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微生物的遗传变异和育种

2017-12-02 46页 doc 82KB 32阅读

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微生物的遗传变异和育种微生物的遗传变异和育种 _ 1. 6 遗传变异的物质基础;基因突变和诱变育种;菌种的衰退、复壮和保藏;基因工程;基 因重组和杂交育种。 2. 本章的重点在于让学生了解DNA是微生物遗传的物质基础、基因突变的类型和机制及 诱变育种。同时让学生对基因工程有一个大概的的了解。 3. 1)理解遗传型与表型、饰变与变异等概念; 2)熟悉三个经典实验的过程以及说明的问题; 3)了解七个水平,熟悉其中相关概念,了解已测序微生物; 4) 熟悉原核生物质粒及相关概念; 5) 掌握基因突变类型、特点与机制; 6) 理解变量试验、...
微生物的遗传变异和育种
微生物的遗传变异和育种 _ 1. 6 遗传变异的物质基础;基因突变和诱变育种;菌种的衰退、复壮和保藏;基因工程;基 因重组和杂交育种。 2. 本章的重点在于让学生了解DNA是微生物遗传的物质基础、基因突变的类型和机制及 诱变育种。同时让学生对基因工程有一个大概的的了解。 3. 1)理解遗传型与型、饰变与变异等概念; 2)熟悉三个经典实验的过程以及说明的问; 3)了解七个水平,熟悉其中相关概念,了解已测序微生物; 4) 熟悉原核生物质粒及相关概念; 5) 掌握基因突变类型、特点与机制; 6) 理解变量试验、涂布试验影印平板培养过程与说明问题; 7) 熟悉诱变育种及其原则,掌握突变株的筛选方法; 8) 区分原核生物、真核微生物的基因重组方式及相关概念; 9) 了解基因工程的操作步骤与应用; 10)熟悉菌种的衰退、复壮和保藏; 11)掌握操纵子、突变率、移码突变株、转座因子、野生 型、营养缺陷型、原养型、流产转导、准性生殖等重要概念。 4. (见课件) 遗传(heredity或inhertiance)和变异(Variation)是生物体最本质的属性之一。 , 是生物的上一代将自己的遗传因子传递给下一代的行为或功能,具有极其稳定的特 性。 , (genotype)是某一生物所含有的遗传信息即DNA中正确的核苷酸序列。生物体通 过这个核苷酸序列控制蛋白质或RNA的合成,一旦功能性蛋白质合成,可调控基因表 达。遗传型是一种内在可能性或潜力,其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息。具 有某遗传型的生物只有在适当的环境条件下通过自身的代谢和发育,才能将它具体化, 即产生表型。 代谢, (phenotype)是批某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和,是遗传型在遗传型+环境条件表型发育合适环境条件下的具体体现。是一种现实性。 , 是生物体在某种外因或内因作用正气引起的遗传物质结构改变,亦即遗传型的改变 变异的特点是在群体中以极低几率(一般为10 -5-6-10)出现;性状变化幅度大;变化后的 新性状是稳定的可遗传的。 , (modification)批不涉及遗传物质结构改变尴只发生在转录、转译水平上的表型变 化。其特点是整个群体中几乎每一个体都发生变化状变化的幅度小;因遗传物质不变故 饰变是不遗传的。如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)在 25?下培养时会产生深红色 的灵杆菌素,在37?时不产生色素。 在生物体中,是否存在着专门行使遗传变异功能的物质问题,曾是生物学界长期争论不 休的重大基本理论问题之一。直至以下三个经典实验发表后,才逐步取得了承认核酸是遗传 物质的一致意见。 一、证核酸是遗传变异物质基本的经典实验 1、 转化实验 转化现象是由英国医生格里菲斯(Griffith)在1928年首次发现的。当时,他把少量无毒 的肺炎双球菌 ,又称肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的R?型(无荚膜,菌落粗糙型)和大量加热杀死的有毒的S?型(有荚膜,菌落光滑型)细胞混合注射到小白鼠体中,使白鼠 病死,结果意外地在其尸体内发现有活的S?细胞。1944,艾弗里(Avery)等人在离体条件下重复了这一实验,并对转化现象的本质进行了一系列深入的研究。 由于肺炎双球菌的R?型菌株转变为S?型时产生了新的荚膜多糖,而多糖是经过酶一 类蛋白质进行合成的,因此,曾设想蛋白质可能是转化因子。 DNA的转化效率是异常高的,已知其最低作用浓度为10-5微克/毫升,这已是目前任何化学方法所无法测出的浓度。 2、 噬菌体的感染实验 1952年,候喜(Hershey)和蔡斯(Chase)利用示踪元素,对大肠杆菌T2噬菌体的吸附、增殖和释放进行了一系列研究。 由于蛋白质分子含硫而不含磷,DNA分子则恰恰与此相反,故可用35S和32P去分别标记大肠杆菌,然后再用T2噬菌体感染,即可分别得到标有35S和T2和32P的T2。正式实验时,把标记噬菌体与其宿主大肠杆菌混合,经短时间(如10分钟)保温后,T2完成了吸附和侵入过程,然后,在组织捣碎器中剧烈搅拌,以使吸附在菌体外表的T2蛋白外壳脱离细胞并均匀分布。接着进行离心沉淀,再分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。结果发 现,几乎全部的32Pf都和细菌一起出现在沉淀物中,而几乎全部33S都在上清液中。这意味着噬菌体的蛋白外壳经自然分离后仍留在细胞外部,只有期核酸芯子才进入宿主体内;同 时,由于最终能释放出一群具有与亲代同样蛋白外壳的完整的子代噬菌体,所以说明只有核 酸才是其全部遗体信息的载体。通过电子显微镜的观察也证实了这个论点。 3、病毒的拆开和重建实验 通过弗朗克-康勒脱(Fraenkel-Conrat)等(1956年)在植物病毒领域中的著名实验,也证明 烟草花叶病毒(TMV)的主要感染成分是其核酸(这里为RNA,应该病毒不含DNA),而病毒外壳的主要作用只是保护其RNA核心。他们通过甲、乙两株植物病毒的核酸和蛋白质的拆 合和相互对换的巧妙实验(图7-3),同样令人信服地证实了核酸(这里的RNA)是TMV病毒的遗传物质基础。 二、遗传物质在细胞中的存在方式 从上述可以知道,核酸尤其是DNA是生物体的遗传物质基础。它们在生物样的存 在方式。为便于全面了解和运用这些知识,下面试图从7个方面来加以叙述。 1、细胞水平 从细胞水平来看,不论是真核策生物还是原核微生物,它们的大部或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。在不同的微生物细胞或是在同种微生物的不同类型细胞中,细 胞核的数目是不同的。例如,酵母、黑曲霉、构巢曲霉、产黄青霉等真菌以及多数放线菌一 般是单核的;有的是多核的(如脉孢菌和米曲霉);在细菌中,杆菌大多存在两个核质体, 而球菌一般只有一个。 2、细胞核水平 从细胞核水平来看,真核生物与原核生物之间存在着一系列明显的差别。前者在核 有核膜包裹,形成有完整形态的核,核内的DNA与组蛋白结合成显微镜下可见的染色体; 而后者的核则无核膜包裹,呈松期待的核质体状态存在,DNA不与蛋白质相结合等。 不论是真核生物还是原核生物,除了它们具有集中着大部分DNA的核或核质体外,在细胞质中还存在着一些能自主复制的另一类遗传物质,广义地讲,它们都可称作质粒 (plasmid)。例如真核生物中的各种细胞质基因(叶绿体、线粒体、中心体等)和共生生物(如草履虫放 品系中的卡巴颗粒等);原核生物中如细菌的致育因子(即F因子,fertility factor),抗药性因子(即R因子,resistance foctor),及大肠杆菌素因子(Col,colicinogenic factor)等。 3、染色体水平 不同生物体在一个细胞核内,往往有不同数目的染色体。真核微生物常有较多的染 色体,如酵母菌属有17条,汉逊酵母属有4条,脉孢菌属有7条等;而在原核微生物中, 每一个核质体只是由一个露的、光学显微镜下无法盾到的球状染色体所组成。因此,对原核 生物来说,所谓染色体水平,实际上就是核酸水平。 遗传物质核染色体(核基因组)核外染色体(广义的质粒)真核生物细胞质基因(质体)线粒体 叶绿体 中心体 毛基体共生生物(如草履虫的卡巴颗粒等) 原核生物的质粒附加体(如F因子等)非附加体(如R因子,细菌素因子等) 4、核酸水平 从核酸的种类来看,大多数微生物的遗传物质是DNA,只有部分病毒(其中多数是植物病毒、还有少数是噬菌体)的遗传物质是RNA。在真核生物中,DNA总是缠绕着组蛋白,两都一起构成了复合物-染色体;而原核生物的DNA都是单独存在的。在核酸的结构上, 绝大多数微生物的DNA是双链的,只有少数病毒为单链结构(如大肠杆菌的Φ×174和fd噬菌体等);RNA也有双链(大多数真菌病毒)与单链(大多数RNA噬菌体)之分。 5、基因水平 在生物体内,一切具有自主复制能力的遗传功能单位,都可称为基因,它的物质基 础是一个具特定核苷酸顺序的核酸片段。基因有两种,其中的结构基因用于编码酶的结构, 为细胞产生蛋白质提供了可能;而调节基因则用于调节酶的合成,它使该细胞在某一特定条 件下合成蛋白质的功能得到了实现。每一基因的分子量约为6.7×10 5,即经含1,000对核苷酸。每个细菌一般含有5,000-10,000个基因。 6、密码子水平 遗传密码就是指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序。每个密码子(codon)是由三个核苷酸顺序所决定的,它是负载遗传信息的基本单位。生物体内的无数蛋白质都是生物体 各种生理功能的具体执行者。可是,蛋白质分子并无自主复制能力,它是接DNA分子结构上遗传信息的指令而合成的。当然,其间要经历一段复杂的过程:大体上要先把DNA上的遗传信息转移到mRNA分子上去,形成一条与DNA碱基顺序互补的mRNA链(即转录),然后而由mRNA上的核苷酸顺序去决定合成蛋白质时的氨基酸排列顺序(即转译)。60年代初,经过许多科学工作者的深入研究,终于找出了转录与转译间的相互关系,破译了遗传密 码的奥秘,并发现各种生物都遵循着一套共同的密码。由于DNA上的三联密参与要通过转 录成mRNA密友才与氨基酸相对应,因此,三联密参与一般都是mRNA上的核苷酸顺序来表示。 由4种核苷酸组成三联密码子的方式可多达64种,它们用于决定20种氨基酸来说已是绰绰有余了。事实上,在生物进化过程中早已解决了这一问题:有些密码子的功能是重复的 (如决定氨酸的就有6个密码子),而另一些则被用作"起读"(AUG,代表甲硫氨酸或甲酰甲硫 氨酸,是一个起始信号)或"终止"(UAA、UGA和UAG,即表中句号"。"表示的)信号。 7、核苷酸水平 上面所讲到的基因水平,实际上是一个遗伟的功能单位,密码子水平是一种信息单位, 而这里提出的核苷酸水平(即碱基水平)即可认为是一个最低突变单位或交换单位。在绝大多 数生物的DNA组分中,都只有腺苷酸(AMP)、胸苷酸(TMP)、鸟苷酸(GMP)和胞苷酸(CMP)4种脱氧核苷酸,但也有少数例外,他们含有一些稀有碱基,例如,T偶数噬菌体的DNA上就含有少量5-羟甲基胞嘧啶。 突变(mutation)就是遗传物质--核酸(DNA或RNA病毒中RNA)中的核苷酸顺序突然发生了稳定的可遗传的变化。 突变包括基因突变(又称点突变)和染色体畸变两类,其中尤以前者为常见,故作为讨论的重 点。基因突变是由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变而引起的。而染色体畸变则 是DNA的大段变化(损伤)现象,表现为染色体的添加(即插入)、缺失、重复、易位、和倒位。 由于重组或附加体等外源遗传物质的整合而引起的DNA改变,则不属突变的范围。 在微生物中,突变民经常发生的。研究突变的规律,不但有助于对基因定位和基因功能 等基本理论问题的了解,而且还为诱变育种或医疗保健工作中有效地消灭病原微生物等问题 提供必要的理论基础。 一、基因突变 1、基因突变的类型 基因突变的类型是极为多样的。人们可从不同的角度来进行不同的分类,并给以不 同的名称。 如按突变体(mutant,即突变株)表型特征的不同,可把突变分成以下几种类型: 指发生细胞形态变化或引起菌落形态改变的那些突变型。如细菌的鞭毛、 芽孢或荚膜的有无,菌落的大小、外形的光滑(S型)、粗糙(R型)和颜色等的变异;放线菌或真菌产孢子的多少、外形或颜色的变异等。 指一类发生代谢途径变异但没有明显的形态变化的突变型。 (auxotroph) 是一类重要的生化突变型。由基因突变而引起代谢过程中某酶 合成能力丧失的突变型,它们必须在原有培养革中添加相应的营养成分才能正常生长。营养 缺陷型在科研和生产实践中有着重要的应用(详后)。 一类能抵抗有害理化因素的突变型。根据基抵抗的对象可分抗约性、抗紫 外线或抗噬菌体等突变类型。它们十分常见且极易分离,一般只需要在含抑制生长浓度的某 药物、相应的物理因素或在相应噬菌体平板上涂上大量的敏感细胞群体,经一定时间培养后 即可获得。抗性突变型在遗传学基本理论的研究中十分有用,它常作为选择性标记菌种。 指细胞成分尤其是细胞表面成分(细胞壁、荚膜、鞭毛)的细致变异而引起抗原性变化的突变型。 由于基因突变而导致个体死亡的突变型。 指在某一条件下呈现致死效应,而在另一条件下却不表现致死效应的 突变类型。温度敏感突变型。温度敏感突发型(Ts mutant)是最典型的条件致死突变型。它们 的一种生要酶蛋白(例如DNA聚合酶,氨基酸活化酶等)在某种温度下呈现活性,而在另一 处温度(一般是较高的温度)下却是钝化的。其原因是由于这些酶蛋白的肽链中更换了几个氨 基酸,从而降低了耗有的抗热性之故。例如,有些大肠杆菌菌株可生长在37?下,但不能在12?下生长;T4噬菌体的几个突变株在25?下有感染力,而在37?下则失去感染力等。 如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性突 变型等。 以上的分类仅是为了讨论的方便而提出的,实际上,它们之间是密切联系或是交叉的。 如果从研究者能否在巨大群体中迅速检出和分离出个别突变体的目的来看,则只有选择性突 变和非选择性突变两类,前者具有选择性标记,可通过某种环境条件使它们得到优势生长, 从而取长原始菌株,例如营养缺陷型或抗性突变型等;后者没有选择性标记,而只有一些性 状的数量差别,例如菌落大小、颜色深浅、代谢产物量的多少等。 2、基因突变的特点 整个生物界,由于它们的遗传物质基础是相同的,所以显示在遗传变异的本质上都遵循 着同样的规律,这在基因突变的水平上尤为明显。以下拟以细菌的抗药性为例,来说明基因 突变的一般特点。 细菌抗药性的产生可通过3条途径,即基因突变、抗药性质粒(R因子),在转移和生理上的适应性(即群体中所有个体都可同时产生,但适应范围不大,且不能遗传)。这里要讨论的只是第一类情况。 这是突变的一个重要特点,也是容易引起争论的问题。即突变的性状与引起 突变的原因间无直接的对应关系。例如,细菌在有青霉素的环境下,出现了抗青霉素的突变 体;在紫外线的作用下,出现了抗紫外线的突变体;在较高的培养温度下,出现了耐高温的 突变体等。表面上看来,会认为正是由于青霉素、紫外线或高温的"诱变",才产生了相对应的突变性状。事实恰恰相反,这类性状都可通过自发的或其任何诱变因子诱发而行。这里的 青霉素、紫外线或高仅是起着淘汰原有非突变型(敏感型)个体的作用。如果说它有诱变作用 (例如其中的紫外线),也可以诱发任何性状的变异,而不是专一地诱发抗紫外线的一种变异。 乍一听,这一结论似乎在符合事实,而且要证实这一结论物实验亦难设计,但下面要介绍的 3个巧妙的经典实验,将证明它是有确凿根据的。 各种性状的突变,可以在没有人为的诱变因素处理下自发地发生(详后)。 自发突变虽可随时发生,但突变的频率是较低和稳定的,一般在10-6~10-9间。所谓突变率,一般指每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的机率,也有用每单位群体在 繁殖一代过程中所形成突变体的数目来表示的。例如,突变率为1×10-8者,就意味着当10 8个细胞群体分裂成2×10 8个细胞时,平均会形成一个突变体。由于突变率极低,所以非 选择性突变型的突变率很难测定。只有测定选择性突变才可获得有关数据。 突变的发生一般是独立的,即在某一群体中,既可发生抗青霉素的突变型,也 可发生抗链霉素或任何其他药物的抗药性,而且还可发生其他不属抗药性的任何突变。某一 基因的突变,既不提高也不降低其他基因的突变率。例如,巨大芽孢杆菌(Bac.megaterium)抗异烟肼的突变率是5×10-5,而抗氨基柳酸的突变率是1×10-6,对两者具有双重抗性的突变率是8×10-10,正好近乎两者的乘积。这就指出两基因突变是独立的,亦即说明突变不仅 对某一细胞是随机的,且对某一基因也是随机的。 通过诱变剂的作用,可提高自发突变的频率,一般可提高10-10 5倍。不论是自发突变或诱发突变(诱变)得到的突变型,它们间并无本质上的差别的差别,因为诱变剂仅 起着提高突变率的作用。 由于突变的根源是遗传 物质结构上发生了稳定的变化,所以产生的新性状也是 稳定的、可遗传的。 由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程,称为正向突变(forward mutation),相反的过程则称为回复突变或回变(back matation或reverse mutation)。实验证明,任何性状既有正向突变,也可发生回复突变。 3、基因突变的自发性和不对应性的证明 1943年,鲁里亚(Luria)和德尔波留克(Delbruck)根据统计学的原理,设计了如下的实验; 实验要点是:取对噬菌体T1敏感的大肠杆菌对数期肉汤培养物,用新鲜培养液稀释成浓度 为10 3/毫升的细菌悬液,然后在甲、乙两试管内各装10毫升。接着把甲管中的菌液先分装 在50支小试管中(每管装0.2毫升),保温24-36小时后,即把各小管的菌液分别倒在50个 预先涂有T1的平板上,经培养后计算各皿上所产生的抗噬菌体的菌落数;乙管中的10毫升菌液不经分装先整管保温24-36小时,然后才分成50份加到同样涂有噬菌体的平板上, 适当培养后,同样分别看各皿上产生的抗性菌落数。 结果指出,来自甲管的50皿中,各皿间抗性菌落数相差极大,而来自乙管的则各皿数目 基本相同。这就说明,大肠杆菌抗噬菌体性状的突变,不是由环境因素--噬菌体诱导出来的,而是在它们接触到噬菌体前,在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的。噬菌体在这里仅 起着淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用。利用这一方法,还可计算突 变率。 (Newcombe experiment) 1949年,纽康布(Newcombe)曾设计了一种与变量试验相似,但方法更为简便的证明实 同一观点的实验,这就是涂布试验。与变量试验不同,他同的是固体平板培养法。先在12只培养皿平板上各涂以数目相等(5×10 1)的大量每感于噬菌体的大肠杆菌,经过5小时的培养,它们约繁殖的了12.3代,于是在皿上长出大量微菌落(这时每一菌落约含5,000个细菌)。取其中6皿直接喷上T1噬菌体,另6皿则先用灭菌玻棒把上面的微菌落重新均匀 涂布一次,然后同样喷上T1。经培养过夜后,计算这两组培养皿上所形成的抗噬菌体菌落 数。结果发现,在涂布过的一组中,共有抗性菌落353个,要比未经涂布过的(仅28个菌落)高得多。这也意味着该抗性突变发生在未接触噬菌体前,噬菌体的加入只起甄别这类突变有 否发生的作用,而不是诱导突变的因素。 (replica plating) 1952年,莱德伯格(Lederberg)夫妇设计了一种更为巧妙的影印培养法,直接证明了微笑 生物的抗药性突变是自发产生,并与相应的环境因素毫不相干的论点。 利用影印培养技术证明大肠杆菌K12自发产生链霉素突变的实验。大致方法是:首先 把大量对链霉素敏感的大肠杆菌K12细胞涂布在不含链霉素的平板(1)的表面,待其长出密集的小菌落后,用影印法接种到不含链霉素的培养基平板(2)上,随即再影印到含有链霉素 的选择性培养基平板(3)上。影印的作用可保证这3个平板上所成长的菌落的亲缘和相对位 臵0保持严格的对应性。经培养后,在平板(3)上出现了个别抗链霉素菌落。对培养皿(2)和(3)进行比较,就可在平板(2)相应的位臵上找到平板(3)上那几个抗性落菌的"孪生兄弟"。然后把平板(2)中最明显的一个部位上的菌落(实际上是许多菌落)挑至不含链霉素的培养液(4)中,经培养后,再涂布在平板(5)上,并重复以上各步骤。上述同一过程几经重复后,就只 要涂上越来越少的原菌液至相当于平板(1)的培养皿(5)和(9)中,而可出现越来越多的抗性菌 落,最后甚至可以得到完全纯的抗性菌群体。由此可知,原始的链霉素敏感菌株只通过 (1)?(2)?(4)?(5)?(6)?(8)?(9)?(10)?(12)……的移种和选择序列,就可要根本未接触链 霉素的情况下,筛选出大量的抗链霉素的菌株。 影印培养法不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用,而且在育种实践和其他研究中 均有应用,值得注意。 4、突变的机制 突变的原因是多种多样的,一般情况可概括如下: 凡能显著提高突变频率的理化因子,都可称为诱变剂(mutagen)。诱变剂的种类很多,作用方式多样,作用方式多样。即使是同一种诱变剂,也常有几种作用方式。以下 拟从遗传物质结构变化的特点为讨论各种代表性诱变剂的作用机制。 (1)(substitution)对DNA来说,碱基对的臵换属于一种微小的损伤,有时 也称点突变(point mutation)。它只涉及一对碱基被另一对碱基所突变诱变点突变碱基臵换。 臵换又可分为两个亚类,一类叫转换(transition),即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌 呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所臵换;另一类叫颠换(transversion),即一个嘌呤被另一个嘧 啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所臵换(图7-6)。对某一种具体诱变剂来说,即可同时引起转 换与颠换,也可只具其中的一个功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起臵换,可以把 臵换的机制分成以下两类: 它们是一类可直接与核酸碱基发生化学反应的诱变剂,不论 在机体仙或在离体条件下均有作用。种类很多,例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂(硫酸二乙酯,甲基磺酸乙酯,N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍,N-甲基-N-亚硝基脲,乙烯亚胺,坏氧乙 酸,氮芥等)。它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应,从而引起DNA复制时碱基配对的转换,并进一步使微生物发生变异。在这些诱变剂中,除羟胺只引起G C?A:T外,共余都是G C A:T可以互变的。能引起颠换的诱变剂很少 。 现以亚硝酸为例来说明碱基转换的分子机制。 亚硝酸可使碱基发生氧化脱氨作用,故它能使腺嘌呤(A)变成次黄嘌呤(H),以及胞嘧啶(C)变成尿嘧啶(U),从而发生转换。它也可使鸟嘌呤(G)变成黄嘌呤(X),但这时不能引起转换。以下仅举其中的A?H而引起的转换反应。 由亚硝酸引起的A:T?G C转换的简式,见图7-7。 引起这类变异的诱变剂是一些碱基类似物,如5-嗅尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、8-氮鸟嘌呤(8-NG)、2-氨基嘌呤(2-AP)和6-氯嘌呤等。它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后而引起的,故是间接的。现以5-溴尿嘧啶的例来加以说明。 5-BU的T的代谢类似物。当把某一微生物培养在含5-BU的培养液中时,细胞中有一 部分新合成的DNA的T就被5-BU所取代。5-BU一般 酮式状态存在于DNA中,因而仍可正常地与A配对,这时并未发生碱基对的转换;有时5-BU会以烯醇式状态出现在DNA中,于是当DNA进行复制时,在其相对位臵上出现的就是G,而不是原来的A,因而引起碱基对从A:T至G C的转换。 (2)移码突变 这是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添 (插入)或缺失,从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。由移码 突变所产生的突变体称为移参与突变体。与染色体畸变相比,移码突变也属于DNA分子的微小损伤。 (3)染色体畸变(chromosomal aberration) 某些理化因子,如X射线等的辐射和烷化剂、亚硝酸等,除了能引起点突变外,还会引起DNA的大损伤--染色体畸变,它既包括染色体 结构上的缺失、重复、倒位(inversion)和易位,又包括染色体数目的变化。 从染色体结构上的变化,又可要染色体内畸变和染色体间畸变两类。染色体内畸变只涉 及一个染色体上的变化,例如发生染色体的部分缺失或重复时,其结果可造成基因的减少或 增加;又如发生例位或易位时,则可造成基因排列顺序的改变,但数目却不改变。其中的例 位,是指断裂下来的一段染色体旋转180?后,重新插入到原来染色体的位臵上,从而使它 的基因顺序与其他基因的顺序方向相反;易位则是指断裂下来的一小段染色体顺向或逆向地 插入到原来一条染色体的其他部位上。至于染色体间畸变,系指非同源染色体间的易位。 染色体畸变在高等生物中一般很容易观察,在微生物中,尤其在原核生物中,只是近年 来才证实了它的存在。 至此,我们已讨论了三类诱变的机制。实际上,许多理化因子的诱变作用都不是单一功 能的。例如,上面曾讨论过的亚硝酸就既有碱基对的转换作用,又有诱发染色体畸变的作用; 一些电离辐射也可同时引起基因突变和染色体畸变作用(表7-2)。 自发突变是指微生物在没有人工参与下所发生的突变。称它为"自发突变"决不意味着这种突变是没有原因的,而只是说明人们对它们还没有很好认识而已。通过 对诱变机制的研究,启发了人们对自发突变机制的了解。下面讨论几种自发突变的可能机制。 (1) 不少"自发突变"实质上是由于一些原因不详的低剂量诱变因 素长期的综合效应。例如充满宇宙空间的各种短波辐射、高温的诱变效应以及自然输送中普 遍存在的一些低浓度的诱变物质(在微环境中有时也可能是高浓度)的作用等。 (2) 过氧化氢是微生物的一种正常代谢产物。过氧化氢对脉 孢菌具有诱变作用,它可因同时加入过氧化氢酶而降低,如果同时再加入过氧化氢酶的抑制 剂 (KCN)可以提高自发突变率。这就说明,过氧化氢可能是自发突变中的一种内源诱变剂。 在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株,可能也是由于这类原因。 (3) 在上面关于5-溴尿嘧啶诱变机制的讨论中,已经知道它的作用是由于发生 酮式至烯醇式的互变异构效应而引起的。因为A、T、G、C四种碱基的第门位上不是酮基 (T、G)就是氨基(C、A),所以有人认为,T和G会以柄式或烯醇式两种互变异构的状态出 现,而C和A则可以氨基式或亚氨基式两种状态出现。由于平衡一般倾向于酮式或氨基式, 因此,在DNA双链结构中一般总是以A:T和G C碱基配对地形式出现。可是,在偶然情 况下T也会以稀有的烯醇式形式出现,因此在DNA复制到达这一位臵的一瞬间,通过DNA聚合酶的作用,以它的相对位臵上就不再出现,因此在DNA复制到达这一位臵的一瞬间, 通过DNA聚合酶的作用,大它的相对位臵上就不再出现常规的A,而是出现G:同样,如果C以稀有的亚氨基形式出现在DNA复制到达这一位臵的一刹那,则在新合成DNA单链的与C相应的位臵上就将是A,而不是往常的G。这或许就是发生相应的自发突变的原因。 必须指明的是,由于在任何一瞬间,某一碱基是处于酮式或烯醇式,还是氨基式或亚氨 基式状态,目前还无法预测,所以要预言在某一时间、某一基因将会发生自发突变将是难以 做到的。但是,人们运用数学方法对这些偶发事件作了大量统计分析后,还是可以发现并掌 握其中规律的。例如,据统计,碱基对发生自发突变的机率约为10-8-10-9。 (4) 即环状突出效应。有人提出,在DNA复制过程中,如果其中一单链上偶而产 生一小环,则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失,从而造成自发突变。图7-12就是环出效奕的设想机制。在上链中,标记B处发生"环出",故只有A及C获得复制,从而发生突变。而在下链中,则复制仍正常进行。 5、紫外线对DNA的损伤及其修复 对紫外线来说,嘧啶要比嘌呤敏感得多,嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。其中 了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。 紫外线的主要作用是使同链DNA的引邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。二聚 体的出现会减弱双链间氢键的作用,并引起双链结构发生扭曲变形,阻碍碱基间的正常配对, 从而有可能引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成,就会 妨碍双链的解于,因而影响了DNA的复制和转录,并使细胞死亡。微生物能以多种方式去 修复损伤后的DNA,主要有以下两种: (photoreactivation) 把经紫外线照射后的微生物暴露于可见光下时,可明显 降低其死亡率的现象,称为光复活作用。这一现象最早(1949)是凯尔纳(Kelner)在大肠杆菌中发现的,他的实验为: (1)对照 8×10 6/毫升大肠杆菌--u.v.?100个/毫升大肠杆菌 (2)试验 8×10 6/毫升大肠杆菌--u.v.?可见光(360-490纳米)照30分钟?2×10 6个大肠杆菌 现已了解,经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子,在黑暗中会被一种光激活酶 即光裂合酶(photolyase)结合,当形成的复合物暴露在可见光(300-500纳米)下时,会因获得光能而发生解离,从而使二聚体重新分解成单体。与此同时,光激活酶也从 复合物中释放出来,以便重新执行功能。有人计算过,每一大肠杆菌细胞中约含有25个光激活酶分子。 由于在微生物中一般都存在着光复活作用,所以在进行诱变育种工作时,经紫外线照射 后的菌液都须在避光下(可用红光)进行操作或处理。 (dark repair) (excision repair)。是活细胞内一种用于修复被 紫外线等(如烷化剂、X射线、γ射线)损伤后的DNA的机制。与光复活作用不同,这种修复 作用与光无关。如图7-14所示,其修得过程中有4种酶参与,即:1、内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5'一侧切开一个3'-OH和5'-P的单链缺口;2、外切核酸酶从5'-P至3'-OH方向切除二聚体,并扩大缺口;3、DNA聚合酶以DNA的另一条互补链作模板,从原有链上暴 露的3'-OH端起逐个延长,重新合成一段缺失的DNA链;4、通过连接酶的作用,把新合 成的寡核苷酸的3'-OH末端与原链的5'-磷酸末端相连接。 二、突变与育种 1、 自发突变与育种 在日常的大生产过程中,微生物也会以一定频率发生自发突变。富于实 际经验和善于细致观察的人们就可以及时抓住这类良机来选育优良的生产菌种。例如,从污 染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的再生菌;又如,在酒精工业中,曾有过一株分 生孢子为白色的糖化菌"上酒白种",就是在原来孢子为黑色的宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)3578发生自发突变后,及时从生产过程中挑选出来的。这一菌株不仅产生丰富的白 色分生孢子,而且糖化率比原菌株强,培养条件也比耗菌株粗放。 任何育种工作者都希望自己能在最短的时间内培育出比较理想的菌 株,因此,定向培育微生物的工作是与微生物的应用相伴发展的。 定向培育一般是指用某一特定环境长期某一微生物培养物(群体),同时不能对它们进行移各传代,以达到积累和选择合适的自发突变体的一古老的育种方法。由于自发突变的频率 较低,变异程度较轻微,所以培育新种的过程一般十分缓慢。与诱变育种、杂交育种和基因 工程技术相比,定向培育法带有守株待兔的被动状态,除某些抗性突变外,一般往往要坚持 相当长的时间才能奏效。 吡哆醇异烟肼定向培育异烟肼的吡哆醇高产菌株的方法是:先在培养皿中加入10毫升的一般琼脂培养基,使皿底斜放,待凝固后,将皿底放平,再在原先的培养基上例10毫升含有适当浓度(通过实验来决定)的异烟肼的培养基,待凝。用此法制成的琼脂平板上存在着 一个浓到稀的异烟肼的浓度梯度 。然后在平析表面涂以大量微生物细胞,经培养后, 右边是低浓度异烟肼区域,因此长满了原始的敏感菌,而左面则是高浓度区域,故该微生物的生 长受到了抑制。只有在适中的部位才出现少数由抗异烟肼的细胞所形成的菌落。这类抗性菌 落由于产生了某种自发突变,所以能抗异烟肼的抑制。根据微生物磁生抗药性的原理,它们 有可能因产生了可分解异烟肼的酶类,也有可能通过合成理更高浓度的代谢产物(吡哆醇)来克服异烟肼的竞争性抑制作用。这类实验结果证明,多数菌株因发生了后一性质的变异才获 得抗性的,这样,利用梯度培养皿就达到了定向培育某一代谢产物高产菌株的目的。例如, 在酵母菌中,通过梯度培养皿法曾获得吡哆醇产量提高7倍的变异株。应用同样原理,还获 得过许多其他有关代谢产物的高产菌株 。 2、诱变育种 诱变育种就是利用物理或化学诱变剂处理均名分散的微生物细胞群,促进其突变频率大 幅度提高,然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法,从中挑选少数符合育种目的的突变 株,以株,以供生产实践或科学实验之用。 1 诱变育种的具体操作环节很多,且常因工作目的、育种对象和 操作者的安排而有所差异,但其中最基本环节却是雷同的。现以产量变异为例: 2 (1) 诱变剂主要有两大类,即物理诱变剂和化学诱变剂。物理诱变剂 如紫外线、X射线、γ射线和快中子等;化学诱变剂的种类极多,前面已有提及。其中烷化 剂类由于能和辐射一样引起基因突变和染色体畸变,所以也有拟辐射物质之称。 要知道某一诱变剂是否有诱变作用以及诱变作用的强弱程度,从生产实践的角度来看, 最理想的方法当然是设法直接测定它对提高某一菌种产量的实际效果究竟多大。可是在具体 工作中,由于这种方法所需的工作量太大,定量性状不易确定,所以一般常用其他简便而间 接的定性方法来代替,例如营养缺陷型的回变法、抗药性突变法、形态变法或溶源细菌的裂 解法等。采用这些替人方法的理论依据是:一切生物的遗传物质都是核酸,尤其是DNA, 一切诱变剂的作用机制都是引起DNA分子结构的改变。因此,凡对微生物有效的诱变剂, 对高等生物同样有效,反之亦然;同时,凡能引起某一性状突变的诱变剂,对其他性状也必 然有类似的作用。于1973年建立的利用一组鼠伤寒沙门氏菌 营养缺陷型的回复突变来检测各种化学物质对高等动物是否有致癌作用的艾姆氏试验法(Ames test),就是利用上述诱变剂"共性原则"的一个范例。利用这种大大简化后的方法,发现化学药剂对细菌的诱变率一其对 动物的致癌性成正比关系(约有95%的致癌剂都是诱变剂)。 (2) 出发菌株就是用于育种的原始菌株。选用合适的出发菌株,就 有可能提高育种工作的效率。在育种工作中,可以参考以下一些实际经验来选用出发菌株: 1.最好是经过生产中选育过的自然变异菌株;2.采用具有有利性状的菌株,如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株;3.由于有些菌株在发生某一变异后,会提高其他诱变 因素的敏感性,故有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。例如,在金霉素生 产菌株中,曾发现分泌黄色色素的菌株为出发菌株时,只会使产量下降,而以失去色素的变 异菌株作出发菌株时,则产量会不断提高;4.在细菌中曾发现一类称为增变菌株的变异菌株 它们对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高,故更适宜做出发菌株;5.在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时,最好考虑至少能累积少量所需产品或其前体的菌株,而在选择产抗生至 少的出发菌株时,最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株作为 出发菌株。 (3)() 在诱变育种中,所处理的细胞必须是单细胞的、均匀的悬 液状态。这是因为,一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂;另一方面又可避免长出 不纯菌落。 在某些微生物中,即使用这种单细胞悬浮液来处理,还是很容易出现不纯的菌落,这是 由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核的缘故。有时,虽已处理了单核的细胞或孢子, 但由于诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链,故某一突变无法反映在反映在当代 垢表型上。只有经过DNA的复制和细胞分裂后,才会使表型发生变异,于是出现了不纯菌 落,这就叫表型延迟(图7-16)。这类不纯菌落的存在,也是诱变育种工作中初分离的菌株经 传代后很出现产生性状:衰退"的主要原因。 鉴于上述原因,在诱变霉菌或放线菌时,应处理它们的孢子;对芽孢杆菌则应处理它们 的芽孢,微生物的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响。细菌一般以对数期为好;霉菌 或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态,所以培养时间的长短对孢子的影响不大,但稍加 萌发后的怨子则可提高诱变效率。 在实际工作中,要得到均匀分散的细胞悬液,通常可用无菌的玻璃珠来找散成团的细胞, 然后再用脱脂棉过滤。至于诱变后出现的不纯菌落,则可用适当的分离纯化方法加以纯化参 阅第五节中关于纯种分离的介绍。 (4) 各种诱变剂有不同的剂量(强度×时间)的表示方式,如紫外线的强度单位是尔格1尔格=10-7J。X射线的单位是伦琴1伦琴=2.58×10-1C/kg。或拉得(rad) 1拉得 =10-2Gy。等,化学诱变剂的剂量则以在一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。在育 种实践中,常采用杀菌率来作各处诱变剂的相对剂量。由于诱变剂的作用一是提高突变的频 率;二是扩大产量变异的幅度;三是使产量变异朝正变 (即提高产量的变异)或负变(即降低 产量的变异)的方向移动(图7-17),因此,凡在高诱变率的基础上既能扩大变异幅度,又能 促使变异移向正变范围的剂量,就是合适的剂量 要确定一个合适的剂量,常常要经过多次试验。就一般微生物而言,诱变率往往随剂量 的增高而提高,但达到一定剂量后,再提高剂量反而会使诱率下降。根据对紫外线、X射线 和乙烯亚胺等诱变效应的研究结果,发现正变转多地出现在偏低的剂量中,而负变则较多地 出现于偏高的剂量中;还发现经多次诱变而提高产量的菌株中,更容易出现负变。因此,在 诱变育种工作中,目前比较倾向于采用较低的剂量。例如,过去在用紫外线作诱变剂时,常 采用杀菌率为90、99或99.9%的剂量,而近来则倾向于采用杀菌率为70-75%甚至更低(30-70%)的剂量,特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此;又如,NTG的诱变率当以大肠杆菌的抗性突变为指标时,测得以杀菌率为47%的剂量为最合适的剂量。 (5) 诱变剂的复合处理常常呈现一定的协同效应(表7-4),这对育种实践是很有参考价值的。复合处理有几类:一类是两种或多种诱变剂的先后使用;第二 类是同一种诱变剂的重复使用;第三类则是两种或多种诱变剂的同时使用。如果能从前面讨 论过的不同作用机制的诱变剂来作复合处理,可能会取得更好的诱变效果。 表7-4 诱变因子的复合处理及其协同效应 (6) 为了确切地了解某一突变株产量性状的 提高程度,必须进行大量的分析测定和统计工作,而一些形态变异虽能直接和迅速地加以观 察,但又不一定与产量变异相关。如果能找到这两者间的相关性,则初筛效率就可大大提高。 有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母 的变异菌落,发现高产菌株的菌落形 态有以下几个特点:1、菌落直径呈中等大小(8-10毫米)。凡过大或过小者均为低产菌株;2、色泽深黄色。凡浅黄或白色者皆属低产菌株;3、表面光滑,有大量气生菌丝覆盖。凡无气 生菌丝、有放射状折皱或菌落中心呈角状突起者都是低产菌株;4、菌落各部分呈辐射对称。凡呈扇弧形或其他不规则形状者,都为低产菌株。又如,在灰黄霉素产生菌荨麻青霉 的育种中,曾发现菌落的棕红颜色变深者,则产量往往有所提高;而在赤霉素生产菌藤仓赤霉( 即稻恶苗病菌)中,却发现菌落的紫色加深者其产量反而不降。 (7) 通过诱变处理,在微生物群体中会出现种种突变型 个体,但其中绝大多数是负变体,要在其中把极个别的产量提高较显著的正变体筛选到手, 可能要比沙里淘金还要难。为了花费最少的工作量,又能在最短的时间内取得最大的成效, 就要求努力设计和采用效率较高的科学筛选和具体的筛选方法。 关于筛选方案:在实际工作中,一般认为筛选过程以分初筛与复筛两阶段进行为好。前 者以量(选留菌株的数量)为主,后者以质(测定数据的精确度)为主。例如,在工作量限度为 200只摇瓶的具体条件下,为了取得最大的工效,有人提出了以下的筛选方案: 关于筛选方法:一般可通过初筛与复筛两个阶段对突变株进行生产性能的测定。 初筛既可在培养皿平板上进行,也可在摇瓶中进行,两者各有利弊。如在平板上进行, 则快速简便,工作量小,结果直观性强(例如,上述的变色圈、透明圈、生长圈、抑制圈或 沉淀圈等生理效应的测定),缺点则是由于培养皿平板上的种种条件与摇瓶培养,尤其与发 酵罐中进行液体深层培养时的条件有很大差别,所以两者结果常不一致。但也有十分一致的 例子。例如,在柠檬酸生产菌宇佐美曲霉 的筛选进程中,有人把待测菌株的单孢子,用特 制的不锈钢多点接种器接种到浸有淀粉培养基和嗅甲酚绿指示剂的厚滤纸片上,经培养后, 根据黄色变色圈的直径和菌落直径之比,就可筛选出产量较高的菌种。 对突变株的生产性能作比较精确工作常称复筛。一般是将微生物接种在三角瓶内培养液 中作振荡培养(摇瓶培养),然后再对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中,微生物在培养液 内分布均匀,既能满足丰富的营养,又能获得充足的氧气(对好氧微生物而言),因此与发酵罐的条件比较接近,所以测得的数据就更具有实际意义。此法的缺点是需要较多的劳力、设 备和时间,故工作量难以大量增加。 以上初步介绍了一些可提高筛选效率的工作步骤和具体方法。从长远的角度来看,还应 努力使筛选操作达到自动化和电子计算机化。 3 营养缺陷型(auxotroph)是指通过诱变而产生的,在一些营养物质(如氨基酸、维生至少和碱基等)的合成能力上出现缺陷,因此必须在基本培养基(minimal medium)中加入相诮的有机营养成分才能正常生长的变异菌株。其变异前的原始菌株称为野生型 (wild type)。凡能满足某一菌种的野生型或原养型*菌株营养要求的最低成分的合成培养基, 称为基本培养基,常以"[-]"表示;如果在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生至少 和碱基之类的天然物质(如蛋白胨、酵母膏等),以满足该微生物的各种营养缺陷型都能生长 的培养基,就称完全培养基(complete medium),常用"[+]"表示;如果本培养基上只是有 针对性地加上某一种或几种其自身不能合成的营养成分,以满足相应的营养缺陷型生长的培 养基,则称为补充培养基(supplemented medium),可按所加所分相应地用"[A]"、"[B]"等来表示。 营养缺陷型菌株不论在基本理论和应用理论研究上,还是在生产实践工作上都有十分重 要的意义。在科学实验中,它们既可作为研究代谢途径和杂交(半知菌的准性杂交、细菌的接合)、转化、转导和原生质体融合等遗传规律所必不可少的标记菌种,也可作为氨基酸、 维生素或碱基等物质生物测定的试验菌种;在生产实践中,它们既可直接用作发酵生产核苷 酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株,也可作为生产菌种杂交育种进所必不可少的带有特定标 记的亲本菌株。 筛选营养缺陷菌株一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型4个环节。现分述如下: (1) 与上述一般处理相同。 (2) 在诱变后的存活个体中,营养缺陷型的比例一般较低,通常只有百分之向至 千分之几。通过抗生素法或菌丝过滤法就可以淘汰为数众多的野生型菌株,从而达到了"浓缩"营养缺陷型的目的。 在抗生素法中,青霉素法主要适用于细菌。其原理是青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合 成,因而能杀死生长每殖着的细菌,但不能杀死处于休止状态的细菌。如果将诱变后的细菌 培养在含有青霉素的基本培养基中,就可淘汰大部分生长每殖活跃的野生型细胞,从而达到 "浓缩"缺陷型细胞的目的。制霉菌素法则适合于真菌。制霉菌素是大环内酯类抗生素,可与 真菌细胞膜上的甾醇作用,引起细胞膜损伤。因为它只能杀死生长繁殖着的酵母或霉菌,所 以也可以用于淘汰相应的野生型菌株和"浓缩"营养缺陷型。 菌丝过滤法只用于丝状真菌的场合。其原理是在基本培养基中,野生型的孢子能发芽成 菌丝,而营养缺陷型则不能,因此,将诱变剂筛后的孢子在基本培养基中培养一段时间后, 再进行过滤。如此重复数次后,就可以去除大部分野生型个体,同样也就达到了"浓缩"营养缺陷型的目的。 (3) 方法很多。在同一培养皿上就可检出的有夹层培养法和限量补充培养法,要 在不同培养皿上分别进行对照和检出的有逐个检出法和影印接种法。现分别介绍如下: (layer plating method):先在培养皿上倒薄一层不含菌的基本培养基。经培养 后,在皿底用笔对首次出现的菌落一一作好记号,然后再浇一薄层第四导培养基--完全培养基。再经培养后出现的新菌落,多数是营养缺陷型(图7-19)。 :把诱变处理后的细胞接种在含有微量(0.01%以下)蛋白胨的基本培养基上,野生型就迅速长成较大的菌落,而缺陷型则生长缓慢,并只能形成微小的菌落。如果 想得到某一特定缺陷型菌株,也可直接在基本培养基上加入微量的相应物质。 :把经诱变处理后的细胞涂布在平板上,待长成单个菌落后,用接种针或灭 过菌的牙签把这些单个菌落逐个依次地分别接种到基本培养基和另一完全培养基上。经培养 后,如果在完全培养基一部位上出现菌落,而在基本培养基的相应位臵上却不长,说明这是 一个营养缺陷型。 :将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基表面上,经培养后长出菌落。然后 用前面已介绍过的影印接种工具,把此皿上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培 养后,比较这两个平皿上长出的力落。如果发现在前一平皿上某一部位长有某菌落,而在后 一培养基的相应部分上却没有,说明这就是一个营养缺陷型(图7-20)。 (4):把生长在完全培养液里的营养缺陷型细胞或余面孢子洗下,经用无菌水 离水清洗后,配成浓度为10 7-10 8个/毫升的县液,随后取0.1毫长与基本培养基均匀混和,再倒在培养皿上。待表面稍干燥后,在皿背划若干区域,然后在其上加微量的氨基酸、维生 素、嘌呤中嘧啶等营养物(也可用滤纸片法)。经培养后,如果发现某一营养物的周围有微生 物的生长圈,说明该微生物就是它的相应营养缺陷型。 凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起,经过遗传分子的重新组合后,形成新 遗传型个体的方式,称为(gene recombination)或遗传重组。重组可使生物体在未发生突变的情况下,也能产生新遗传型的个体。 重组是分子水平上的一个概念,可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交,而一般所说 的杂交(hybridization),则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包括着重组,而重组则不限 于杂交这一种形式。真核微生物中的有性杂交、准性杂交 及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映 。 基因重组是杂交育种的理论基础。由于杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为 亲本,因此不论在方向性还是自觉性方面,都比诱变育种前进了一大步。另外,利用杂交育 种往往还可消除某一菌株在作长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象,因此,它是一 种重要的育种手段。但由于杂交育种的方法较复杂,工作进度较慢,因此还很难象诱变育种 技术那样得到普遍的推广和使用,尤其在原核生物的领域中,应用转化、转导或接合等重组 技术来培育高产菌株的例子还不多见。 表7-5 在微生物中各种形式基因重组的比较 ()(transformation) 受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段,通过交换,把它组合到自己的基因组中,从而 获得了供体菌的部分遗传性状的现复印,称转化。转化后的受体菌,就称转化子 (rtansformant)。转化现象的发现,尤其是转化因子DNA本质的证实,是现代生物学发展史上的一个重要里程碑,并由此开创了分子生物学这门崭新的学科。 在原核生物中,转化虽是一个较普遍的现象,但目前还只在部分细菌种、属中发现,例 如肺炎双球菌、嗜血杆菌属 、芽孢杆菌属 、奈氏球菌属、根瘤菌属 、链球菌属 、葡萄球 菌属 ,假单胞单胞杆菌属和黄单胞杆菌属 等。在若干放线菌和蓝细菌,以及少数真核微生 物如酵母,粗糙脉孢菌和黑曲霉中,也有转化的报道。在细菌中,肠杆菌科的一些菌很难进 行转化,其主要原因,一方面由于外来DNA难以掺入到细胞中,而且还由于在受体细胞内 常存在降解线形DNA的核酸酶。如果用CaCl2处理大肠杆菌的球状,就可发生低频率的转化。 两个菌种或菌株间能否发生转化,与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的联系。 但即使在转化率极高的那些种中,其不同菌株间也不一定都可发生转化。能进行转化的细胞 必须是感受态的。受体菌最易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态,称为感受态 。 处于感受态的细胞,其吸收DNA的能力,有时可比一般细胞大一千倍。 一般的转化因子都是线状双链DNA;也有少数报道认为线状单链DNA也有转化作用。 用革兰氏阳性的肺炎双球菌作材料,发现转化过程大体上是这样的: 1、双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点(主要在新形成细胞壁的赤道区)结合,此时,一种细胞膜的磷脂成分--胆碱可促进这一过程; 2、在位点上的DNA发生酶促分解,形成平均分子量为4-5×10 6的DNA片段; 3、DNA双链中的一条单链逐步降解,同时,另一条单链逐步进入细胞,这是一个耗能 过程。分子量小于5×10 5的DNA片段,不能过入细胞; 4、转化DNA单链与受体菌染色体组上的同源区段配对,接着受体染色体组的相应单 链片段被切除,并被外来的单链DNA所交换和取代,于是形成了杂种DNA区段(它们间的DNA顺序不一定互补,故可呈杂合状态) ; 5、受体菌染色体组进行复制,杂合区段(heterozygous region)分离成两个,其中之一类 似供体菌,另一类似受体菌。当细胞分裂后,此染色体发生分离,于是就形成了一个转化子 。 如果把噬菌体或其他病毒的DNA(或RNA)抽提出来,用它去感染感受态的宿主细胞, 并进而产生正常的噬菌体或病毒看起来代,这种特殊的"转化",称为(transfection)。 () (transduction) 通过缺陷噬菌体的媒介,把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中,从而使后者获得 了前者部分遗传性状的现象,称为转导。 转导现象最早(1952年)是在鼠伤寒沙门氏杆菌中发现的。以后在许多原核微生物中都陆续发 现了转导,如大肠杆菌,芽孢杆菌属 ,变形杆菌属 ,假单胞杆菌属 志贺氏杆菌属 和葡萄球菌属 等。 1(generalized transduction) 噬菌体可误包供体菌中的任何基因(包括质粒),并使受体菌实现各种性状的转导,此即普遍性转导。普遍转导又可分以下两种: (1) 简称完全转导 。在鼠伤寒沙门氏菌的完全普遍转导实验中,曾以其 野生型菌株作供体菌,营养缺陷型为受体菌,P22噬菌体作为转导媒介。当P22在供体菌内发育时,宿主的染色体组断裂,待噬菌体成熟之际,极少数(10-5-8-10)噬菌体的衣壳将与噬 菌体头部DNA芯子相仿的供体菌DNA片段(在P22情况下,约为供体菌染色体组的1%)误 包入其中,因此,形成了完全不含噬菌体身DNA的假噬菌体(一种完全缺陷的噬菌体)。当 供体菌裂解时,如把少量裂解物与大量的受体菌群相混(使感染复数感染复数 :指病毒(或 噬菌体)粒子与敏感宿主细胞之间的比例,数值越高,则一敏感细胞感染病毒粒子的数量也 越多。小于1),这种误包着供体菌基因的特殊噬菌体就将这一外源DNA片段导入受体菌内。 由于一个细胞只感染了一个完全缺陷的假噬菌体(转导噬菌体),故受体细胞不会发生溶源 化,更不会裂解;还由于导入的供体DNA片段可与受体染色体组上的同源区段配对,再通 过双交换而重组到受体菌染色体上,所以就形成了遗传性稳定的转导子 。 除鼠伤寒沙门氏杆菌P22噬菌体外,大肠杆菌的P1噬菌体和枯草杆菌的PBS1、SP10 等噬菌体都能进行完全转导。 (2) 简称流产转导(abortive transduction),在许多获得供体菌DNA片段的受 体菌内,如果转导DNA不能进行重组和复制,其上的基因仅经过转录而得到了表达,就称 流产转导。当这一细胞进行分裂时,只能将这段DNA分配给一个子细胞,而另一子细胞只 获得供体基因的产物--酶,因此仍可在表型上出现体菌的特征。所以,能在选择性培养基平 板上形成微小菌落成了流产转导的特点。 2(restricted specialized transduction) 1954年在大肠杆菌K12菌株中发现。指 通过某些部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的转导现象。已知 当温和噬菌体感染受体菌后,其染色体会事例整合 :指质粒、温和噬菌体或转化因子等非 染色体DNA并入染色体DNA中的过程。到细菌染色体的特定位点上,从而使宿主细胞发 生溶源化。如果该溶源菌因诱导而发生裂解时,在前噬菌体插入位点两侧的少数宿主基因(如大肠杆菌的λ前噬菌体,其两侧分别为gal和bio基因)会因偶尔发生的不正常切割而连在噬 菌体DNA上(当然噬菌体也将相应一段DNA遗留在宿主染色体上),两者同时包入噬菌体外壳中(图7-25)。这样,就产生了一种特殊的噬菌体--缺陷噬菌体:它们除含大部分自身的DNA外,缺失的基因被几个原来位于前噬菌体整合位点附近的宿主基因取代,因此,它们没有正 常噬菌体的溶源性和增殖能力。如果将引起普遍传导的噬菌体称为"完全缺陷噬菌体"的话,则能引起局限转导的噬菌体就是一种"部分缺陷噬菌体"。 局限转导又可分为低频转导和高频转导两种: (1)(low frequency transduction LFT) 在大肠杆菌K12的λ噬菌体成熟时,产生转导 噬菌体(λdgal)λdgal即λdg,表示带有半乳糖基因的λ缺陷噬菌体。其中的d表示缺陷(defective)。的频率一般为10-4-10-6,故称低频转导。用这一裂解物去感染受体菌 E.coliK12gal-群体时,就有极少数受体菌导入了gal+通过交换和重组最终可形成少数稳定的 gal+转导子。 (2)(high frequency transduction,HFT) 当E.coli gal-受体菌用高感染复度的LFT裂解物进行感染时,则凡感染有λdgal噬菌体的任一细胞,几乎都同时还感染有野生型(非缺陷型)的正常噬菌体。这时,这两种噬菌体可同时整合到一个受体菌的染色体组上,并便它成 为一个双重溶源菌(double lysogen)。当双重溶源菌被紫外线等诱导时,其上的正常噬菌体[称 为助体噬菌体或辅助噬菌体 ]的基因可补偿缺陷噬菌体所缺失的基因的功能,因而两种噬 菌体同时获得复制的机会。由此产生的裂解物中,大体上含有等量的λ和λdgal粒子。如果用这一裂解物去感染另一个E.coli gal-受体菌的话则可高频率地将它转导成gal+。故这种局限性转导就称为高频转导,而含λ及λgal各占一半的裂解物就称为HFT裂解物。 转导现象在自然界中比较普遍,在低等生物的进化过程中,它可能是产生新的基因组合 的一种方式。 还有一种与转导相似但又不同的现象,叫作 。当温和噬菌体感染其宿主而使 之发生溶源化时,因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上,而使后者获得了除免疫性以外的 新性状的现象,称为溶源转变。当宿主丧失这一噬菌体时,通过溶源转变而获得的性状也同 时消失。溶源转变与转导有本质上的不同,首先是它的温和噬菌体不携带任何供体菌的基因; 其次,这种噬菌体是完整的,而不是缺陷的。 溶源转变的典型例子是不产毒素的白喉棒杆菌 菌株在被β噬菌体感染而发生溶源化 时,会变成产白喉毒素的致病菌株;另一例子是鸭沙门氏菌 用E15噬菌体感染而引起溶源化时,细胞表面的多糖结构会发生相应的变化。最后,国内有人发现,在红霉素链霉菌 中的P4噬菌体也具有溶源转变能力,它决定了该菌的红霉素生物合成及形成气生菌丝等能力。 ()(conjugation) 通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程,称为接合(有时也称"杂交")。由于在细菌和放线菌等原核生物中出现基因重组的机会极为罕见(如大肠杆菌K12约为10-6),而且由于它们比较缺少形态指标,所以关于细菌接合的工作直至莱德伯格 (Lederberg)等(1946年)采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验后,才奠定了方法学上的基 础。 在细菌和放线菌中都存在着接合现象,在细菌中,以革兰氏阴性细菌如大肠杆菌以及沙 门氏菌 、志贺氏菌 、赛氏杆菌 、弧菌 、固氮菌 、克氏杆菌 和假单胞杆菌 等属生活在动物肠道内的一些种最为常见;在放线菌中,研究得最多的是链霉菌属 和诺卡氏菌属 等,成以天蓝色链霉菌 研究得最为详细。此外,接合还可发生在不同属的一些种间,如大肠杆 菌与沙门氏菌间或沙门氏菌与志贺氏菌之间。 凡有F因子的菌株,其细胞表面就会产生1-4条中空而细长的丝状物,称为性毛(sexpili,或性菌毛)。它的功能是在接合过程中转移DNA,有关其中机制还不甚清楚。 由于F因子在细胞中的有无和存在方式的不同,可把大肠杆菌分成以下4种接合类型: 1F+("") 在这种细胞中存在着游离的F因子,在细胞表面还有与F+因子数目相当的性毛。当F+菌株与F-菌株也转变成F-菌株也转变成F+(一般达到100%)。F因子的传递过程为:(1)F因子上的一条DNA单链在特定的位臵上发生断裂;(2)断裂的单链逐渐解开,同时以留下的另一条状单链作模板,通过模板的旋转,一方面将解开的一条单链通过 性毛而推入F-中,另一方面,又在供体细胞内,重新合成一条新的环状单链,以取代解开 的单链,此即称为"滚环模型" ;(3)在F-细胞中,外来的供体DNA单链上也合也了一条互补的新DNA链,并随之恢复成一条环状的双链F因子,因此,F-就变成了F+。 2F-("") 在这种细胞中没有F因子,表面也不具性毛。它可通过与F+菌株或F'因子,从而使自己成为"雄性"的菌株,同时还可接受来自Hfr菌株的一部分或全部染色体信 息。如果是后一种情况,则它在获得一系列Hfr菌株性状的同时,还获得了处于转移染色体 末端的F因子,使自己从原来的"雌性"转变成"雄性"菌株。有人统计,从自然界分离的2,000个大肠杆菌菌株中,-约占30%。 3Hfr(high frequency recombination) 因为它与F-接合后的重组频率比F+接合后的重组频率高出几百倍以上,故名。在Hfr细胞中,存在着与染色体特定位点相整 合的F因子(产生频率约10-5)。当它与F-菌株发生接合时,Hfr染色体在F因子处发生断裂,由环状变成线状。整段线状染色体转移至F-细胞的全过程约需100分钟。在转移时,由于 断裂发生在F因子中,所以必然要等Hfr的整条染色体组全部转移完成后,F因子才能完全进入F-细胞。可是,事实上由于种种原因,这种线状染色体在转移过程中经常会发生断裂, 所以Hfr的许多基因虽可进入F-,但越在前端的基因,进入的机会就越多,故在F-中出现重组子的时间就越早,频率也高。而F因子因位于最末端,故进入的机会最少,引起性别 转化的可能性也最小。因此,Hfr与F-接合的结果重组频率虽高,但却很少出现F+的。 Hfr菌株的染色体转移与F+菌株的F因子转移过程基本相同。所不同的是,进入F-的单链染色体片段经双链化后,形成部分合子(merozygote,又称半合子),然后两者的同源染色体进行配对,一般认为要经过两次或两次以上的交换后才发生遗传重组。 由于上述转移过程存在着严格的顺序性,所以,在实验室中可以每隔一定时间利用强烈搅拦 (例如用组织捣碎器或杂交中断器)等措施,使接合对中断接合,从而可以获得呈现不同数理 Hfr性状的Fλ-接合子。根据这一实验原理,就可选用几种有特定整合位点的Hfr菌株,在不同时间使接合中断,最后根据在F-中出现Hfr中各种性状的时间早晚(用分钟表示)画出一幅比较完整的环状染色体图 。这就是1955年由伍尔曼(Wollman)和雅各布(Jacob)创造的中断杂交法 的基本原理;同时,原核微生物染色体的环状特性也是从这里开始认识的 。 4F' 当Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离其染色体组时,可形成游离的但携带 一小段(最多可携带三分之一段染色体组)染色体基因的F因子,特称F'因子。携带有F'因子的菌株,其性状介于F+与Hfr之间,这就是初生F'菌株。通过初生F'菌株与F-菌株的接合,就可以使后者转变成F'菌株,这就是次生F'菌株,它既获得了F因子,又获得了来自初生 F'菌株的若干遗传性状。以这种接合来传递供体菌基因的方式,称为F因子转导(F-duction)、性导(sexduction)或F因子媒介的转导(F-mediated transduction)。这时,受体菌的染色体和由 F'因子所携带来的细菌基因间,通过同源染色体区(即双倍体区)的交换,实现了重组。 在次生的F'群体中,大约有10%的F'因子重新整合到染色体组上,而恢复成Hfr菌,故该群体显示出来的特征介于F+和Hfr供体菌之间。 (四)原生质体融合 通过人为方法,使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合,并产生重组子的过程, 称为原生质体融合或细胞融合。这是近年来才出现的继转化、转导 能进行原生质体融合的细胞不仅有原核生物中的细菌、放线菌,而且还有真核微生物中 的酵母、霉菌以及高等动、植物细胞。 微生物细胞融合的研究开始于1976年。 有关原生质体融合的机制还有待研究。细胞融合现象的发现,为一些还未发现转化、转 导或接合的原核生物的遗传学研究和育种技术的提高创造了有利的条件,还使种间、属间、 科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间进行融合,以期得到生产性状极其优良的新物种 的理想,有可能实现。 () 杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交,一般指性细胞间的接合和随 之发生染色体重组,并产生新遗传型后的一种方式。凡能产生有性孢子的酵母菌或霉菌,原 则上都可应用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。现在以工业上常用的 醉酒酵母 为例来加以说明。 酿酒酵母有其完整的生活史 。从自然输送中分离到的,或在工业生产中应用的酵母, 一般都是它们的双倍体细胞。将不同生产性状的甲、乙两个亲本(双倍体)分别接种到产孢子 培养基(醋酸钠培养基等)斜面上,使其产生子囊,经过减数分裂后,在每个子囊内会形成四 个子囊孢子(单倍体)。用蒸馏水洗下子囊,经机械法(加硅藻土和石蜡油,在匀浆管中研磨) 或酶法(如用蜗牛酶处理)破坏子囊,再经离心,然后用获得的子囊孢子涂布平板,就可以得 到单倍体菌落。把两个亲体的不同性另(如图7-30中的"+"和"-")的单掊全细胞密集在一起就有更多机会出现种种双倍体的杂交后代。它们的双倍体细胞和单倍体细胞有很大不同,易于 识别(表7-6)。有了各种双倍体的杂交子代后,就可以进一步从中筛选出优良性状的个体。 生产实践中利用有性杂交培养优良品种的例子很多。例如,用于酒精发酵的酵母和用 于面包发酵的酵母虽属同一种酿酒酵母,但两者是不同的菌株,表现在前者产酒精率高而对 麦芽糖和葡萄糖的发酵力弱,后者则产酒精率低而对麦芽糖和葡萄糖的发酵力强。两者通过 杂交,就得到了既能产酒精,又能将其残余的菌体综合利用作为面包厂和家用发面酵母的优 良菌种。 ()(parasexual reproduction或parasexuality) 顾名思义,准性生殖是一种类似于有性生殖但比它更为原始的一种生殖方式,它可使同 一生物的两个不同来源的体细胞经融合后,不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。准性 生殖常见于某些真菌,尤其是半知菌中。其主要过程见图7-31。 1 它发生在一些形态上没有区别的,但在遗传性上可以有差别的两上同种亲本 的体细胞(单倍体)间。发生联结的频率很低。 2 两个体细胞经联结后,使原有的两个单倍体核集中到同一个细胞中,于是 就形成了双相的异核体。异核体能独立生活。 3 在异核体中的双核,偶尔可以发生核融合,产生双倍体杂合子核。如构 巢曲霉 和米曲霉 核融合的频率为10-5-10-7。某些理化因素如樟脑蒸气、紫外线或高温等的处理,可以提高核融合的频率。 4 和单倍体化 体细胞交换即体细胞中染色体的交换,也称为丝分裂交换 。双 倍体杂合子性状极不稳定,在其进行有丝分裂过程中,其中的极少数核中的染色体会发生交 换和单倍体化,从而形成了极个别的具有新性状的单倍体杂合子。如果对双倍体杂合子用紫 外线、ν射线或氮荀等进行处理,就会促进促进染色体断裂、畸变或导致染色体在两个子细 胞中的分配不均,因而有可能产生各种不同性状组合的单倍体杂合子。
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