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荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病毒的作用

2017-11-27 7页 doc 23KB 15阅读

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荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病毒的作用荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病毒的作用 荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病 毒的作用               作者:梁荣感~刘卫兵~唐 祖年~徐庆 ?关键词?  荔枝核,黄酮类,呼吸道合胞病毒, 抗病毒作用     ?Abstract? AIM: To evaluate the antirespiratory syncytial viru...
荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病毒的作用
荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病毒的作用 荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病 毒的作用               作者:梁荣感~刘卫兵~唐 祖年~徐庆 ?关键词?  荔枝核,黄酮类,呼吸道合胞病毒, 抗病毒作用     ?Abstract? AIM: To evaluate the antirespiratory syncytial virus (RSV) effect of flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis in cell culture in vitro.  METHODS: By the method of cell culture and using ribavirin as a positive control, the cytopathic effect(CPE) was observed.  RESULTS: The TC50 and IC50 of the flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis was 152.9 mg/L and 58.6 mg/L respectively. The  therapeutic index (TI) was 2.6, It had the same effect as Ribavirin in antiRSV. Moreover, flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis also showed a concentrationdependent response in inhibiting RSV.  CONCLUSION: Flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis can inhibit RSV in Hep2 cells in vitro.     ?Keywords? semen litchi; Flavones; respiratory syncytial viruses (RSV);  antiviral effect     ?摘要? 目的: 探讨荔枝核黄酮 类化合物体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用.  方 法: 采用细胞培养技术~以病毒唑为阳性对照~观察比较 荔枝核黄酮类化合物对RSV引起的细胞病变(CPE)的抑制作 用.  结果: 荔枝核黄酮类化合物半数中毒浓度(TC50) 为152.9 mg/L~其抗RSV的半数有效浓度(IC50)为58.6 mg/L~治疗指数(TI)为2.6~体外抗RSV作用与病毒唑相当~ 且对RSV抑制作用存在明显的量效关系.  结论: 荔 枝核黄酮类化合物在Hep2细胞中对呼吸道合胞病毒有抑制 作用.     ?关键词? 荔枝核,黄酮类,呼 吸道合胞病毒,抗病毒作用      荔枝核是无患子科植物荔枝,Litchi Chinensis Sonn,的成熟种子. 又名荔仁或荔核~味甘、微苦~归肝、肾经. 功效行气散结、祛寒止痛. 荔枝核的化学成份包括甾类、皂甙、挥发油、鞣质、脂肪酸、聚合花色素成份、糖类、蛋白质以及无机盐,1-2,. 荔枝核有降血糖、调血脂和抗氧化、保肝作用. 其水提取物及黄酮类化合物的体外实验明~荔枝核对乙肝病毒HBsAg, HBeAg, HBVDNA有明显的抑制作用,3-4,. 我们旨在探讨荔枝核是否具有抗呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)的作用.     1材料和方法     1.1材料MTT,4,5二甲基噻唑2,5二苯基四唑溴化物~Sigma公司)~以无血清MEM培养基配制成5 g/L溶液~过滤除菌后置4?冰箱保存备用,MEM和RPMI 1640(Gibico公司),二甲基亚砜,DMSO~上海菲达有限公司),新生小牛血清(杭州四季清公司),10 mL/L鸡血由来亨公鸡翅下静脉取血~按1?4加入Alserver液后4?保存~使用时用生理盐水配成10 mL/L鸡红细胞悬液,RSV毒种为RSVLong株,香港中文大学,~于Hep2细胞中活化增殖~当细胞病变,CPE,达75%以上,,,时收获~滴定RSV滴度为 1×108TCID50(半数感染量)/L, Hep2细胞,武汉大学典型培养物保藏中心,~细胞生长液为RPMI 1640中加100 mL/L小牛血清、1×105 U/L青霉素及100 mg/L链霉素~细胞维持液除小牛血清为20 mL/L外~其余同细胞生长液,中药荔枝核黄酮类化合物由桂林医学院药理实验室提取分离~经定性试验和盐酸―镁粉检测为黄酮类化合物~总黄酮含量达853 g/kg~将药物用纯净水配成100 g/L 水剂~过滤除菌,阳性对照药病毒唑,又名利巴韦林~ Ribavirin~湖北医工所~批号0301006,~用生理盐水稀释至100 g/L备用.     1.2方法     1.2.1药物对Hep2细胞的毒性作用根据文献,5,检测药物对Hep2细胞的毒性作用. 用胰酶将生长良好的Hep2细胞分散成单个细胞悬液~按1×108/L的细胞密度分种于40孔板~每孔0.1 mL. 置37?, 50 mL/L CO2 培养箱中培养24 h. 待细胞长成单层后弃培养液上清~换含不同浓度的含药维持液~每种浓度重复4孔~并设正常细胞对照. 继续培养48 h后弃培养液上清~每孔加入含5 g/L MTT的无血清MEM培养基50 μL~置CO2培养箱中继续培养2,3 h后弃MTT上清~PBS洗3次~每孔加溶解液,DMSO: 乙醇体积比为1?1,100 μL~振荡5,10 min~待结晶完全 溶解后于96孔酶标测定仪上测定A570 nm值~并根据下式计算细胞存活率~计算药物对细胞的最大无毒浓度范围. 细胞存活率,%,=,实验孔A570 nm/对照孔A570 nm,×100%.     1.2.2药物对RSV增殖的抑制作用在已长成单层Hep2细胞的40孔板上接种RSV~每孔50 μL,100 TCID50,~33?吸附90 min后弃病毒上清. 根据细胞毒性实验的结果~在药物无毒浓度范围内加入不同浓度的含药维持液~每孔0 1.2 mL~然后将RSV培养板置33?~50 mL/L CO2培养~每日观察CPE. 隔日换新鲜含药维持液. 实验同时设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性药物病毒唑组和药物组. 当细胞发生病变时~细胞出现肿胀、变圆~折光性减弱~有合胞体形成. CPE方法为: -为无CPE~+为1%至25%细胞出现CPE. 为26%至50%细胞出现CPE,为51%至75%细胞出现CPE,为76%至100%细胞出现CPE. 约在病毒对照孔为,时弃培养液上清~每孔加入含5.0 g/L MTT的培养液50 μL~继续培养2,3 h后洗去MTT上清~每孔加DMSO溶解液100 μL~混匀5,10 min后测A570 nm值. 并按下述公式计算药物对RSV抑制率. 病毒抑制率,%,=,药物处理组A570 nm-病毒对照组A570 nm,/,细胞对照组A570 nm-病毒对照组A570 nm,×100%.     统计学处理: 用统计软件PEMS 3.1的加权直线回归法计算药物半数毒性浓度TC50和半数有效浓度IC50~得到药物治疗指数,Treatment Index, TI=TC50/IC50,.     2结果     2.1药物对Hep2细胞毒性作用表现Hep2细胞变圆~壁厚~胞质内颗粒增加~折光性增强. 不同浓度的荔枝核黄酮类化合物对Hep2细胞存活率的影响结果见表1.     表1不同浓度的荔枝核黄酮类化合物对Hep2细胞存活率的影响,%,     药物〖〗药物浓度,mg/L,10〖〗20〖〗40〖〗80〖〗160〖〗320〖〗640〖〗800〖〗1600〖〗50%毒性     浓度TC50〖BHDG2~WK7*4/5ZQ~WK6DW~WK5DW~WK6DW~WK5DW~WK5DW~WK5DW~WK5DW~WK5DW~ WK5DW~WK7DWW〗荔枝核黄酮类化合物〖〗100.0〖〗80.5〖〗74.3〖〗64.0〖〗53.0〖〗35.1〖〗25.5〖〗12.4〖〗8.6〖〗152.9病毒唑〖〗100.0〖〗80.2〖〗76.5〖〗65.0〖〗52.5〖〗34.2〖〗25.1〖〗13.2〖〗8.5〖〗154.9     2.2药物对RSV增殖的抑制作用RSV对Hep2细胞CPE表现为细胞肿胀、变圆~折光性减弱~有合胞体形成. 根据细胞毒性实验的结果~选择在无毒浓度范围内~将药物分别以不同的浓度进行抑制RSV实验~其病毒抑制率见表2.表2不同浓度的荔枝核黄酮类化合物作用后RSV病毒抑制率的变化     3讨论     RSV属于副黏病毒科肺炎病毒属~均为单负股RNA病毒~按血清学确认有两种亚型(A和B).在生物学表现方面RSV比其他病毒更接近于流感和副流感病毒,但在血清学和其他方面(例如不能在鸡蛋中生长及产生血凝素)可与之进行鉴别. RSV亚型每年反复流行~患者可反复感染. 虽然在5岁儿童中有70%存在血清抗RSV的抗体,但感染仍可不断发生于任何年龄. 几乎所有2岁以下的儿童都有过RSV感染,6,. 近年来又发现RSV感染是老年人和免疫抑制 成人的重要病毒,7,.     目前对RSV感染仍缺乏特异有效的治疗方法. 病毒唑被证明可以用于治疗RSV感染~但由于其毒性较大~只能雾化吸入~并且近年来随着对其疗效的争议使其临床应用受限,8,. 目前尚无安全有效的抗RSV感染的疫苗~因此抗RSV药物的研究成为近年来国际医药学界瞩目的课题. 近来有报道甘草、咽康片等在体外对RSV有抑制作用,9-10,~通过对抗病毒中草药筛选研究~我们发现荔枝核黄酮类化合物具有较强的抗RSV的功能~从结果可知随荔枝核黄酮类化合物浓度增加~抗病毒活性增强~表现为病毒抑制率升高. 经直线回归分析~荔枝核黄酮类化合物浓度与病毒抑制率间有直线关系. 荔枝核黄酮类化合物浓度在128 mg/L以上时~对RSV抑制程度达100%. 荔枝核黄酮类化合物对RSV的治疗指数为2.6. 将荔枝核黄酮类化合物和阳性对照药物相比~其IC50和TI无显著差异~说明荔枝核黄酮类化合物的体外抗RSV效果与病毒唑相当. 荔枝核黄酮类化合物是一类新型抗RSV天然化合物~其抗RSV病毒机制和体内抗RSV活性值得进一步研究.     ?参考文献?     ,1, 郑琳颖~韩超~潘竟锵~等. 荔枝核的化学、药理和临床研究概况,J,. 中医药学报~ 1998,(5):51-53.     ,2, 屠鹏飞~罗青~郑俊华~等. 荔枝核的化学成分研究,J,. 中草药~2002,33,4,:300-303.     ,3, 潘竞锵~郭洁文~韩超~等. 荔枝核的药理实验研究,J,. 中国新药杂志~2000,9 ,1,:14-16.     ,4, 徐庆~陈全斌~易祥辉~等. 荔枝核提取物对HepG2.2.15细胞系HBsAg与HBeAg表达的 影响,J,. 中国医院药学杂志~2004,24,7,:326-329.     ,5, Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays,J,. Immuno1 Methods, 1983,65:55-63.     ,6, Shay DK, Holman RC, Newman RD, et al. BronchiolitisAssociated hospitalizations among US children, 1980-1996,J,. JAMA, 1999,282(15):1440.     ,7, 金奇.  医学分子病毒学,M,. 北京: 科学出版社,2001:461-484.     ,8, 刘国荣.  预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的研究进展,J,. 中国实用儿科杂志,2001,16(7):435-438.     ; ,9, 董艳梅~李洪源~姚振江~等. 甘草体外抑制呼吸道合胞病毒作用研究,J,. 中药材~2004,27(6):425-427.     ,10,申元英~杨占秋~王晶~等.  咽康片抗呼吸道合胞病毒实验研究,J,.  实用中医药杂志~2004,20(6):284-285.

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