Dapper1是核质穿梭蛋白并在细胞核内抑制Wnt信号

Dapper1是核质穿梭蛋白并在细胞核内抑制Wnt信号 Dapper1是核质穿梭蛋白并在细胞核内抑制Wnt信号 Dapper1是核质穿梭蛋白并在细胞核内抑制Wnt信号 由β-catenin和LEF/TCF家族转录因子激活的经典Wnt信号通路,通过调控细胞增殖、分化以及存活过程中所涉及的重要基因的达在胚胎发育和癌症发生过程中起着重要的作用。Dapper1(Dpr1),作为Dishevelled的相互作用因子,被认为可以通过促进Dishevelled降解来调控Wnt信号。本研究中我们证明了Dpr1穿梭于细胞质和细胞核之间。尽管过量表达的Dpr1被发现主要存在于细胞质中,内源的Dpr1定位于整个细胞并且Wnt1刺激能够促进它的细胞质聚集。Exportin抑制剂Leptomycin B处理能够引起内源以及过量表达Dpr1聚集于细胞核中,表明Dpr1穿梭于细胞质和细胞核之间。我们进而发现了Dpr1的入核信号NLS以及出核信号NES。利用报告基因实验以及体内斑马鱼胚胎实验,我们证明了细胞核定位的Dpr1突变体依然保持抑制Wnt信号的能力。进而我们发现Dpr1分别和β-catenin以及LEF1相互作用并破坏它们之间复合物的形成。此外,Dpr1可以和HDAC1结合并增强LEF1-HDAC1相互作用。总之,我们的发现提示Dpr1在细胞核内通过保持LEF1处于转录抑制状态来负调控 Wnt/β-catenin信号的基础活性。因而,Dpr1既能在细胞质又能在细胞核内调控Wnt/β-catenin信号。 摘要4-5ABSTRACT5-12第1章 引言12-34 1.1 Wnt 及其信号转导通路12-22 1. 1.1 Wnt 基因的发现及Wnt 信号传导通路的建立13-14 1. 1.2 经典Wnt 信号通路14-15 1. 1.3 非经典Wnt 通路15-16 1. 1.4 经典 Wnt 通路的传递及调控16-22 1.2 Dapper 蛋白家族的研究22-27 1. 2.1 Dpr 的发现22-23 1. 2.2 Dpr 蛋白的结构域特征23-24 1. 2.3 Dpr 在胚胎发育中的功能24-25 1. 2.4 Dpr 对Wnt 信号的调控25-26 1. 2.5 Dpr 在TGF-β/Nodal 信号通路中的作用26 1. 2.6 Dpr 与肿瘤的关系26-27 1. 2.7 Dpr 的亚细胞定位27 1.3 信号分子的核质穿梭27-33 1. 3.1 核孔复合体(nuclear pore plex, NPC)简介27-28 1. 3.2 跨核膜转运受体28-29 1. 3.3 特异的定位信号序列29-30 1. 3.4 跨核膜转运机制30-32 1. 3.5 Wnt 信号通路分子的核质穿梭现象32-33 1.4 本研究的目的及内容33-34第2章 实验材料与方法34-42 2.1 实验材料34-36 2. 1.1 主要试剂34 2. 1.2 溶液配置34-36 2.2 实验仪器36 2.3 实验方法36-42 2. 3.1 细胞培养36 2. 3.2 细胞转染36-37 2. 3.3 免疫印迹37 2. 3.4 免疫共沉淀37-38 2. 3.5 siRNA 质粒的构建38 2. 3.6 稳定细胞系的建立38-39 2. 3.7 细胞总 RNA 提取及反转录 PCR39 2. 3.8 染色体免疫共沉淀39 2. 3.9 报告基因检测39-40 2. 3.10 免疫荧光40-41 2. 3.11 体外转录和显微注射斑马鱼胚胎41 2. 3.12 流式细胞仪方法检测细胞周期41-42第3章 Dpr1 是一种核 质穿梭蛋白质42-51 3.1 Dpr1 的亚细胞定位42-44 3. 1.1 外源Dpr1 的亚细胞定位42-43 3. 1.2 内源Dpr1 的亚细胞定位43-44 3.2 Dpr1 的定位信号序列44-49 3. 2.1 Dpr1 信号序列的大概定位44-46 3. 2.2 Dpr1 有高度保守的出核定位信号(NES)46-47 3. 2.3 Dpr1 蛋白有高度保守的入核定位信号(NLS)47-49 3.3 总结与讨论49-51第4章 Dpr1 在核内抑制Wnt 信号51-58 4.1 核内Dpr1 在细胞水平的抑制作用51-55 4. 1.1 核内Dpr1 对Wnt-1 激活的报告基因的作用51-52 4. 1.2 核内Dpr1 对β-catenin 激活的报告基因的作用52-54 4. 1.3 核内Dpr1 对响应报告基因基底水平的作用54-55 4.2 核内Dpr1 在体内的抑制作用55-56 4.3 核内 Dpr1 突变体不影响 Dvl2 的稳定性56 4.4 核内 Dpr1 突变体不影响 β-catenin 入核56-57 4.5 总结与讨论57-58第5章 Dpr1 在核内抑制Wnt 信号的作用机制158-67 5.1 Dpr1 与LEF1 相互作用58-59 5. 1.1 Dpr1 与LEF1 特异结合58-59 5. 1.2 Dpr1 的C 端是与LEF1 结合的区域59 5.2 Dpr1 与 β-catenin 相互作用59-63 5. 2.1 Dpr1 与β-catenin 特异结合59-61 5. 2.2 Dpr1 的C 端是与β-catenin 结合的区域61 5. 2.3 β-catenin 的266-408 对与Dpr1 的结合重要61-63 5.3 Dpr1 在核内干扰 β-catenin/LEF1 复合物的形成63-66 5. 3.1 Dpr1 在核内打散β-catenin/LEF1 复合物63-64 5. 3.2 RNAi 沉默Dpr1 增强β-catenin/LEF1 复合物64-65 5. 3.3 核内Dpr1 干扰β-catenin 与DNA 结合65-66 5.4 总结与讨论66-67第6章 Dpr1 在核内抑制Wnt 信号的作用机制267-74 6.1 Dpr1 与HDAC1 相互作用67-69 6. 1.1 Dpr1 与HDAC1 相互作用67-68 6. 1.2 Dpr1 的N 端和C 端分别与HDAC1 结合68-69 6.2 HDAC1 在核内增强Dpr1 对Wnt 信号的抑制69-70 6. 2.1 HDAC1 增强核内Dpr1 对Wnt 信号的抑制69 6. 2.2 TSA 部分挽救核内Dpr1 对Wnt 信号的抑制69-70 6.3 Dpr1 在核内增强HDAC1 和LEF1 的相互作用70-73 6. 3.1 Dpr1 在核内增强HDAC1 和LEF1 的相互作用70-72 6. 3.2 Dpr1 在核内增强HDAC1 与DNA 的结合72-73 6.4 总结与讨论73-74第7章 Dpr1 影响细胞周期的正常运转74-78 7.1 RNAi 沉默 Dpr1 稳定细胞系的建立74 7.2 Dpr1 抑制 Wnt 下游靶基因的表达74-76 7. 2.1 Dpr1 表达沉默上调 Wnt 靶基因 mRNA74-75 7. 2.2 Dpr1 表达沉默上调Wnt 靶基因启动子表达75-76 7.3 Dpr1 抑制细胞周期76-77 7. 3.1 Dpr1 表达沉默增强细胞突破G1 arrest 的能力76 7. 3.2 核内Dpr1 表达抑制细胞突破G1 arrest 的能力76-77 7.4 总结与讨论77-78结论78-80 参考文献 80-92致谢92-93个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果93