DCC 和 netrin 在斑马鱼胚胎发育过程中的

DCC 和 netrin 在斑马鱼胚胎发育过程中的 精品论文 DCC 和 netrin 在斑马鱼胚胎发育过程中的 达分析 高景霞，张长稳，张翠珍，彭刚 5 (复旦大学脑科学研究院，上海 200032) 摘要:本文用全胚胎原 位杂交的研究了 DCC 和 netrin 这对轴突导向因子受体及其配体 在斑马鱼胚胎发育过程 中的表达情况。结果显示:DCC 在斑马鱼前脑背侧神经元有丰富而 集中的表达，而 netrin 在前脑腹侧中线有很强的表达。提示斑马鱼高表达 DCC 前脑背侧神 经元受到前脑腹侧中 线 netrin 的作用实现向腹侧的轴突投射。 10 关键词:DCC;netrin;斑马鱼 中图分类号:Q189 The expression pattern of DCC and netrin in the embryonic zebrafish 15 Gao Jingxia, Zhang Changwen, Zhang Cuizhen, Peng Gang (Institute of Brain Sciences, Fudan University, ShangHai 200032) Abstract: The current research focuses on the expression pattern of DCC and netrin in the embryonic Zebrafish using whole mount in situ hybridization. DCC and netrin are one of the guidance receptors and ligands. The results showed that DCC are highly expressed in the anterior 20 dorsal neurons in embryonic Zebrafish, and netrins are highly expressed in the ventral midline. These results suggest that the axons of the anterior dorsal neurons which express DCC project ventrally guided by the ventral expressed netrins. Keywords: DCC; netrin; Zebrafish 25 0 引言 在脊椎动物胚胎发育研究中，神经系统的发育尤其是脑部的形成是最为研究者所关注的 领域之一。斑马鱼因其具有生长繁殖快、体外受精、胚胎透明和个体小易养殖等诸多特点， [1]逐渐为越来越多的研究者所采用，已成为脊椎动物发育生物学研究的理想模型动物之一。 在斑马鱼前脑，胚胎早期发育生成的神经元的轴突形成高度固定及保守的神经束并向不同的 [2]30 脑区投射。这些神经束是脑中复杂的神经回路形成的基础。这些神经元的轴突投射受到周 围环境中的化学信号分子以及神经元所表达的受体的吸引或者排斥作用，从而形成正常的轴 [3]突投射。这些化学信号分子表达异常或者受体表达异常都会导致错误的轴突投射，从而导 致神经系统功能障碍。DCC (deleted in colorectal carcinoma)和 netrin 便是众多的轴突导向因 子受体和配体的其中一对。为了研究斑马鱼前脑神经元的正常投射，我们研究了斑马鱼野生 35 型胚胎中在不同发育时期 DCC 和 Netrin 的表达。 1 材料和方法 1.1 材料 [4]实验中所用到的野生型斑马鱼为 AB 品系。按照斑马鱼饲养的标准步骤。在循环水系 统中饲养。循环水用人工海水盐调整盐度至 500uF，用 NaHCO3 调整 pH 值至 7.2。将成年 基金项目:国家自然科学基金(30900861)， 教育部博士点基金(20090071120098) 作者简介:高景霞，(1974-)，女，助理研究员， 神经系统发育。E-mail: gaojingxia@fudan.edu.cn - 1 - 精品论文 40 斑马鱼交配获得胚胎，在胚胎培养液中，28.5?培养到所需发育时期。斑马鱼胚胎的发育时[5]期用受精后的小时数来界定。 1.2 方法 1.2.1 DCC、 netrin1a 和 netrin1b 探针的制备 [6]实验中用到的探针克隆是: dcc, netrin1a(accession number: BC114259)，netrin1b 45 (accession number: CK684895)。探针克隆经测序正确后体外合成带有地高辛标记的反义 RNA。用 liCl 沉淀法对获得的反义 RNA 探针进行纯化。 1.2.2 全胚胎原位杂交 在所需的发育时期收集斑马鱼胚胎，用新鲜配制的 4%多聚甲醛固定胚胎，室温固定 2 小时，4?固定过夜。用蛋白酶 K 消化胚胎后，在未加探针的杂交液中预杂交 2 小时，再加 50 入反义 RNA 探针，65?杂交过夜。第二天，用 65? SSC 洗涤胚胎，将胚胎洗至 PBST。 用封闭液封闭，碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体孵育过夜，PBST 洗涤后，用 NBT/BCIP 显 色。杂交结束的胚胎保存于 50%甘油/PBST 中待拍照。 2 结果和分析 2.1 DCC 在斑马鱼胚胎发育过程中的表达 55 斑马鱼胚胎时期的神经元经过生成、迁移到正确的位置以及长出轴突并形成正确的轴突 投射等过程。斑马鱼前脑背侧的神经元在胚胎发育至 20 小时时，迁移至正确的位置，但尚 未形成轴突投射。因此我们关注此后的发育阶段，即神经元形成轴突投射的阶段。胚胎发育 至 24 小时时，从侧面观察 DCC 的在前脑背侧有很丰富而集中的表达(图 1A)，说明 DCC 对于该时期该部位的神经元的轴突投射的正常形成有重要作用。此外，DCC 在下丘脑等其 60 他脑区也有表达。从斑马鱼胚胎前侧观察，也看到在斑马鱼前脑背侧的丰富而集中的表达(图 1B)。自此以后，DCC 的表达逐渐降低。胚胎发育到 36 小时时 DCC 的表达局限到更靠近 中线的部位，此时 DCC 在中脑的表达较强(图 2A 和 B)。自此以后 DCC 的表达在前脑背 侧这组神经元的表达继续降低，到胚胎发育至 48 小时时，DCC 在该部位的表达已经检测不 到(未显示)。 - 2 - 精品论文 65 图 1. DCC 在斑马鱼胚胎 24 小时和 36 小时的表达. A. DCC 在斑马鱼胚胎 24hpf 的表达 (侧面图)。B. DCC 在斑马鱼胚胎 24hpf 的表达 (正面图)。C. DCC 在斑马鱼胚胎 36hpf 的表达 (侧面图)。D. DCC 在斑马 鱼胚胎 36hpf 的表达(正面图)。标尺:侧面图，100μm;正面图，60μm。 Fig. 1 The expression pattern of DCC in embryonic Zebrafish in 24 and 36 hpf. A. The expression pattern of DCC 70 at 24hpf (lateral). B. The expression pattern of DCC at 24hpf (frontal). C. The expression pattern of DCC at 36hpf (lateral). D. The expression pattern of DCC at 36hpf (frontal). Scale bar:, lateral, 100μm; frontal, 60μm. 2.2 Netrin 在斑马鱼胚胎发育过程中的表达 Netrin 是 DCC 的配体。Netrin1 是哺乳动物 netrin1 基因的类似物，在斑马鱼基因组中有 75 netrin1a 和 netrin1b 两个重复基因。如图所示，在斑马鱼胚胎发育至 24 小时和 36 小时时， netrin1a 和 netrin1b 均表达于前脑腹侧中线部位(图 2A-D)。这提示，在斑马鱼前脑背侧 24 到 36 小时表达 DCC 的这组神经元在腹侧中线部位表达的 netrin 的吸引作用下，轴突向 腹侧投射。 - 3 - 精品论文 80 图 2. netrin 在斑马鱼胚胎 24 小时和 36 小时的表达。 A. netrin1a 在斑马鱼胚胎 24 小时的表达(侧面图)。 B. netrin1a 在斑马鱼胚胎 36 小时的表达(侧面图)。C. netrin1b 在斑马鱼胚胎 24 小时的表达(侧面图)。 D. netrin1b 在斑马鱼胚胎 36 小时的表达(侧面图)。标尺:100μm。 Fig. 2 The expression pattern of netrin in embryonic Zebrafish in 24 and 36 hpf. A. The expression pattern of netrin1a at 24dpf (lateral). B. The expression pattern of netrin1a at 36dpf (lateral). C. The expression pattern of 85 netrin1b at 24dpf (lateral). D. The expression pattern of netrin1b at 36dpf (lateral). Scale bar: 100μm. 3 讨论 DCC 家族成员在脊椎动物和非脊椎动物的轴突导向中都发挥很重要的作用。斑马鱼 DCC 基因已经被克隆。斑马鱼 DCC 是跨膜受体，属于免疫球蛋白超家族。细胞外部分包括 四个免疫球蛋白结构域和六个纤粘蛋白(firbronectin-type III repeats)结构域，一个单次跨膜结 90 [7]构域，细胞内部分包含三个保守结构域(P1、P2 和 P3)。已有报道指出,DCC 在斑马鱼神 经系统(包括脊髓、后脑、顶盖、视网膜等)高度表达，另外在发育中的胸鳍、心脏、胰腺 和小肠等部位也有表达。DCC 的功能在体外培养的脊椎动物以及非脊椎动物神经元中被广 [8] 泛而细致的研究。 DCC 可以与其配体 netrin 直接结合。 DCC 与其配体 netrin 结合后可 以发挥轴突导向的吸引作用，也可以发挥排斥作用，这取决于神经元上 netrin 受体的表达状 况。如果 DCC 在神经元细胞膜上形成同源二聚体，那么 DCC 可以介导轴突导向的吸引作 95 [9]用。如果 DCC 与 unc-5 形成异源二聚体，那么 DCC 可以介导轴突导向排斥作用。 本研究发现，在斑马鱼胚胎发育的早期(受精后 24 和 36 小时)，DCC 在斑马鱼前脑 背侧有丰富而集中的表达，netrin 在胚胎前脑腹侧中线也有很强表达。这就提示斑马鱼前脑 背侧这组神经元的轴突受到前脑腹侧中线表达的 netrin 的作用，与其轴突上高度表达的 netrin 100 - 4 - 精品论文 受体 DCC 相互作用，实现其轴突的正常投射。如果改变 DCC 的表达或者改变 netrin 的表达 可能会导致斑马鱼前脑背侧这组神经元轴突导向的错误，值得进一步深入研究。 4 结论 本文给出了 DCC 和 netrin 在斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。DCC 在斑马鱼前脑背 侧有集中而丰富的表达，而 netrin1a 和 netrin1b 则在斑马鱼前脑腹侧中线部位有很强的表达。 105 提示表达 DCC 的斑马鱼前脑背侧这组神经元受到腹侧中线分泌的 netrin 的作用，实现正常 的向腹侧的轴突投射。 [参考文献] (References) [1] Fekany K, Yamanaka Y, Leung T, sirotkin HI, Topczewski J, Gates MA, Hibi M, Renucci A, Stemple D, Radbill A, Schier AF, Driever W, Hirano T, Talbot WS, Solnica-Krezel L. 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