牛初乳中乳铁蛋白提取纯化技术方法比较分析

牛初乳中乳铁蛋白提取纯化技术方法比较分析 牛初乳中乳铁蛋白提取纯化技术方法比较 分析 农产食品科技2010,4(4):34,38AcuhuralFoodProductsScienceandTechnology 牛初乳中乳铁蛋白提取纯化技术方法比较分析 刘江丽,刘妍妍,张丽萍L※ (1.黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆163319;2.黑龙江省农产品加~2212 程技术研究中心,黑龙江大庆163319) 摘要:乳铁蛋白是一种铁结合性糖蛋白,在牛初乳中含量高达1g/L,是常乳含量的 五倍.乳铁蛋白具有 抗菌,抗氧化,抗病毒,抗癌症等多种生物学功能,95%纯度的乳铁蛋白每公斤价值 1000$.近些年来,乳铁蛋 白的分离纯化技术研究达到了较高水平,主要有离子交换色谱法,盐析和凝胶层析 法,超滤和离子交换色谱法 结合,混合模式扩张床吸附法等,但是能够直接工业化生产的方法还有待于进一步 研究和完善. 关键词:乳铁蛋白;提取;纯化;:r业化生产 中图分类号:TS252.42文献标识码:A ComparisonandAnalysisontheTechnologyofExtractingandPurifying LactoferrinfrOmBovineColostrum IIUJiang—li.LIUYan—yan.ZHANGLisping' (1.CollegeofFoodScience,Heilon~iangBayiAgriculturalUniversity,Heilon~iangDaqing 163319,China;2. Agri-FoodProcessingandEngineeringTechnologyResearchCenterofHeilongfiangProvi nce,Heilongfiang Daqing163319,China) Abstract:Lactoferrinisaniron— bindingglycoprotein.Thecontentoflactoferrininbovinecolostrumisuptol g/L,whichisfivetimeshigherthanthatinthemilk.Lactoferrinhasmanybiologicalfunctionssuchasantibacterial, antioxidant,antiviralandanticaneerere.Thevalueoflactoferrinwithapurityof95%is1000dollarperkilogaram. Therearemanymethodsforisolationandpurificationoflactoferrin.Inrecentyears,technologiesforlactoferrin separationandpurificationtechnologyreachedahighleve1.Themainmethodsincludeion— exchangechromatography, salting— outandgelchromatographymethod,ultrafiltrationandion-exchangechromatographyandmixed—mode expandedbedadsorption.Themethodsfordirectindustrialproductionwillbeenfurtherstudiedandimproved. Keywords:Lactoferrin(E1);Extract;Purification;Industrialization 乳铁蛋白(Laetoferrin,L0是1939年由Sorensen 等在动物乳中发现的一种功能因子【11.研究表明, 乳铁蛋白在牛初乳中的含量最高,达到1g/L,乳 铁蛋白在乳清中含量为30,100mg/Li1. 许多国家对乳铁蛋白开展了研究,如美国的 Baylor医学院,Agennix公司,Genpharm公司,荷兰 的Pharming公司,日本的MoriageMilkZndustryCo Ltd,SnowBrandMilkProdCoLtd等都对乳铁蛋白 进行了深入研究.除此以外,美国食品药品管理局 (FDA)允许乳铁蛋白作为食品添加剂用于运动,功 能性食品.在日本,韩国也允许乳铁蛋白作为食 收稿日期:2010—09—30 作者简介:刘江丽(1984一),女,硕士研究生,研究方向:食品科 学E-mail:liu.jiangli163@163.corn. 通讯作者 品添加剂. 近几年,我国有条件的生产企业利用初乳加 工干粉制品作为保健食品,而偏僻的奶牛场,其初 乳大部分被丢弃掉,造成很大的浪费.若按每头奶 牛产初乳10kg计算(IJf质量浓度为1g门L),我国 约有乳牛220万头,乳铁蛋白的含量一般为1 g/L,若按70%的提取率计算,仅此一项乳铁蛋白 的产量可达l5.4t.我国婴儿乳粉生产量居世界 第一,乳铁蛋白是婴)L-~L粉的重要添加剂,其需求 量极大,但是乳铁蛋白的供应全部依赖进口,95% 纯度的乳铁蛋白每公斤价值1000$p1.因此,解决 乳铁蛋白的生产关键技术是当前重要的课题. 1牛乳中乳铁蛋白的含量及结构 I』主要存在于哺乳动物乳中,与B一乳球蛋 2010刘江丽等:牛初乳中乳铁蛋白提取纯化技术方法比较分析35 其他 白以一种弱的离子作用力结合,除乳汁外,消化和生殖系统的外分泌液中也含有一定量的 Eft1.商业上使用的乳铁蛋白一般是由乳牛的牛乳 中提取. 牛乳中的乳铁蛋白含量比人乳中的含量低得 多.母牛产后第ld初乳中的质量浓度可达1g/L以 上,24h后降至0.42,15h以后降至0.22g/L,同 一 个个体常乳中质量浓度约为初乳的20%f5J. 乳铁蛋白是一种铁结合性糖蛋白,它的分子 主体是一个大约有700个氨基酸残基构成的多肽 链,相对分子量约为80ku.该多肽链可以折叠成 两个球状叶,一端是氨基末端叶,一端是羧基末端 叶,每一叶状结构都含有一个Fe和一个碳酸氢 阴离子结构部位,每一叶都能高亲和性地可逆的 与铁结合.其中,Fe结构位于一个很深的裂缝 中,当铁离子缺乏时,每一片叶片可以曲折,使裂 缝打开或关闭,但当多肽链已同铁离子结合时则 裂缝处于闭锁状态l6l,其结构如图1,2. 图1结合铁的乳铁蛋白立体结构图 图2不结合铁的乳铁蛋白立体结构图 2乳铁蛋白的生物活性 人体中的乳铁蛋白有助于人体对铁的吸收, 这是因为乳铁蛋白通过它的氨基和羧基末端两个 铁结合区域能高亲和的,可逆的与铁结合,并维持 铁元素在一个较广的pH值范围内完成在十二指 肠细胞的吸收和利用.除两个铁结合位点外,其他 部位也可吸附铁离子,而且如果体内铁处于过剩 状态下,乳铁蛋白则可明显减缓铁对肠道的刺激 作用I7l. 体内外试验表明,乳铁蛋白具有广谱的抗菌 作用,并能预防微生物感染.由于乳铁蛋白的高度 铁结合亲和性,能使细菌失去所需生长的基本养 份铁,达到抑菌作用;另外,通过乳铁蛋白N一末端 强阳离子杀菌区域(一个独特的铁结合区域),直接 起到杀菌作用.除了乳铁蛋白的抑菌和杀菌作用之 外,从激活的中性白血球中释出的乳铁蛋白能通 过调节全身免疫应答而发挥出抗微生物活性【8j. 有研究显示,乳铁蛋白具有调节巨噬细胞活 性和刺激淋巴细胞合成的能力191.可以抑制HIV和 细胞巨化病毒,疤疹1和2型病毒,肝炎病毒,流感 病毒和旋病毒等.乳铁蛋白能降解酵母中的tR— NA,具有核糖核酸酶的活性,且能抑制超氧离子 的形成,从而降低人体内自由基对动脉血管壁弹 性蛋白的破坏,达到预防和治疗动脉粥样硬化和 冠心病的目的}l0】.乳铁蛋白对消化道肿瘤,如结肠 癌,胃癌,肝癌,胰腺癌,具有预防作用,并可抑制 由此引发的肿瘤转移【ll】.另外乳铁蛋白在启动宿 主防御系统的初始活化反应,调控不同类型淋巴 细胞比例的改变对机体免疫反应的影响,提高免 农产食品科技2010 疫力等方面都起到了促进作用【】1. 乳铁蛋白能促进动物肠道中双歧杆菌和乳酸 杆菌等有益菌群的生长,抑制有害菌群的繁殖,因 此乳铁蛋白可以作为营养强化剂用于乳制品及其 他益生菌的功能性食品中】. 3乳铁蛋白的分离提取方法 乳铁蛋白是牛乳中的一种天然物质,是婴儿 乳粉的重要添加剂,我国乳铁蛋白的生产技术还 不十分成熟,因此,其供应全部依赖进口.近些年 来,很多学者对乳铁蛋白的提取技术进行了深入 探讨,形成了很多重要的参考理论与方法,这对进 一 步的工厂化生产技术研究提供了极好的基础. 最早的乳铁蛋白分离技术研究起始于1960年, Groveeslol使用DEAE纤维素阴离子交换树脂,从 牛初乳分离乳铁蛋白成分.目前乳铁蛋白的分离 方法主要有离子交换色谱法,盐析结合凝胶层析 法,超滤结合离子交换色谱法,混合模式扩张床吸 附法,模拟移动床色谱连续分离纯化技术等方法. 3.1离子交换色谱法 离子交换色谱法原理是根据离子交换剂对不 同的离子或离子化合物的结合力不同而实现目标 物质的分离.离子交换剂是由基质,电荷基团f功 能基团)和反离子构成,它在水中呈不溶状态,它 能与溶液中其它离子或离子化合物相互结合,其 结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的.由 于蛋白质是两性电解质,在pH低于其等电点时, 其带正电,能被阳离子交换剂吸附;在pH高于其 等电点时,其带负电,能被阴离子交换剂所吸附_l4l. 吕立获等(2005年)讨论了从牛初乳中分离 乳铁蛋白的工艺J.结果表明,牛初乳经过f4800 r/min,1,5?),离心30min脱脂得到脱脂乳,加 入带羧甲基的弱酸性阳离子交换剂CM—Sepharose FastFlow在4下进行动态吸附,用去离子水将 没有吸附上的杂蛋白冲洗掉,然后使用质量分数 为1.5%和5%的NaC1溶液进行阶跃洗脱,经过两 步阶跃洗脱得到的乳铁蛋白纯度可达95%以上. 傅维琦等(2006年)从牛初乳中分离提取乳 铁蛋白,建立快速分离纯化乳铁蛋白的工艺ll6】.选 择弱酸性阳离子交换剂CM—SEPHAROSEFAST FLOW装柱,脱脂牛初乳在4?下进行动态吸附 上柱后进行阶跃洗脱.通过对洗脱条件的比较优 化,确定了分离提取乳铁蛋白的最佳工艺条件为: 牛初乳料液pH6.6,在一4cc,4?进行离心脱脂 30min.离子交换层析采用Bio—Red的BiologicLP 系统(柱型1.6em×50on),在4?条件下上柱速 度300mL/h,洗脱剂的体积分数分别为1.5%和 5.0%的NaC1,洗脱体积流速200mL/h.洗脱后,采 用截流相对分子量为5000聚砜膜的超滤膜进行 超滤,经冷冻干燥得到冻干粉,纯度可达98.98%, 得率为29.O%. 李岩等(2007年)将纯度为50%左右的乳铁 蛋白溶液加入带羧甲基的弱酸性阳离子交换剂 CM—SepharoseFastFlow进行动态吸附,采用质量分 数为1.6%和5%的NaCI溶液进行阶跃洗脱,并对 层析过程和接样方法进行了优化】.结果表明,经 过对纯化方法的优化,乳铁蛋白纯度可达96.7%. 3.2盐析和凝胶层析法结合 徐丽萍等(2007年)利用超滤,盐析和层析三 种方法,采用单因素实验和正交实验对酸牛乳清 中的乳铁蛋白进行分离和纯化,得到盐析的最佳 条件为:使用CA膜(醋酸纤维素)板式超滤器,工 作压力0.15MPa,料液温度4Occ.两次超滤,一次 浓缩得到乳铁蛋白粗品.再以50%硫酸铵除去杂 蛋白,然后在30?,pH8.5条件下,用80%硫酸铵 进行盐析.用CM—SephadexC一100进行层析,进样 量为2mL,洗脱液pH为7.4时,可以得到乳铁蛋 白纯品.SDS—PAGE凝胶电泳结果表明,牛初乳 中乳铁蛋白的纯度为92%,分子量大约为78000? 2000DaI 曲练达等(2006年)采用3次盐析法和1次凝 胶层析法从来源丰富的牛初乳中分离纯化.牛 初乳在4?条件下,4000r/min离心40min,脱去 脂肪.调pH至4.6,于室温放置20min后,4?条 件下,10000r/min离心40rain,除去酪蛋白,得到 乳清.用30%的饱和硫酸铵沉淀30min后,4?条 件下4000r/rain离心40min;将得到的上清液再 用50%的饱和硫酸铵沉淀30min后,4?条件下 4000r/min离心40min,除去免疫球蛋白沉淀;将 得到的上清液用85%的饱和硫酸铵沉淀30min, 在pH8.5的条件下,4?,4000r/min离心40 min,后进行凝胶层析.选用SephadexG一100在 20?条件下以0.2mL/min的流速进行洗脱,洗脱液 选用pH7.4,并利用电泳和分光光度法检测其纯度 和含量,所获得的乳铁蛋白的分子质量为90000U, 纯度大约为92%. 3.3超滤和离子交换色谱法结合 江南大学卢蓉蓉等(2006年)采用酶法去除 2010刘江丽等:牛初乳中乳铁蛋白提取纯化技术方法比较分析37 酪蛋白,膜分离技术和工业色谱技术相结合,从牛 初乳中工业化分离乳铁蛋白12Ol.在牛初乳脱脂乳 清中,加入皱胃酶液,加酶量控制在使初乳10, 15min凝固为宜,pH调节至6.0,酶反应温度为 40qC,初乳凝固后保温30min,离心去除酪蛋白, 经预过滤后采用板式膜组件和醋酸纤维素膜材 进行两步超滤, 料,以错流方式操作的超滤系统, 超滤工艺参数为:切向流速3,4L/min,临界操作 压力0.10,0.15MPa,操作温度45?,55?,得 到截留浓缩液即乳铁蛋白粗制品后,选用SP SepharoseFastFlow强阳离子交换剂,装柱,柱尺 寸为7.0X20cm,以pH值为7.7,8.0,10mmol/L 的磷酸盐为起始平衡缓冲液,截留浓缩液上样,洗 脱速度2L/h,先采用0.5mol/L的NaC1溶液洗脱 其它组分,至洗脱吸收值回复至基线水平,再采用 1mol/L的NaC1溶液洗脱乳铁蛋白组分,至洗脱 吸收值再次回复至基线水平作为洗脱结束,收集 该乳铁蛋白组分的洗脱液,经超滤脱盐,浓缩和冷 冻干燥,得到纯度为90%以上的乳铁蛋白精制 品.初乳的批处理量为300kg.鉴定专家一致认为 该工艺降低了生产成本,攻克了工业化分离纯化 技术难点. 3.4混合模式扩张床吸附法 扩张床吸附(expandedbedadsorption,EBA)是 一 项新型的生物分离技术,能直接从发酵液,细胞 培养液或匀浆液中捕获目标产物,集固液分离,浓 缩和初步纯化于一个操作单元之甲.混合模式吸 附层析(mixed—modechromatography)是近年开发的 生物分离新方法,其功能配基同时含有疏水基团 和离子交换基团,兼具疏水作用和静电相互作用, 可以通过静电相吸来强化吸附或静电排斥来协助 解吸,具有广阔的应用前景.同时配基密度通常比 较高,具有典型的耐盐吸附性能,对目标蛋白有很 强的捕获能力,可以从较低浓度的体系中富集目 标蛋白,特别适合于生物对象初分离的要求.将扩 张床吸附和混合模式吸附层析有机地结合起来, 实现混合模式扩张床吸附,可以充分发挥二者的 优势,达到低原料要求,高处理量和高选择性的分 离目标[21,22J. 林东强等(2009年)采用混合模式扩张床吸 附介质StreamlineDirectHST,直接从牛乳清中分 离乳铁蛋白.考察了新型介质的扩张床膨胀特性 和流体混合性能,确定合适的操作流速,选定膨胀 率为2,可以满足高处理量和床层稳定性的要求. 取25mL角瓶,加入0.1g介质和20mL不同浓 度的乳铁蛋白或乳清溶液,水浴摇床(25?)振荡 8h,进行静态吸附实验.结果表明,Streamline DirectHST介质对乳铁蛋白的吸附容量较大,约 I10mg,g介质,具有一定的耐盐特性;改变离子强 度不能实现有效洗脱,改变pH值是洗脱的合适 途径;新鲜牛乳经室温离心除去脂肪,用lmmol/L He1调节pH值至4.6,静置后离心,除去乳酪蛋 白,得到酸乳清,调节pH值至4.7,电导率为5.5 mS/cm,进行了扩张床吸附分离,采用pH值阶跃 洗脱,从牛乳清中分离得到不同乳清分离蛋白组 分,20mmo1]LNaOH洗脱下得到乳铁蛋白,收率 为87.8%,纯化因子高达l0.5,分离过程体现了扩 张床吸附的集成化优势. 3.5高效低成本的模拟移动床色谱连续分离纯 化技术 上述几种提纯方法中都或多或少的存在着一 些不足,如分离效率低,提取纯度一般,处理量小, 成本高等缺点.模拟移动床色谱连续分离纯化技 术则能够进一步的提高分离纯化效率,降低生产 成本,提高分离速度,与传统的色谱分离技术相 比,其特点是采用连续分离操作,这一点为实现自 动化分离操作奠定了极好的基础,其制备效率高, 提纯效果较一般色谱分离高出40%,最主要的特 点是可降低设备投资,而且运行成本低,操作连续 化,处理量大,提高分离效率高,吸附剂利用率高, 加工效率高,便于自动控制,一般可使加工成本降 低50%,甚至80%以上[24,25】. 采用模拟移动床色谱分离纯化技术是基于普 通制备色谱的数据条件之上建立的技术参数.首 先将乳清液经过板框精滤后,再采用盐析,酶解方 法除去杂蛋白,选用SPSepharoseFastFlow强阳 离子交换剂,装柱,柱尺寸为1.0X100em,进行 单柱制备色谱的分离参数确定.根据此数据,再进 行模拟移动床色谱分离纯化技术参数的确定.以 pH为7.5,7.8,10mmol/L的磷酸盐溶液为起始 平衡缓冲液,截留浓缩液上样,洗脱速度2L/h,先 采用0.5mol/L的NaC1溶液洗脱其它组分,至洗 脱吸收值回复至基线水平,再采用1mol/L的Na— cl溶液洗脱乳铁蛋白组分,至洗脱吸收值再次回 复至基线水平作为洗脱结束,收集该乳铁蛋白组 分的洗脱液,经超滤脱盐,浓缩和冷冻干燥,得到 纯度为90%以上的乳铁蛋白精制品. 38农产食品科技2010 4讨论与分析 乳品工业的迅速发展,为食品工业提供了宝 贵的牛初乳资源和乳清资源,客观上为生产IJf提 供了大量,廉价的原料,加之U具有重要的生理 活性,开发应用前景广阔,吸引着越来越多的研究 者和实验室投入到IJf提取分离技术的研究上来, 并致力于I』的工业化生产.实验表明,U可通过 离子交换色谱法,超滤法,盐析法和凝胶层析法结 合等方法提取1. 对各种方法提取情况进行比较可知,其中离 子交换色谱法因其操作简便,分离效果好,成品纯 度高,活性损失小,是生产医药用I』f的有效方法 之一.但色谱法成本昂贵,柱的制备工艺复杂,分 离量小,难以工业化生产.超滤法因其不需加热, 不发生相变,不改变LJf的活性,操作简便,费用较 低,是适合生产食品用Lf最具实现工业化潜力的 方法之一,但膜的污染和纯度较低需要改进.随着 对乳铁蛋白提取分离方法的研究的深入,采用超 滤和离子交换色谱法结合的方法可以减少膜的污 染,提高Lf的分离效率和纯度,实现工业化生产[271. 也可对高效低成本的模拟移动床色谱连续分离纯 化技术进行研究,优化,r艺条件寻求更廉价,提取 效率更高,纯度更好,最适宜大规模工业化生产的 提取分离工艺. 总之,随着一些高新技术得到广泛的应用,兼 顾到工业化生产的大规模性和高效性,将离子交 换色谱法,盐析和凝胶层析法,凝胶过滤层析和离 子交换法层析结合,超滤和离子交换色谱法结合, 混合模式扩张床吸附法,高效低成本的模拟移动 床色谱连续分离纯化技术等多种方法加以完善, 能够降低Lf的制造成本,使之商品化. 参考文献: 【1]胡源媛,张守文.乳铁蛋白的功能特性及其国内外的应用情 中国乳品工业,2005,33(12):31—35. 况…. 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