人源抗HBs基因工程抗体在E. coli中的高效表达与折叠.doc

人源抗HBs基因工程抗体在E. coli中的高效表达与折叠.doc 人源抗HBs基因工程抗体在E. coli中的高效表达与折叠 作者:刘雪林，唐晓敏，宋宏彬，李申龙，徐德忠 【关键词】 HbsAg;Fab段;表达;复性 1材料和方法 11表达质粒的构建从含有人源性抗HBsAg抗体Fab段基因的噬菌体,1,中扩增出重链Fd片段，上游引物5′gcggaattcatatggtt(G)aaactgctg(C) gaa(G) cagtctg′cggaattcattaa(T)g(C)ag(A)gtc(T)ttgtcacag(A)gac(T)ttt(G)gg t(C)t(C)caactttc3′;从上述噬菌体中扩增出轻链基因，上游引物5′gcggaattcatatggaa(G)ctg(C) gtt(G) atgact(C)cagtctccagacacc3′和下游引物5′cggaattcattaacat(C)tca(T)cc t(C)ct gttgaa gctcttc3′.为便于亚克隆和满足表达的要求，在上游引物的 5′端引入NdeI酶切位点(下划线处，并含起始密码子ATG)，下游引物引入2个终止密码子(TAA TGA)和EcoRI酶切位点.将PCR产物分别克隆于pGEM-T载体(Promega公司)，再以NdeI和EcoRI酶切，与相应酶切的表达载体pET-20b(Novagen公司)连接，构建成表达质粒pETFd和pETL.上述质粒均经酶切鉴定，并经序列分析证明构建正确. 12Fd片段链和L链表达将表达质粒pETFd和pETL分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑单菌落接种于2 mL LB培养液(羧苄青霉素 100 mg/L)，37?振摇过夜.第2日分别取30(L菌液转种于2 mL LB培养液(羧苄青霉素100 mg/L)中，37?振荡培养3~4 h至A600 nm为06~10，加IPTG至终浓度04 mmol/L，继续培养3 h，以诱导外源程序蛋白的表达.诱导后的菌液6000 r/min离心10 min，上清加等量2×上样缓冲液，沉淀(菌体)加适量 1×上样缓冲液，沸水浴5 min，6000 g离心1 min.取上清SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后观察结果.SDSPAGE凝胶在双薄层扫描仪(Shimadzu,CS930)检测蛋白表达含量. 13包涵体蛋白的分离和复性取50 mL诱导表达的菌液6000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用5 mL 50 mmol/L TrisHCl pH 80，2 mmol/L EDTA悬浮，加溶菌酶至100 mg/L及05 mL 10 mL/L Triton X100，30?水浴15 min.置冰上，超声波粉碎细胞;4?，6000 g离心15 min.上清为可溶性蛋白，取50 μL加等量2×上样缓冲液;沉淀为不可溶蛋白，加100 μL 1×上样缓冲液，SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后观察结果.包涵体蛋白复性参照文献,2,报道的方法进行. 14免疫印迹取25 μL初步纯化浓缩的蛋白溶液与等量的2×上 样液混合(加β巯基乙醇), SDSPAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜(NCM)，30 g/L脱脂奶封闭，加兔抗人Fab段抗体，再与碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体反应， BCIPNBT显色. 15活性检测取25 μL初步纯化浓缩的蛋白溶液及其稀释液与等量的碳酸盐缓冲液混合，包被ELISA板孔(每样品包被4孔)，4?过夜，30 g/LBSA封闭，加入适当工作浓度的HRPHBsAg，以底物邻苯二胺显色，测A490nm值，并计算4个孔的平均值.2结果 21Fd段和L链蛋白的表达SDSPAGE检测可见，Fd段和L链表达质粒转达化BL21(DE3)后，均能够表达外源蛋白，其表观分子质量约25 ku(Fd)和27 ku(L)， 并且都是以包涵体形式表达，密度扫描检测Fd段和L链蛋白的表达量分别约为48%和53%.免疫印迹实验显示，两种蛋白均可与抗人Fab段抗体反应，证明为人源抗体. 22Fab蛋白复性Fd段和L链包涵体经GuHCl溶解后，等量混合加入复性缓冲液中于10?折叠36 h.SDSPAGE检测可见Fd段 和L链蛋白在50 ku处折叠形成一个新的蛋白，该蛋白带经β巯基乙醇处理则重新消失.薄层扫描显示50 ku的复性蛋白占总蛋白的28%. 23复性蛋白具有结合HBsAg的活性复性的蛋白溶液与酶标HBsAg反应后，A490nm平均为0712，说明表达蛋白复性后对HBsAg有一定抗原结合活性. 3讨论 我们将抗HBs抗体的轻链和Fd段基因分别置于pET20 b质粒中，转化大肠肝菌后，获得了高效表达，表达产量分别为48%和53%.Fd段和L链蛋白在折叠液中复性，形成的复性蛋白对HBsAg有一定结合活性.说明基因工程抗体大肠杆菌包涵体表达的技术路线是可行的.但是复性效率比较低，需要进一步研究改进复性条件、提高复性比例. 【