【2016年】脾气虚、肝郁脾虚及胃实热证患者阿魏酸药代动力学特征比较【临床医学论文】

【2016年】脾气虚、肝郁脾虚及胃实热证患者阿魏酸药代动力学特征比较【临床医学论文】 临床医学论文-脾气虚、肝郁脾虚及胃实热证患者阿魏酸药 代动力学特征比较 作者:任平，黄熙，李双庆，许树耘，万美华，周亚雄，周毅武，唐文富 【关键词】 脾虚证 ,摘要, 目的:应用药代动力学(pharmacokinetics, PK)方法研究中医证本质，探讨脾气虚、肝郁脾虚及胃实热证患者体内阿魏酸(ferulic acid, FA)的PK特征。方法:选择21例健康自愿者、20例肝郁脾虚证患者、22例脾气虚证患者和19例胃实热证患者，予以口服自拟加味逍遥散后，采用高效液相色谱法观察血清FA的PK参数。结果:与健康自愿者比较，脾虚证患者的吸收速度常数和消除速度常数均下降，表观一级吸收速率常数升高;肝郁脾虚证患者的吸收速度常数、消除速度常数和表观一级吸收速率常数均下降;胃实热证患者的消除速度常数和表观一级吸收速率常数均升高;差异有统计学意义。结论:脾气虚证患者PK特征表现为吸收速度加快，分布和排泄减慢;肝郁脾虚证患者PK特征表现为吸收、分布和排泄均减慢;胃实热证患者PK特征表现为吸收和排泄加快。提示三种中医证型患者的PK特征存在差异。 ,关键词, 脾虚证; 肝郁脾虚证; 胃实热证; 阿魏酸; 药代动力学 Pharmacokinetic characteristics of ferulic acid in patients with different syndromes of deficiency of spleen qi, stagnation of liver qi and spleen deficiency, and excess of stomach heat ABSTRACT Objective: To investigate the nature of syndrome of traditional Chinese medicine by means of pharmacokinetic (PK) method. Methods: Twentyone healthy volunteers, 20 patients with syndrome of stagnation of liver qi and spleen deficiency, 22 patients with syndrome of deficiency of spleen qi and 19 patients with syndrome of excess of stomach heat were included and administered to take Jiawei Xiaoyaosan Recipe (JWXYSR). The serum PK parameters of ferulic acid (FA) were examined by high performance liquid chromatography (HPLC) method. Results: The absorption rate constant (α) and the elimination rate constant (β) were both decreased while the apparent firstorder absorption constant (Ka) was enhanced significantly in the patients with syndrome of deficiency of spleen qi; the α, β and Ka were all reduced in the patients with syndrome of stagnation of liver qi and spleen deficiency; the β and Ka were increased in the patients with syndrome of excess of stomach heat, as compared with the corresponding PK parameters in the healthy volunteers (P,0.01). Conclusion: The PK analysis of FA in the patients with syndrome of deficiency of spleen qi shows that the absorption rate is accelerated, and both the distribution and elimination rates are slowed down. The absorption, distribution and elimination rates of AF are all slowed down in the patients with syndrome of stagnation of liverqi and spleen deficiency, while the absorption and elimination rates of AF are both accelerated in the patients with syndrome of excess of stomach heat. There are obvious differences in the PK characteristics among these three syndromes. KEY WORDS syndrome of deficiency of spleen qi; syndrome of stagnation of liver qi and spleen deficiency; syndrome of excess of stomach heat; ferulic acid; pharmacokinetics 1986年田中茂,1,发现不同中医证型患者其大黄酸的血药浓度存在一定差 异。1999年在黄熙“证治药代动力学(pharmacokinetics, PK)”假说,2,的 基础上，我们提出了“脾主药动学”假说――“脾”之运化主管药物在体内的吸 收、分布、代谢和排泄，即药物的PK过程,3,。近几年来，我们在这方面进行 了系列研究，初步发现脾虚证大鼠模型其川芎嗪、阿魏酸、甘草甜素和甘草次酸 的PK特征均表现为吸收快、消除慢，导致曲线下面积明显增加,4,9,。在此 基础上，我们比较了脾气虚、肝郁脾虚及胃实热证患者在服用自拟加味逍遥散方 后血清中阿魏酸(ferulic acid, FA)的PK特征，试图在临床上验证“脾主药 动学”假说。 1 材料与方法 1.1 主要仪器 美国Waters公司液相色谱系统，包括:600泵、7725手动 进样器、996二级管阵列器、Millennium 32色谱数据处理系统。 1.2 药品与试剂 自拟加味逍遥散方由当归25 g、芍药25 g、柴胡25 g、 茯苓25 g、白术15 g、薄荷15 g、牡丹皮25 g、栀子25 g、厚朴30 g、葛根 25 g等13味中药组成。药材均购自陕西省药材公司，经西北大学植物解剖学研 究室胡正海教授鉴定为正品。该方在原逍遥散功效的基础上，加强行气、降气之 功，经10余年的临床应用观察，发现其对肝郁脾虚证功能性消化不良患者的疗 效颇佳,10,。加味逍遥散水煎液的制备:按生药5 g/kg标准，将称取的药材置于砂锅内，加入6倍体积的水浸泡30 min。在电炉上用武火(3 200 W)煎沸后以文火(1 200 W)慢煎60 min。用不锈钢筛过滤后取出药液，再加4倍的水进行第2次煎煮。将两次滤得的药液混合后浓缩至400 ml，浓度相当于含生药0.825 g/ml，冷却后置于高温消毒的玻璃瓶中，置于4 ?冰箱内冷藏。用时充分摇匀，温服。 阿魏酸，购自中国药品生物制品检定所，批号7739203，经高效液相色谱(highperformance liquid chromatography, HPLC)检测为单一色谱峰(归一化法测定纯度均为99.3%)。 受试者纳入及排除标准 健康志愿者来自四川大学华西医院和第四军 1.3 医大学西京医院的学生及工作人员，共21名，其中男11名，女10名;平均年龄(40.2?6.9)岁。另选择西京医院2003年3月,2004年11月的住院患者61例，其中男28例，女33例;平均年龄(43.7?7.7)岁;参照文献,11,，中医辨证为肝郁脾虚证20例，脾气虚证22例、胃实热证19例;西医诊断为慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠球炎、十二指肠溃疡、冠心病、高血压及动脉粥样硬化等。排除标准:排除体重减轻、胃肠道出血性疾病、反流性胃炎、肠激惹综合征、机械性肠梗阻、有胃肠手术史、心肺功能不全、心律失常、恶性疾病，以及肝、肾、造血系统等原发性疾病及其它严重的系统性疾病。 健康人空白混合血清由西京医院输血中心提供。 1.4 试验方法 试验方案经两所医院伦理委员会批准通过，试验前所有受试者均签署知情同意书。 1.4.1 药效学研究 为随机开放临床研究。受试者洗脱期为3 d，停用一切影响胃动力及分泌功能的药物(抗胆碱能药物、解痉药、止吐药、止痛药、H2受体拮抗剂等);同时确认患者未服用避孕药、抗抑郁药及安眠药，未饮用酒精 类饮料、茶和咖啡。治疗期间，患者单纯服用加味逍遥散水煎液150 ml，2次/d，共10 d。 1.4.2 口服加味逍遥散水煎液后血清中阿魏酸测定的色谱条件 固定相:Kromasil C18柱(250×4.6 mm, 5 μm, No. C18B 011220);流动相:甲醇?水?冰醋酸(体积比),40?59.6?0.4，pH 3.8;流速1.0 ml/min;检测波长322 nm;内标:对羟基苯甲醛。FA保留时间,(10.28?0.16)min，对羟基苯甲醛保留时间,(7.33?0.13)min。 1.4.3 阿魏酸标准溶液的配制 精确称取阿魏酸标准品3.91 mg，置于50 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度线得母液1(78.2 μg/ml)，再稀释20倍得母液2(3.91 μg/ml)。将配制好的标准溶液密封后置于4 ?冰箱内避光备用。 给药与采血 受试者禁食15 h后，于次日晨8,9时按2 ml/kg 1 1.4.4 次口服加味逍遥散水煎液。分别于给药前及给药后5、10、15、30、60、90、120 min共8个时间点采取静脉血各1.5 ml，置于塑料离心管中，,20 ?冰箱内冻存备用。 1.4.5 血清样品预处理 取待测血清1 ml置于5 ml塑料高速离心管中，加入对羟基苯甲醛10 μl(剂量为239.4 ng)，用电动混匀器混匀45 s，加入3.5 ml乙腈后再次电动混匀5 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液移至5 ml塑料试管中，57 ?水浴，氮气流下吹干，用100 μl流动相复溶，10 000 r/min离心10 min，取上清50 μl进样。 1.4.6 制作标准曲线 取健康人空白混合血清各1 ml置于5 ml塑料高速 离心管中，加入不同体积的阿魏酸标准液，使所含阿魏酸剂量分别为7.82、 19.55、39.13、78.25、97.75、117.30、156.42、195.54 ng，分别加入10 μl 对羟基苯甲醛充分混匀，加入一定体积的乙腈使每管总体积均为4 560 μl。按 上述血清样品预处理方法进行处理，HPLC测样，共测定8组。以测定液中阿魏 酸与内标峰面积之比(Y)对测定液中阿魏酸的量(X)作线性回归，得到标准曲 线方程及相关系数r。确定最低检测限，计算最低检测限浓度。 1.4.7 药代动力学参数计算 采用中国药理学会数学药理专业委员会开发 的3P97软件，将测得的血药浓度进行PK拟合。以拟和优度和赤池信息判据判定 曲线拟和程度，F检验选择房室模型。 2 结果 2.1 FA分离情况 FA峰与内标峰、血清内源性物质及加味逍遥散吸收入血 的其它成分峰均能很好地实现基线分离，无杂峰干扰;与FA标准品在相同条件 下进行对照，保留时间均为10.5 min;对其紫外吸收峰予以定性，样品的 最大紫外扫描波长在321.3 nm处，与FA标准品一致。见图1、2。 图1 不同血清样品中阿魏酸的高效液相色谱图(略) Figure 1 HPLC results of ferulic acid (FA) in different serum samples A: Blank control serum sample from healthy person; B: FA and phydroxybenzaldehydetreated serum sample from healthy person; C: Jiawei Xiaoyaosan Recipe (JWXYSR)treated serum sample from patient; a: FA; b: phydroxybenzaldehyde. 图2 不同血清样品中阿魏酸的紫外光谱图(略) Figure 2 Ultraviolet spectrograms of FA in different serum samples A: FA and phydroxybenzaldehydetreated serum sample from healthy person; B: JWXYSRtreated serum sample from patient. 2.2 FA线性范围与标准曲线 血清FA浓度为7.82,195.5 ng/ml，线性关 系良好。标准曲线方程为Y,0.002 418，0.013 905X，r,0.997 13，满足生物 实验定量分析要求。 2.3 健康志愿者和不同中医证型患者服用加味消遥散后不同时间点血清中 FA的血药浓度 健康人和患者血清中FA的血药浓度均可在服药5 min后测出， 且个体差异明显。见表1。 2.4 健康志愿者和不同中医证型患者服用加味消遥散后不同时间点血清中 FA药代动力学参数 不同中医证型患者口服加味逍遥散后，FA在体内的药物代 谢过程呈开放性二室模型。脾气虚证患者的PK特征:吸收速度加快，分布和排 泄减慢;肝郁脾虚证患者的PK特征:吸收、分布和排泄均减慢;胃实热证患者 的PK特征:吸收速度和排泄均加快。见表2。 表 1 健康志愿者和不同中医证型患者服用加味消遥散后不同时间点血清 中FA的血药浓度(略) Table 1 Serum concentrations of FA at different time in healthy persons and the patients with different syndromes after taking JWXYSR DSQ: Syndrome of deficiency of spleen qi; SLQSD: Syndrome of stagnation of liver qi and spleen deficiency; ESH: Syndrome of excess of stomach heat. 表2 健康志愿者和不同中医证型患者服用加味消遥散后血清FA药代动力 学参数(略) Table 2 Pharmacokinetics parameters of serum FA in healthy persons and the patients with different syndromes after taking JWXYSR α: Absorption rate constant; β: Elimination rate constant; Ka: Apparent firstorder absorption constant; t1/2α: Halflife of α distribution phase; t1/2Ka: Absorption halflife; K21 and K12: Apparent firstorder intercompartmental transfer rate constants; K10: Apparent firstorder elimination rate constant from the central compartment; AUC: Area under the plasma drug concentrationtime curve; tp: time of peak plasma concentration; Cmax: Maximum drug concentration in plasma; **P,0.01, vs normal control group. 3 讨论 PK研究是用数学模型反映药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程，具 有整体、综合、动态和定量的特点。影响PK特征的主要因素包括个体差异、年 龄、疾病和生理等方面,12,。目前对中医“证”本质的研究大多采用以方测证的研究模式，例如研究某证时，主要观察某方药对与该证相关的病理生理、分子生物学或生物化学等指标的影响，属药效学范畴，是从药物作用机制的角度进行研究。而“脾主药动学”则是从机体作用于药物的角度研究“证”，即用药代动力学方法研究复杂的脾虚证本质，进而定性、定量地予以“辨证施治”，探索“证”本质研究的新途径。 自拟加味逍遥散方具有舒肝行气、健脾补气，兼降气清热之功效，主治肝郁脾虚证，临床疗效确切;从药物性味功效看，该方对脾气虚证和胃实热证亦无不良作用，故将其选为“证”PK特征临床研究的工具药。 本临床研究结果显示，临床不同“证”血清FA的PK特征同样存在着明显差异。脾气虚证患者PK参数与健康人比较，分布速度常数α和消除速度常数β下降，一级吸收速率常数Ka升高，提示脾气虚证患者PK特征为吸收速度加快，分布和排泄减慢。对比既往研究中脾虚证大鼠川芎嗪、甘草甜素等PK特征的结果,4,9,，我们发现患者FA的PK特征与脾虚证大鼠的川芎嗪、甘草甜素PK特征相似。肝郁脾虚证患者PK主要参数变化为α、β和Ka均下降，由此推断其PK特征为吸收、分布和排泄均减慢。胃实热证患者β和Ka均下降，表明其PK特征为吸收和排泄加快。上述研究结果为临床辨证提供了量化依据。 通过研究脾虚证PK特征的机制，我们发现脾虚时胃肠运动功能的减弱与脾虚证PK特征密切相关,8,9,。胃肠道是影响药物体内吸收过程的重要因素之一。胃肠运动功能的减弱，减少了药物与胃肠黏膜(尤其是小肠黏膜)的接触，进而降低药物在吸收方面的量和速度，即生物利用度下降，这与中医学强调的“有胃气则生、无胃气则死”不谋而合。肝郁脾虚证和胃实热证患者PK特征的形成机制尚有待进一步研究。 ,参考文献, 1 田中茂. 血中浓度测定法对汉方方剂“证”与疗效决定法的开发. 国外医学?中医中药分册, 1989, 10(8): 5859. 2 黄 熙, 马 援, 蒋永培, 等. “证治药动学”假说的科学依据与前景. 见: 陈可冀主编. 迈向21世纪的中西医结合. 北京: 中国医药科技出版社, 1991. 207216. 3 任 平, 黄 熙. “脾”与药动学的关系:理论和实验依据. 世界华人 消化杂志, 1999, 7(12): 10771080. 4 黄 熙, 任 平, 文爱冬, 等. 脾虚大鼠川芎嗪的药物动力学特征与血 液流变学研究. 中国中西医结合杂志, 1994, 14(3): 134, 159161. 5 文爱冬, 黄 熙, 蒋永培, 等. HPLC法测定血瘀证兔血清中游离阿魏酸. 药学学报, 1995, 30(10): 762767. 6 黄 熙, 蒋永培, 臧益民, 等. 心血瘀阻犬的川芎嗪药物动力学特征与 血流动力学研究. 中国中西医结合杂志, 1996, 16(6): 352354. 7 Jian YP, Wen AD, Huang X, et al. Pharmacokinetics of tetramethylpyrazine phosphate in healthy and blood stasis dogs in vivo. Chin J Integr Tradi West Med, 1996, 2(2): 132134. 8 任 平, 黄 熙, 蒋永培, 等. 四君子汤对脾虚大鼠胃动素及川芎嗪药 物动力学特征的影响. 中国中西医结合杂志, 1997, 17(1): 4547. 9 任 平, 黄 熙, 张 莉, 等. 不同脾虚时期大鼠甘草甜素药物动力学 特征及其机制的探讨. 成都中医药大学学报, 2000, 23(2): 3032. 10 黄 熙, 任 平, 杨少文, 等. 胃脘痛证型、胃电图与胃镜结果的关系及其用逍遥散治疗的影响.陕西中医, 1992, 13(8): 337339. 11 周仲瑛. 中医内科学. 北京: 中国中医药出版社, 2003. 12 邓树海, 张秀珍, 邹立家. 药物动力学与生物药剂学. 天津: 天津科技翻译出版公司, 1992. 2038.