淀法对杨树叶片蛋白质进行提取.对所提取的蛋白分别用考马斯亮蓝染色法和银染 法进行检测,得到了良好的双向电泳图谱. 关键词:杨树叶片;蛋白质提取;双向电泳 中图分类号:$722;Q78文献标识码:A文章编号:1000—2006(2007)O3一Oll9一O3 AMethodSuitableforProteinExtractionofPoplarLeaves YUANKun,WANGMing—xiu.HUANGMin—ren (TheKeyLaboratoryofForestGeneticsandGeneEngineeringoftheStateForestryAdminist rationand JiangsuProvince(NanjingForestryUniversity),Nanjing210037,China) Abstract:High—qualityproteinsamPlepreparationisthepremiseoftwo— dimensionalgelelee— trophoresis(2一DE).Poplarleavescontainabundanti_ nterferingcompoundssuchaspoly— phenols,pigments,polysaccharidesandSOon,whichmakeitdifficulttoextractproteins.In ordertofindamethodsuitableforproteinextractionofpoplarleaves,thepoplarofNL895 wasusedastheexperimentalmateria1.Themethodoftrichloroaceticacid(TCA)一acetone wasadoptedtoextractproteins.Coomassiebrilliantblue(CBB)andsilverstainingwere usedrespectivelytodetecttheextractedproteins.Goodproteinpatternswereobtained.This paperprovidesabasisforpoplarproteomicsresearchinourlab. Keywords:Poplarleaves;Proteinextraction;Two—dimensionalgelelectrophoresis 杨树基因组的完成为杨树基因组学与蛋白质组学的研究奠定了坚实的基础 l1].而蛋白质是 生物功能的最终执行者_3].林木蛋白质组学的研究起步较晚,进展缓慢,其中一个 重要的原因是蛋白样 品的制备困难,因此高质量的蛋白样品制备是开展林木蛋白质组研究的前提条件. 目前,蛋白质组学研 究的核心技术仍然是双向凝胶电泳技术l_4],该技术的关键是蛋白样品的制备.林 木组织中含有丰富的 多酚,色素,多糖等次生代谢物质,使得蛋白样品的制备比较困难,影响了双向电泳 的分离效果.笔者介 绍了一种高质量的杨树叶片蛋白质提取方法,可用于杨树的蛋白质组学研究,同时 也为其他木本植物蛋 白样品制备提供参考. 1材料与方法 1.1材料 杨树为1年生南林895杨(Populus×euramericanaCV."NL895"),野外采集叶片,于液 氮中速冻并 保存在一7O?待用. 1.2试剂和仪器 双向电泳系统,17cmpH3,IONL预制IPG胶条(ReadyStripTMIPGStrip),两性电解质(Bio一 收稿日期:2006—11一O6修回日期:2007—03一O1 基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(30230300) 作者简介:袁坤(1979一),女,博士生. *通讯作者(CorrespondingAuthor):黄敏仁,男,教授,博士生导师. 南京林业大学(自然科学版)第31卷第3期 Lyte@3/10Ampholyte),四甲基乙二胺(N,N,N,N,tetramethyl-ethylenediamine,TEMED),Tris, 十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS),甘氨酸,过硫酸铵,丙烯酰胺,N,N一甲叉双丙烯酰胺 购自Bio—Rad;CHAPS{3一[(3一cholamidopeopy1)dimethylammonio-]一1一tropanesulfonicacid},苯 甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride,PMSF),二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT), 考马斯亮蓝G 一 250购自Amresco公司;碘乙酰胺(iodoacetamide)购自Fluka公司.其他常用试剂为国产纯. 实验中所用的水为Milli—Q超纯水.DU一800分光光度计,离心机均为BeckmanCoulter公司产品;超 声波细胞粉碎机为宁波新芝生物科技公司产品. 1.3蛋白质的提取 从一70?条件下取出杨树叶片,于液氮中充分研磨至细粉状,将粉末转入离心管中,用10倍体积的 20TCA一丙酮悬浮,同时加入DTT至终浓度为10mmol/L,涡旋混匀后超声,超声功率为150W,频 率为超声2,停3s,共处理了5rain.然后将溶液于一20?静置过夜,离心30min(4?,40000r/min) 弃上清.将沉淀用10倍体积的预冷丙酮溶液清洗,分别加入PMSF和DTT至终浓度为1mmol/L和 10mmol/L,超声处理(超声2S停3S,共处理5min)后于一20?静置2h,离心(4.C,40000r/min) 30rain,弃上清.沉淀用丙酮溶液重复洗3次后于4?挥干(除尽有机溶剂),即为所需要的蛋白干粉. 在蛋白干粉中加入10倍体积的裂解液(9mmol/L尿素,4(质量分数)CHAPS,19/6(体积分数)Am— pholyte,pH3,10,1mmol/IPMSF,10mmol/LDTT),涡旋混匀,直至干粉充分溶于裂解液中,然后 15000r/min离心30rain,上清即为所需的蛋白溶液.用改良的Bradford法测定蛋白浓度]. 1.4双向凝胶电泳 第一向等电聚焦凝胶电泳(IEF)采用17cm,pH3,10,NL的IPG胶条,水化液组成如下:8mol/L 尿素,2%(质量分数)CHAPS,40mmol/LDTT,0.6(体积分数)AmpholytepH3,10,0.002(质量 分数)溴酚蓝.考马斯亮蓝染色和银染的总上样体积都为300L,考马斯亮蓝染色时的蛋白上样量为 600g,银染蛋白上样量为300g.水化和等电聚焦处理在20?下进行,程序为:0V,8h;50V,4h; 1000V,1h;4000V,1h;8000V,1h;8000V,50000V?h.等电聚焦后的IPG胶条在平衡缓冲液 A(6mol/I尿素,309/6(体积分数)甘油,2(质量分数)SDS,50mmol/LTris—HCLpH8.8,0.002 (质量分数)溴酚蓝,1(质量分数)DTT)中平衡15min,然后在平衡缓冲液B(6mol/L尿素,30(体 积分数)甘油,2(质量分数)SDS,50mmol/LTris—HCLpH8.8,0.002(质量分数)溴酚蓝,2.5 (质量分数)碘乙酰胺)中再平衡15min,最后将胶条转移至12的SDS聚丙烯酰胺凝胶的上端进行电 泳.电泳条件为:以每根胶条16mA恒流电泳30min,再加大电流至25mA直至溴酚蓝达到距胶底部 1cm左右停止电泳.分别采用改进的胶体考马斯亮蓝染色法[6和银染法]染色. 1.5图像采集 凝胶用CanonEOS20D照相机拍摄. 2结果与讨论 为了得到高质量的蛋白样品,首先将叶片充分研磨,用TCA一丙酮悬浮后,采用超声处理的方法使 组织充分破碎.实验中发现,超声处理后的溶液明显比处理前的溶液均匀且粉末变得更加细致,这大大 增加了与提取液的接触面积,进而提高了蛋白样品的质量.Islam等人的研究发现,在对成熟水稻叶片 蛋白质提取过程中,超声处理改善了样品质量和双向电泳的分离效果了[8].另外,在实验中,笔者使用 了蛋白酶抑制剂PMSF来抑制丝氨酸和一些半光氨酸水解酶的作用,以减少蛋白质的降解I9].如果条 件允许的话,可以采用一些公司提供的蛋白酶抑制剂"鸡尾酒",它可以抑制多种蛋白酶的作用;在蛋白 样品裂解时,应尽可能溶解更多的蛋白质并保持整个双向电泳过程中蛋白质的溶解性.因此,裂解液的 组成至关重要.双向电泳对所提取的蛋白样品检测后发现,无论银染还是考染都得到了良好的电泳图 谱,明该实验中所采用的裂解液是适合1年生南林895杨的.需指出的是,实验中所采用的杨树叶片 蛋白质提取方法与Renaut,彭方仁,王改萍等人的方法相比口],该实验在整个样品制备过程中都采用 了超声处理和加入蛋白酶抑制剂PMSF,同时所采用的裂解液和染色方法也与其 不同. 双向电泳的结果见图1.从图1可知,蛋白点大多分布在pH4,7,分子量范围为10,100kD的 , 】20, 2007年总第129期袁坤等:一种适合杨树叶片的蛋白质提取方法 区域.无论是采用考染还是银染都得到了清晰的双向电泳图谱,几乎没有横条纹和纵条纹,表明蛋白样 品质量较高. 310310 ll6 66.2 45 35一 l8.4 14.4 ll6 66.2 45 35 l8.4 14.4 图1杨树叶片的蛋白图谱 Fig.1Proteinpatternsofpoplarleaves (A.考染;&银染;蛋白质通过双向凝胶电泳分离,第1向等电聚焦电泳采用17cm,pH3,10NL的IPG胶条,考染和银染的上样量分 别为600ttg和300g;第2向SDS--PAGE采用12的分离胶) 为了进一步验证该实验方法的可行性,笔者以1年生95杨为实验材料,以同样的方 法进行蛋白质 提取,经双向电泳检测后同样得到了很好的分离效果. 3结语 杨树是林木研究的模式树种,因此开展杨树的蛋白质组学研究具有重要意义,而蛋 白样品制备是进 行该项工作的前提条件.该研究提供了一种适合1年生杨树树叶中的蛋白质提取 方法.当然,该法 是否适合多年生或不同发育阶段杨树叶片的蛋白质提取,还有待进一步的验证. 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