王亚娟, 葛薇, 冯嵩(郑州大学第一附属医院郑州450000)

王亚娟, 葛薇, 冯嵩(郑州大学第一附属医院郑州450000) 瘦素在充血性心力衰竭幼鼠血清中的变化 及药物的影响 王亚娟，葛薇，冯嵩 (郑州大学第一附属医院 郑州 450000) 摘要:目的 探讨瘦素在慢性充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)发展进程中的变化及诊断价值。方法 选取4周龄大鼠40只，按性别、体重、窝别配成20对，并分成2组，每组10对，每对中随进抽取一只腹腔注射野百合碱制造心衰模型作为心衰组，另一只作为对照组腹腔注射等量生理盐水，分别于6周龄末、8周龄末颈总静脉取血2ml，室温下静置约2小时后于1000×g离心20分钟后取血清并于-80?下保存;选取4周龄大鼠50只，雌雄不限，体重80g-100g，随机分成5组，每组10只，随机抽取4组腹腔注射野百合碱制造心衰模型，再随机抽取3组分别于8周龄末开始灌胃给予卡托普利、坎地沙坦、卡托普利+坎地沙坦，剩下1组作为心衰组对照组，而5组中剩余那组则腹腔给予生理盐水作为正常对照组，并于10周龄末5组一同取血，方法同前。用瘦素ELESA试剂盒测血清中的瘦素并进行统计。 结果 在两配对组中，瘦素水平心衰组明显比对照组高(P<0.05)，而在心衰组中瘦素水平6周龄<8周龄(P<0.05)，在对照组中6周龄<8周龄(P<0.05);在余下的5组中，在10周龄末时测得的瘦素水平，卡托普利组与两药联合组、正常对照组两两比较无明显差别(均有P>0.05)，心衰对照组则均小于其他各组(均有P<0.05)，坎地沙坦组则高于心衰对照组(P<0.05)但低于卡托普利组、两药联合组、正常对照组(均有P<0.05)。 结论 在野百合碱所致幼鼠慢性充血性心力衰竭过程中，瘦素水平逐渐升高，参与了整个过程的发展，在经过抗心衰药物的干预下，而瘦素有所下降。总之，瘦素参与了慢性心力衰竭的发生发展，与慢性心力衰竭密切相关，可以作为CHF一种新的生物标记物。 关键词:瘦素;慢性心力衰竭;野百合碱;大鼠 中图分类号:R Changes of Leptin in setum of congestive heart failure of young rats and the affect of the drug Wang Yajuan, Ge Wei, Feng Song (The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000 , China) Abstract Objection Explore the change of leptin in the serum of young rats during the process of congestive heart failure (CHF) and tis diagnosevalue. Methods Selected 40 of 4 weeks old rats, female only, and paired them to 20 pair according their sex, weight and nests. The 20 pair young rats divided into 2 gtoups,10 pairs in a group. Slected one young rat from every pair to intraperitoneally injected monocrotaline as heart failure group(H group) ,and the other young rat would intraperitoneally inject normal saline(NS) as normal control group(N group) .At the nd of 6 weeks old ,one group(H1 group,N1 group) would be chosen to put to death e and draw blood about 2ml from every young rat .Next, the blood was placed at the room temperature for 2 hours .Ater that, it would be centrifugaled at 1000×g for 20 minites and kept the serum at the temperature of -80?.At the end of 8 weeks old ,the group left(H2 group,N2 group) would be done at the same way like the upper.50 of 4 weeks old young rats were selected ,sex unlimited, weight 80g-100g, and divided into 5 groups randomly,10 per grpup.4 groups were chosen randomly to intraperitoneally injected the monocrotaline to made them congestive heart failure. The group left would be intraperitoneally injected NS as normal control group(N3 group).3 groups were be selected from the 4 groups and given oral medicine such as captopril(K1 group),candesartan(K2 group) and captopril+candesartan(K3 group) respectively.The left group would be given NS as heart failure control group (H3 group).At the end of 10 weeks old ,all of the young rats would be done like the same way of upper .Leptin of the serum collected would be detected by Leptin ELESA kit. Results In two matching group, leptin level in heart failure group significantly higher than the normal control group (P < 0.05), and in heart failure groups 6 weeks old group< 8 weeks old group (P < 0.05), in the controls 6 weeks old < 8 weeks old (P < 0.05). In the left 5 groups, the leptin level of 10 weeks old young rats, group K1 compared with the group K and the group N3,there were no difference (P>0.05)between each other ,but compared with group K2 and group H3,there were significantly difference (P<0.05), and group K1 was higher than the two group. Group H3 was much higher than the other group(P<0.05).Group K2 was higher than group K1,group K,group N3,but lower than group H3. Conclusions In the process of the congestive heart failure manufacture, leptin level raised during the whole process of development gradually , after the intervention of anti- heart failure drug it declined. Anyway, leptin throughout chronic heart failure , closely related, and could be used as a new kind of CHF biomarkers. Key words: leptin; chronic heart failure; monocrotalinr; rats 作者简介:王亚娟，女，硕士生，研究方向儿科心血管，电子信箱 WYjuan1984@126.com 通讯作者:安金斗，男，主任医师，硕士学位，研究方向儿科心血管，电子 信箱FYBS2145@163.com 小儿充血性心力衰竭(congestive heart failure ,CHF,简称心衰)，是各种心脏 疾病导致心功能不全的一种综合征，是儿科临床常见的一种死亡率较高的危重病症。若是在病程发展的早期通过具有一定提示作用的生物标记物来及早提示CHF，就可通过相应的干预手段来避免悲剧的发生。目前通常研究的心衰生物标记有ANP、BNP、精氨酸加压素等，除此之外的生物标记还有骨保护素，乳糖凝集素-3，血清胱抑素，嗜铬粒蛋白A，瘦素和抵抗素等，对它们的研究都能更好的理解心力衰竭的病理生理机制，从而使这些早期标志物更好的融入诊断和治疗心力衰竭的病人。瘦素(Leptin)作为肥胖基因编码的蛋白质产物，而瘦素受 体广泛分布于下丘脑、垂体、心脏、脂肪组织、胰岛、肾脏、造血细胞等。瘦素与受体结合后发挥广泛的作用，除了它在新陈代谢方面的作用外，瘦素在心血管方面还有独特的作用从而导致产生更多的免疫炎性因子及氧化应激、血管重构及心肌细胞肥大等，鉴于瘦素在心血管方面的作用，或许瘦素可以作为CHF一种新的诊断工具。 1、材料与方法 1.1 一般材料 选取4周龄Sprague Dawley(SD)幼鼠只，体重80-100克，均为雌性，健康，购于河南省动物中心。 1.2实验试剂与方法 试剂:野百合碱购于国家物质标准样品中心，编号BW5002。大鼠瘦素及瘦素受体ELISA试剂盒购于上海经科化学公司。方法:将40只4周龄SD幼鼠按性别、窝别、体重配成20对，再随机分成2组，每组 〔1〕10对，随机抽取每对中的1只作为心衰组，按Luciano 等的方法，将野百合碱(MCT)粉剂加入生理盐水和乙醇混合液(乙醇:生理盐水=2:8)配成1,浓度溶液，以30mg/kg腹腔注射诱发肺动脉高压，另外一只腹腔注射生理盐水作为对照组，分别于6周龄末(心衰组为H1组，对照组为N1组)、8周龄末(心衰组为H2组，对照组为N2组)颈总静脉取血2ml，在室温下放置2小时后1000×g20分钟，取血清置于-80?下保存;选取50只4周龄SD幼鼠，体重80g-100g，均为雌性，按体重均衡原则随机分成5组，随机选取其中4组，腹腔注射MCT制造心衰模型，方法同前，余下一组腹腔注射生理盐水作为正常对照组(N3组)，在8周龄末，随机选取心衰组中的3组分别给予灌胃卡托普利、坎地沙坦及两药联用，即卡托普利组(K1组)和坎地沙坦组(K2组)，两药联合组(K组)，剩下一组则作为心 衰对照组(H3组)。5组在10周龄末一同取血，方法同前。标本收集完毕后分别用大鼠瘦素ELESA试剂盒检测，用酶标仪检测结果。 1.3统计学处理 应用统计学软件SPSS17.0，数据以(?s)示，两配x 对组采用配对t检验，P,0.05有统计学意义,见表1，余下组别采用多个样本均数的两两比较,P<0.05有统计学意义，见表2。 表1 MCT致幼鼠心衰模型组和对照组血清瘦素的比较 (?s) x 分组 n 瘦素(ng/ml) t p N1 10 11.02?1.16 H1 10 17.92?0.89 -16.87 <0.001 N2 10 17.17?2.75 H2 10 26.72?3.56 -7.33 <0.001 表2 MCT致心衰模型用药组、未用药组及对照组血清瘦素的变化 (x?s) 组别 n 瘦素(ng/ml) F K1 10 24.14?1.36 K2 10 153.75 K 10 28.81?1.82* H3 10 27.01?3.67* N3 10 55.01?3.67* 25.54?4.87* *K1组与K2组、H3组比较有明显的差异，均有P<0.05，而与K组、N3组比较无差异，即P>0.05:;K2组与K组、H3组比较有明显差异，均有P<0.05,而与N3组比较无差异，即P>0.05;H3组与N3组比较有明显差异，P<0.05。. 2 结果 随着慢性心力衰竭的发展，H1组与N1组，H2组与N2组均有差异，P<0.05，且有H1组>N2组，H2组>N2组，即大鼠血清瘦素水平逐渐升高，见表1。经过卡托普利、坎地沙坦、两药联合干涉后，K1组、K组、N3组之间没有明显差别，即P>0.05，而H3组、K2组与各组之间均有差别，即P<0.05，抗心衰治疗后瘦素水平明显下降见表2。 3、讨论 在本实验中，瘦素在CHF发生早期逐渐升高，而通过抗心衰药物的干涉后，瘦素又有明显的降低，这表明瘦素参与CHF发生发展的整个时期，可以作为CHF早期诊疗依据的一种新的生物标记物。 瘦素是肥胖基因的表达产物，由167个氨基酸组成，其氨基端为由21个氨基酸组成的信号肽，在分泌到血液的过程中，切除信号肽形成瘦素。成熟后的瘦素为146个氨基酸残基，分子量约16KD，具有强亲水性。分子内含两个半胱氨酸，形成二硫键，对保持其结构稳定性和生物活性作用关键。瘦素的结构具有高度保守型，人类瘦素氨基酸序列和鼠有84%的同源性〔1〕。瘦素需要与特异的受体结合才能发挥其生物学作用。瘦素受体(Ob-R)属于?型细胞因子受体，目前 〔2〕已发现至少有5中亚型，即Ob-Ra，Ob-Rb，Ob-Rc，Ob-Rd和Ob-Re。受体基因位于1p3.1，长度超过70kb，由20个外显子和19个内显子组成，包含3个作用位点:细胞外位点，由840个氨基酸组成;跨膜位点，含34个氨基酸;多变的细胞内位点。其广泛分布于下丘脑、垂体、心脏、脂肪组织、胰岛、肾脏、造 〔43-5〕血细胞等。但目前对瘦素的研究已超越肥胖的范畴，研究表明，CHF患者血浆Leptin水平明显高于正常人。瘦素与心血管疾病关系密切，而可能参与了充血性心力衰竭分解代谢等病理生理过程。 充血性心力衰竭(congestive heart failure CHF)是临床上常见的心血管病综合症，也是各种心脏病的最终发展阶段和主要死亡原因。现代观点认为，神经内分泌因子激活在CHF的病理生理中发挥着重要作用;瘦素(Leptin)作为调节体重和代谢的肽类激素，与神经内分泌细胞因子之间存在着密切关系;新近研究发现CHF患者血浆Leptin水平升高，高Leptin血症可能是CHF患者分解代谢增强，神经内分泌紊乱的原因之一。 CHF时许多神经内分泌系统，如交感神经系统，肾上腺能系统，下丘脑-垂体系统，细胞因子系统以及肽类信号系统都是激活的。这些系统持续激活对心衰患者将产生有害作用，加重心衰恶化。Leptin系统与神经内分泌系统之间形成了一个双向闭合环路;一方面，Leptin参与下丘脑、垂体、肾上腺等多种神经内分泌系统的活动;另一方面，又受到这些神经内分泌器官的负反馈调节。 一方面，瘦素对心脏方面的在作用有:?诱导氧化应激;?激活肾素-血管 〔6〕〔7〕紧张素系统增加交感神经系统兴奋性，促使周围血管收缩，心率加快，心 〔8〕脏工作负荷增大，耗氧量增多，心肌就易缺血缺氧;?调节炎症反应。研究表明高水平瘦素可以促进TNF-α、白细胞介素-6、白细胞介素-12及C反应蛋白的分泌，引起慢性炎症等等。 同时，瘦素能够浓度依赖性地刺激心肌细胞产生内皮素-1(ET-1)和活性氧;选择性ETA拮抗剂ABT-627和过氧化氢酶能够抑制瘦素和ET-1诱导的心肌细胞活性氧的生成;瘦素能够通过活化ET-1-ETA-活性氧通路而诱导心肌细胞肥 〔8〕大。一些研究表明，瘦素对于心脏具有抗心肌凋亡、减弱心肌收缩力的作用。这些结果均表明瘦素对心血管系统有直接和间接的作用。 另一方面，在心肌及孤立的心肌细胞上已证实存在瘦素受体的几个异型(包 〔〕11括长、短)。事实上,瘦素刺激并导致心肌细胞肥大，通过各种各样包括JAK 〔10〕,〔12〕,〔13〕、〔〕14/STAT,p38 MAPK,联合激酶/蛋白激酶b等途径进行信号传导。此 〔14〕外,瘦素还增加心脏氧消耗量及减少心脏效率。瘦素的负面性效应和细胞内钙 〔〕13释放一氧化氮有关，并依赖于其生物利用度。然而这些效果会被 有JAK /STAT 〔〕16和p38MAPK参与的JAK途径抑制并削弱。 本实验研究了在慢性心力衰竭发展过程中瘦素的变化及与慢性心力衰竭的关系，以及药物的干预作用。在慢性心力衰竭发展过程中瘦素水平逐渐升高，出现高瘦素血症，这与在成人在此方面的变化基本一致，然而在使用抗心力衰竭药物干预后，瘦素水平则有所下降，则进一步证明，瘦素与CHF密切相关，并具有作为CHF的生物标记物的潜力;在给予抗CHF药物后，ACE抑制剂作为治疗CHF的经典用药再一次被证实，在使用ACE抑制剂后大鼠血清瘦素水平下降，则反证了瘦素对于神经内分泌方面的作用，而在使用ARB受体阻滞剂后，大鼠血清瘦素降低不如ACE抑制剂明显，两药联合并没有单独使用ACE抑制剂效果好。在CHF过程中瘦素作为慢性心力衰竭一种新的生物标记是有一定局限性的,因其主要依赖体重指数和脂肪量,特别是腹部的脂肪，要应用于临床还需要大量的研究。 参考文献: 〔1〕 Zhang Y,Proneca R,Maffei M,er al,Positional cloning of the mouse obese gene and its human hmologue〔J〕.Nature,1994,372:425-432. 〔2〕 J Ren,er al.Leptin and hyperleptinemia-from friend to foe for cardiovascular funtion〔J〕.J.Endocrinology,2004,181:1-10 〔3〕 Leyva F,Anker SD,Egere K,et al.Hyperleptinsemia in chronic heart failure.Relationship with lisulin〔J〕.Eur Heart J,1998,19:1547-1551. 〔4〕 Doehner W,Rauchhaus M,Godsland IF,et al.Insulin resistance in moderate chronic heart failure is related to hyperleptinaemia,but not to norepinephrine or TNF-alpha〔J〕.Int J Cardiol,2002,83(1):73-81. 〔5〕 Filippatos GS,Tailias K,Venetsanou K,et al.Leptin concentrations in relation to tumor necrosis factor-α system in cachetic heart failure patients〔J〕,Chest,1999,116(suppl 2):3255-3260. 〔6〕 Al-Hazimi AM,Syiamic AY.Relationship between plasma angiotensinll, leptin and arterial blood pressure〔J〕.Saudi Med J,2004,25(9):1193-1198. 〔7〕 Iwashita S,Tanida M,Terui N,et al.Diret measurement of renal sympathetic nervous activity in high-fat diet-related hypertensive rats〔J〕.Life Sci,2002,71(5):537-546. 〔8〕 Lofferda S,Yang SQ,Lin HZ,et al.Leptin regulates proinflammatory immune responses〔J〕.Faseb J,1998,12(1):57-65. 〔9〕 胡玉珍，赵玉峰，瘦素对心脏的作用，,J,心脏杂志，2009，21(5):753-754 〔10〕V. Rajapurohitam, X.T. Gan, L.A. Kirshenbaum and M. Karmazyn, The obesity-associated peptide leptin induces hypertrophy in neonatal rat ventricular myocytes, Circ Res 93 (2003), pp. 277–279. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (90) 〔11〕D.M. Purdham, M.X. Zou, V. Rajapurohitam and M. Karmazyn, Rat heart is a site of leptin production and action, Am J Physiol Heart Circ Physiol 287 (2004), pp. H2877–H2884. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (64) 〔12〕K.K. Hintz, N.S. Aberle and J. Ren, Insulin resistance induces hyperleptinemia, cardiac contractile dysfunction but not cardiac leptin resistance in ventricular myocytes, Int J Obes Relat Metab Disord 27 (2003), pp. 1196–1203. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (26) 〔13〕M.W. Nickola, L.E. Wold, P.B. Colligan, G.J. Wang, W.K. Samson and J. Ren, Leptin attenuates cardiac contraction in rat ventricular myocytes. Role of NO, Hypertension 36 (2000), pp. 501–505. View Record in Scopus | Cited By in Scopus (97) 〔14〕F.P. Xu, M.S. Chen and Y.Z. Wang et al., Leptin induces hypertrophy via endothelin-1-reactive oxygen species pathway in cultured neonatal rat cardiomyocytes, Circulation 110 (2004), pp. 1269–1275. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (106) 〔15〕L.L. Atkinson, M.A. Fischer and G.D. Lopaschuk, Leptin activates cardiac fatty acid oxidation independent of changes in the AMP-activated protein kinase-acetyl-CoA carboxylase-malonyl-CoA axis, J Biol Chem 277 (2002), pp. 29424–29430. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (82) 〔16〕P. Christian Schulzea, and Jürgen Kratzschba ，Leptin as a new diagnostic tool in chronic heart failure ,Clinica Chimica Acta ,2005,362:1-11