抗游离前列腺特异性抗原（f-PSA）单克隆抗体的研制与应用

抗游离前列腺特异性抗原（f-PSA）单克隆抗体的研制与应用 抗游离前列腺特异性抗原(f-PSA)单克隆 抗体的研制与应用 旦塞塑笠夔塞煎腺特异性抗原(f-eSa)单克隆抗体的 抗游离前列腺特异性抗原(f-PSA)单克隆抗体的研制与应用? 田素娟郑蓬举徐海燕杨豪刘吴曼杨艳艳张燕张玉梅 (郑州博赛生物技术研究所,郑州450001) 中国图书分类号92.33文献标识码A文章编号100l84x(2004)02.0l27.02 前列腺特异性抗原(ProstateSpecificAntigen, PSA)是目前公认的最有价值的前列腺癌肿瘤标志 物….PSA在血清中存在不同的分子形式:游离前 列腺特异性抗原(f-PSA),前列腺特异性抗原与a1 抗糜蛋白酶结合的结合型PSA(PSA.ACT),前列腺特 异性抗原和Q2.巨球蛋白形成的复合物(PSA.A2M) 等.但免疫学方法检测不出PSA.A2M,因此,免疫分 析检测血清中总的PSA(t-PSA)为f-PSA与PSA.ACT 的总和.前列腺特异性抗原(t-PSA)在前列腺癌病 人血清中明显升高,在部分良性前列腺疾患病人血 清中也有轻微升高,特别是在低水平升高的重叠范 围内(4,10wdL),两者难以区分,而测定f-PSA并 计算f-PSA/t.PSA的比值,极大地提高了两者的鉴别 率_2J.因此,对于前列腺疾患病人需同时检测t. PSA,f-PSA.我们从人精浆中纯化PSA,研制出针对 f-PSA的单克隆抗体杂交瘤细胞株,并初步用于f- PSAELISA试剂盒的研制. 1材料与方法 1.1动物BALB/C小鼠6,8周龄,购自中国医学 科学院实验动物中心. 1.2材料PSA.ACT由美国斯坦福大学的陈祖雄 教授惠赠. 1.3主要试剂RPMI1640培养基(美国G1BCO. BRL公司产品),弗氏佐剂,HAT,HT,HRP,50%PEG, 小鼠Ig亚类试剂盒(美国Sigma公司产品),超级小 牛血清(杭州四季青),其他试剂均为国产纯. 1.4单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立从人精浆 中纯化PSA抗原b],常规法免疫,细胞融合制备单克 隆抗体杂交瘤细胞株. 1.5MeAb的鉴定 1.5.1小鼠k亚类按试剂盒说明书操作. 1.5.2特异性鉴定?对f-PSA的特异性:杂交瘤 ?本研究为科技部资助的2002年"十五"国家科技攻关计划引导项 目(项目编号2002BA545C) 作者简介:田素娟(1966年一).女.副研究员,主要从事免疫学,细胞 工程研究. 细胞培养上清分别与包被的f-PSA,PSA.ACT进行间 接ELISA分析.?间接ELISA法:杂交瘤上清分别 与包被的AFP,CEA,CA125,CA153,CA199蛋白反 应,进行间接ELISA分析.?免疫组织化学染色:用 稀释的MeAb腹水(1:200)为一抗,DaKoInVision标 记抗鼠I为二抗对前列腺癌,前列腺增生组织,结 肠癌,膀胱癌,胃癌,乳腺癌,鳞癌以及睾丸,纤维组 织,外周神经,结肠,淋巴组织等进行免疫组织化学 染色. 1.5.3抗体识别抗原位点分析采用间接ELISA 法相加试验HJ. 1.5.4抗体亲和常数测定采用文献[5]的方法. 1.5.5抗体稳定性试验杂交瘤细胞体外连续培 养3个月,液氮冻存1年,分别制备腹水,间接ELISA 法测定其腹水效价. 1.5.6夹心法ELISA检测f-PSA选择亲和力高识 别不同抗原位点的两株MeAb2D,2E,作为包被,酶 标抗体,以方阵滴定法确定包被,酶标抗体的最佳稀 释度,以纯化的PSA为品0.5,20wdL,正常人 血清为阴性对照,确定反应的最佳条件,建立检测f- PSA的ELISA方法. 2结果 2.1抗f-PSA杂交瘤细胞株的建立3次融合共获 得18株抗PSA的McAb杂交瘤细胞株,其中3株 2D,2E,,6F8为抗f-PSA的杂交瘤细胞株,均为小鼠 IgG1()亚类. 2.2McAb的特异性?经间接ELISA法测定, 2D,2E4,6F83株McAb只与f-PSA反应,不与PSA. ACT反应,说明是抗f-PSA的McAb.?经间接 ELISA法测定,2D】,2E,,6F83株McAb与AFP,CEA, CA125,CA153,CA199蛋白均无交叉反应.?经免疫 组织化学染色,2D,2E4两株McAb只与前列腺癌, 前列腺增生组织反应,与结肠癌,膀胱癌,胃癌,乳腺 癌,鳞癌以及睾丸,纤维组织,外周神经,结肠,淋巴 组织等均不反应,特异性强(见图1,2). 2.3McAb识别的抗原位点经间接ELISA相加试 图1 FLg.1 McAb2E4对前列腺癌的免疫组化染色(X400) stainingofprostatecancertissues withMcAb2E4(X400) 图2McAb2E4对结肠癌的免疫组化染色(X200) Fig.2Immunohistochemicalstainingofcoloncai~olnatis- sueswithMcAb2E4(X200) 验,2D,2E4,6F83株McAbs间的相加指数AI大于 50%,明它们识别f-PSA不同的抗原位点. 2.4McAb的亲和常数经试验作图计算,2D.,2E4 的亲和常数分别为2.05XlO9(M),5XlO9(M). 2.5McAb的稳定性2D,2E4两株McAbs经体外 连续培养3个月,液氮冻存1年,其腹水效价基本一 致,表明稳定性良好. 2.6夹心ELISA法测定f-PSA用2D包被酶标 板,2E4标记辣根过氧化物酶建立夹心ELISA法检 测f-PSA,检测范围0.5—20t,~JL,灵敏度为0.25 L.与PSA—ACT的交叉反应0.7%. 3讨论 前列腺疾病是男性中老年常见病,前列腺癌是 西方发达国家发病率最高的恶性肿瘤之一,死亡率 中国免疫学杂志2O04年第2o卷 仅次于肺癌,结肠癌.我国前列腺癌发病率呈逐年 上升趋势.因前列腺增生与前列腺癌症状相似,但 治疗方法,预后不同.因此,急需早期诊断前列腺癌 能区分前列腺增生与前列腺癌的诊断试剂.同时需 检测t-PSA,f-PSA两种试剂,国内只见广义的抗PSA 单抗及ELISA法检测的报道J.我们研制抗f-PSA 的单克隆抗体并初步用于检测f-PSA的ELISA试剂 盒,国内尚未见报道. f-PSA是由前列腺上皮细胞分泌的一种糖蛋白, 具有很强的组织特异性.我们用从人精浆中纯化 PSA免疫小鼠,经细胞融合获得3株抗f-PSA的 McAb,与PSA—ACT不反应,说明针对PSA上ACT结 合的位点.2D,2E4针对不同的抗原位点,亲和力 高,特异强,配对建立夹心ELISA法检测f-PSA,灵敏 度为0.25L,在f-PSA0.5,20L范围内,线性 良好,与PSA—ACT的交叉率O.7%.据报道筛选好 的抗f-PSA的单抗比例低J,一些检测f-PSA的免疫 学方法由抗f-PSA与抗f-PSA,PSA—ACT的McAbs组 成.本研究为进一步研制试剂盒检测病人血清中的 f-PSA奠定了基础,为研究PSA的结构,抗原位点提 供了基础材料.我们将进一步研制抗PSA—ACT的 MeAb杂交瘤细胞株,进而提高前列腺癌的诊断率. 4参考文献 1OsetrlingJE.Prostatespecificantigen:acritic~assessrn~tofthemost usdulrnlLrkerforadenocarcinomaoftheprostate【JJ.JUrol,1991;145: 907一. 2LudererA,ChertY,SorianoTeta1.Measurementofthepropordonof freeprostatespecificantigentototalprostatespecificantigen(PSA)im? provediagnosticperformanceofprostate-specificantigeninthediagnostic grayzorleoftotalPSA,mtigen[J].Urology,1995;46:187—189. 3田素娟,白仲虎,杨书豪eta1.前列腺特异性抗原的纯化及其单 克隆抗体的研制,鉴定[J].中国免疫学杂志,1997;13(专):36—37. 4FriguetB,Djavadi0L,PagesJeta1.Aconvenientenzyme-linkedim— muno6orb~tfortestingwhethermonoclonalantibodiesIezethe antigenicsite.Applicationtohybndowasspecificforthe2-sublmitofEs— cherichiacolitryptoplumsynthase[J].JlmmunolMethods,1983;60: 351一. 5C~pbellAM.Monoclonalantibodyandimrrlmosensortechnology[M]. E1se~'ierSciencePublisersBV,1991:33. 6徐元基,凌世淦,刘荷中eta1.前列腺特异性抗原EIA试剂盒的 研制及应用[J].细胞与分子免疫学杂志,2000;16(4):360-362. 7BlackMH,GrassCL,LeinonenJeta1.Characterizallonofmonoclonal antibodiesforprostate-specificantigenanddevelopmentofhiOaysensitive freeprostate-specificantigenassay[J].ClinChem,1999~45(3):347一. [收稿2003一O2.30修回2003-05—26] (编辑徐杰)