气相色谱法测定发酵液中丙酸和乙酸的含量

气相色谱法测定发酵液中丙酸和乙酸的含量 马 蕙 仪 宏 王丽丽 摘 要 丙酸菌发酵法生产丙酸时，发酵液中同时积累丙酸和乙酸，用气相色谱仪可将发酵液样品中丙酸、乙酸两组分良好分离，并快捷测定发酵液中丙酸和乙酸的含量。气相色谱操作条件为:色谱仪进样器和检测器温度均为200 ?;柱室温度150 ?;氮气(高纯氮)流速为2.96 ml/min;进样量2 μl，外标法定量。丙酸保留时间8.4 min，乙酸保留时间3.6 min。丙酸浓度在500,4 000 mg/100 ml范围内与峰面积呈线性相关，R=0.998 75;乙酸浓度在200,2 000 mg/100 ml范围内与峰面积呈线性相关，R=0.999 56;该方法是一种简便、快速、准确的测定发酵液中丙酸和乙酸的方法。 关键词 丙酸;乙酸;发酵液;气相色谱 中图分类号 S816.17 丙酸(propionic acid)是一种重要的精细化工和基本化工原料，广泛应用于食品、饲料、塑料、涂料、香料、医药、农药、印刷等领域。在丙酸消费中，饲料、谷物防腐剂所占比重最大，在60%以上。我国作为世界饲料生产大国，对丙酸的需求量很大，并且呈现逐年递增的态势。但我国目前年产量仅为1 000多吨，远不能满足市场需求，多年来一直依赖进口[1]。 丙酸生产主要有以石油为原料的化学合成法和微生物发酵法两种，其中微生物发酵法可以利用农副产品等可再生资源作原料，符合绿色环保的要求，是近年来新的研究方向。目前，很多学者对发酵法生产丙酸进行研究[2-4]，发现丙酸杆菌可以利用糖类等底物厌氧发酵而在发酵液中积累丙酸和乙酸;丙酸浓度通常可达到1 000,3 000 mg/100 ml，乙酸可达到500,1 500 mg/100 ml。针对丙酸发酵的工艺研究和工艺控制都需要精确检测发酵液中丙酸和乙酸的含量，检测丙酸的常用方法有滴定法[5]、pH值法和气相色谱法等;前两种方法只能用于丙酸含量的粗测。方荣等[6]用甲酸-二氯甲烷作为提取液提取丙酸，滤液用气相色谱仪，并以异丁酸作为内标物，采用二点内标法定量，检测面制品中丙酸含量。发酵液丙酸多用气相色谱法检测，仪宏等[7]用毛细管气相色谱法，以CHN萃取发酵液中丙酸，对发酵液中丙酸进行测定，由于发酵产物中同时含有丙酸和乙酸，而毛细管柱未能将丙酸、乙酸分离开并同时检测出，且样品前处理步骤复杂，因此准确度和精密度均较低。本文报道一种新的测定发酵液中丙酸和乙酸含量的气相色谱方法。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 谢氏丙酸杆菌(propionibacterium shermanii)由河北科技大学工业微生物实验室保藏。 1.1.2 发酵培养基 葡萄糖6%、玉米浆2.5%、磷酸二氢钾2%、CoCl2 10 mg/l。 1.1.3 仪器 国产GC7890F气相色谱仪，配备FID氢火焰检测器和N2010色谱工作站;国产Porapak QS填充色谱柱,规格:2 m×φ3 mm;CX-300A氮氢空气一体机;TGL-16C型台式离心机。 1.1.4 试剂 丙酸、乙酸均为分析纯;水为纯净水，符合GB/R6682三级用水的规定。 1.2 方法 1.2.1 丙酸发酵方法 采用250 ml三角瓶，装液量200 ml，厌氧静止发酵，接种量20%，培养温度30 ?，发酵过程用氨水定时滴定维持pH值6.5，发酵周期80 h。 1.2.2 发酵液样品溶液的制备 取适量待测发酵液，在9 000 r/min、室温条件下离心8 min，所得上清液即为发酵液样品溶液，可上气相色谱仪进行分析。 1.2.3 溶液的配制 精密量取丙酸500、1 000、2 000、3 000和4 000 mg,分别移入5个容量瓶中，用纯净水定容至100 ml，摇匀备用。 精密量取乙酸200、500、1 000、1 500和2 000 mg，分别移入5个容量瓶中，用纯净水定容至100 ml，摇匀备用。 1.2.4 色谱操作条件 色谱仪进样器和检测器温度均为200 ?;柱室温度150 ?;氮气(高纯氮)流速为2.96 ml/min;采用不分流方式进样，进样量2 μl，外标法定量。 2 结果与讨论 2.1 线性关系 将“1.2.3”所得的系列标准溶液均按照“1.2.2”的方法进行制备，得到10瓶系列标准溶液。将标准样品溶液上机检测,即可得到标准样品溶液的色谱图(见图1和图2)，由图1和图2可见，丙酸的保留时间tR=8.4 min，乙酸的保留时间tR=3.6 min。在N2010色谱工作站中，分别以丙酸和乙酸的进样纯量W(mg)对丙酸色谱峰面积A(μV*s)作标准曲线，得标准曲线及回归方程(见图3和图4)。由图3可见，丙酸浓度在500,4 000 mg/100 ml范围内时，丙酸进样纯量与色谱峰面积呈良好的线性关系，方程的相关系数R=0.998 75。由图4可见，乙酸浓度在200,2 000 mg/100ml范围内时，乙酸进样纯量与色谱峰面积呈良好的线性关系，方程的相关系数R=0.999 56。 ? 2.2 发酵液中丙、乙酸测定 按“1.2.1”方法培养丙酸杆菌，并按“1.2.2”方法制得发酵液样品溶液，然后在“1.2.4”条件下，将发酵液样品溶液上机检测，得到丙酸和乙酸的色谱图(见图5)，色谱工作站将样品所得色谱图的峰面积直接套用“2.1”中所得标准曲线和回归方程，给出发酵液样品中丙酸和乙酸测定浓度，丙酸为2 866 mg/100 ml,乙酸为1 392 mg/100 ml。 2.3 精密度试验 2.3.1 仪器精密度试验 精密吸取含2 000 mg/100 ml 丙酸的水溶液2 μl,重复进样4次，按“1.2.4”方法测定丙酸色谱峰面积(见1)。由表1可见，本试验采用的国产气相色谱仪和填充色谱柱具有较高的精密度。 ? 2.3.2 方法精密度试验 按“1.2.1”方法培养丙酸杆菌，并按“1.2.2”方法制得发酵液样品溶液，然后在“1.2.4”条件下测定所得发酵液样品溶液中丙酸和乙酸的色谱峰面积，共重复4次，结果见表2。 2.4 回收率试验 向发酵培养基中分别精密添加浓度为1 000、2 000、3 000 mg/100 ml的丙酸,浓度为500、1 000、1 500 mg/100 ml的乙酸，按“1.2.2”方法得到含有丙酸和乙酸的培养基液样品，在“1.2.4”条件下测定各自的丙酸和乙酸色谱峰面积，由工作站直接分别给出丙酸和乙酸含量测定值，各重复4次，结果见表3和表4。 3 小结 使用毛细管色谱柱无法分离发酵液中丙酸、乙酸两组分，且毛细管色谱柱不能进含水样品，必须由有机溶剂萃取丙酸再进行检测，样品前处理步骤复杂，费时费力，萃取本身也降低了丙酸的回收率，因此使得检测的准确度和精度大打折扣。本方法采用FID氢火焰检测器和国产填充色谱柱可将发酵液样品中丙酸、乙酸两组分良好分离并准确检测，填充色谱柱 可以进含水样品，使得发酵液的前处理不需萃取剂，只有离心取上清液一步，既简便又减少误差;发酵液中其它有机成 分对目标检测成分没有影响，通过精密度和回收率测试，结果表明此方法具有良好的精密度和准确度，是一种简便、快 速、准确的测定发酵液中丙酸和乙酸的方法。 参考文献 [1] 周纯海.丙酸的合成进展和应用以及市场前景[J].化工技术与开发, 2006，35(7):11-13. [2] 徐虹.发酵法生产丙酸[J]. 食品与发酵工业, 1997，23(6):62-65. [3] 张华峰.微生物发酵法生产丙酸[J]. 饲料工业, 2004, 25(8):22-24. [4] 熊海燕.微生物发酵法生产丙酸的研究进展[J]. 江苏调味副食品, 2005,22(5):10-15. [5] 张小华. 离子交换法测定饲料级丙酸钠含量[J]. 饲料工业, 2002,23(7):15-16. [6] 方荣.面制品中丙酸及其盐类的测定[J]. 中国公共卫生, 1989, 5(6):17-18. [7] 仪宏.毛细管气相色谱法测定发酵液中丙酸的含量[J]. 饲料工业,2003,24(6):37-39. (编辑:张学智，mengzai007@163.com) 马蕙，河北科技大学生物科学与学院，050018，河北省石家庄市裕华东路70号。 仪宏(通讯作者)、王丽丽，单位及通讯地址同第一作者。 收稿日期:2008-01-28