生化论文2

生化论文2 鸡卵类粘蛋白的分离纯化及活力测定 王松 马晓杨 韩小婉 魏晓明 (河北大学 生命科学学院 09生物技术,河北 保定,071002) 摘要:目的 探讨鸡卵类粘蛋白的的提取、分离纯化及性质测定的技术。 方法 采用有机溶剂沉淀法将鸡蛋清经三氯乙酸(TCA)—丙酮溶液处理,除去沉淀物,经DEAE 离子交换层析分离纯化粘蛋白,通过BAEE法测定其活性,再通过SDS—PAGE测定粘蛋白的分子量。 结果 制备了鸡卵类粘蛋白,测定其抑制活力为920U/L,粗品的相对分子量为32047Da,34673Da, 纯品的相对分子量为28840Da。 结论 该技术用于鸡卵类粘蛋白的分离纯化及活力的测定效果较好,但还存在一些问。 关键词:鸡卵类粘蛋白; 胰蛋白酶; 纯化; 活力; DEAE纤维素柱层析 The Separation and Purification of Chicken Ovomucoid and the Mensuration of Chicken Ovomucoid’s Activity and Molecular Weight Wang song, Ma xiao-yang, Han xiao-wan, Wei xiao-ming (Biotechnology in Grade 2009,College of Life Sciences, Hebei University,Baoding,Hebei,071002) Abstract: Objective To explore the technology of the isolation and purification of CHOM and mensuration of its activity. Methods chicken-egg was dealt with organic solvent like TCA-acetone solution, sediments was removed, it was purified through DEAE cellulose column chromatography, and its activity was determined by BAEE method, the protein’s molecular weight was measured by SDS—PAGE. Results The chicken ovomucoid was made, and the activity was 760U, the gruff product’s molecular weight was 32047Da,34673Da, and the purified product’s molecular weight was 28840Da. Conclusion The technology for the isolation and purification of CHOM and mensuration of its activity has a good effect but still has some problems. Key words: Chicken ovomucoid(CHOM); Trypsin; purification; activity; DEAE cellulose column chromatography 鸡卵类粘蛋白(chicken ovomucoid简称CHOM)是鸡卵清中含有的一种糖蛋白,鸡卵类粘蛋白在电泳行 为上常呈现不均一性,这与糖蛋白的微不均一性有关。目前至少已获得四种不同的组分,它们的等电点有一 [1]定的范围,大致在pH3.9-4.5,相对分子质量28,000 Da。卵类粘蛋白是一个相对热稳定的糖类蛋白质,这 [2]个糖蛋白的结构是三条通过链内二硫键连接的独立的主链。其在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍有较好 1 的溶解度,但在碱性溶液中比较不稳定,尤其当温度较高时易迅速失活。CHOM具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用,是胰蛋白酶的天然抑制剂,常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究,卵类粘蛋白抑制胰蛋白酶摩尔比为1:1。本实验主要参照Kassell所述的方法,先将鸡蛋清经三氯乙酸(TCA)—丙酮溶液处理,除去沉淀物,然后经丙酮分级沉淀获得粗品,在经过DEAE纤维素(二乙基氨基乙基纤维素)柱层析纯化而得合格产品。 1 材料与方法 1(1 材料 新鲜鸡蛋清 1(2 器材 离心机,透析袋,层析柱,紫外分光光度计,石英比色池,恒温水浴锅,垂直板电泳槽,凝胶膜,样品梳,直流稳压电源,微量取样器,摇床。 1. 3 试剂 4?丙酮—三氯乙酸溶液(1:4)、三氯乙酸溶液、冷丙酮、无离子水、DEAE-纤维素、0.02mol/LPH6.5磷酸盐缓冲液、0.2mol/LPH6.5磷酸盐缓冲液、0.3mol/L氯化钠溶液、1mol/L氯化钠溶液、0.05mol/LPH8.0Tris-HCl缓冲液、BAEE—0.05mol/LPH8.0Tris-HCl缓冲液、胰蛋白酶溶液等。 1(1(1 粗品制备 由1枚新鲜鸡蛋获得大约35mL鸡蛋清,盛于250mL烧杯内,放置于水浴锅内使温度达到25,30?,在不断搅拌下,缓慢加入等体积4?预冷的三氯乙酸—丙酮溶液,测定pH值为5.0,出现大量白色沉淀,为大量杂蛋白,用7.5 mL的TCA调节pH到3.5,使杂蛋白沉淀完全,继续搅拌30min,在4?下放置1 h, 4000 r/min离心20 min,得上清液33ml。向上清液中边搅拌边加入4倍体积的4?预冷的丙酮,可见白色沉淀产生,在 [3]4?过夜,4000 r/min离心20 min,弃上清液,得CHOM沉淀,加入2mL无离子水,溶解沉淀。装入一个透析袋对无离子水透析1周,将透析袋中的粘蛋白溶液4000 r/min离心20 min,弃沉淀,得上清液12.8mL。 1(1(2 蛋白质的纯化 采用DEAE纤维素柱层析纯化。将上清液倒入25mL量筒中测量体积,加入1/10上清液体积的0.2mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液,4000 r/min离心20 min,取上清液测量并记录粘蛋白粗品总体积,即上清样品15.9mL。将层析柱垂直安装在铁架台上,用水止夹紧柱下端的硅胶管。先加入1/3-1/2柱体积的水,取一合适大小的 [4]玻璃漏斗,安装在柱的上端。将经过预处理的DEAE-纤维素连同一些水倒入漏斗,不断搅拌,使之自然沉降到1cm左右的高度,打开柱下端的水止,继续搅拌漏斗内的纤维素,使之沉降至1/3-1/2柱高,测量柱高为11.3cm,体积44.3mL。将柱下短的硅胶管连接在核酸蛋白监测仪样品池的入口,打开核酸蛋白检测仪电源,预热至少30min。在此过程中以烧杯收集层析柱下端流出的废液。用5倍柱体积的0.02mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液平衡, 流速1.9mL/min。贴壁加1mL粗提样品,使样品全部缓慢流入层析柱床内,立即加0.02mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液到柱床上边保持2cm高度。继续以相同的磷酸盐缓冲液相同流速进行平衡,观察核酸蛋白检测仪的A值变化情况。当A值急剧上升时,开始计时,同时换干净试管收集对应的流出液,当A值上升到最高值时,计时,下降到数值稳定时,可停止收集流出液,再分别用0.3mol/LNaCl-0.02mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液,0.5mol/LNaCl-0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱,收集样品,最后用0.02mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液平衡。收集洗脱液后,装透析袋,用蔗糖浓缩后对水透析。 1(1(3 鸡卵类粘蛋白活性测定 用BAEE法对纯化后的粘蛋白进行活性测定。取2个石英比色池,分别加入3 mL 0.05mol/L pH 8.0 2 Tris-HcL缓冲液作为空白对照,2.9mL 30?预热的BAEE-0.05mol/L pH 8.0 Tris-HcL。在253nm下测定起始值,记录。向第二个池中加入100μL胰蛋白酶液立即混匀并计时,于253nm处测其光密度,每隔半分钟读一次数,共5分钟。再次,取2个石英比色池,分别加入0.05mol/L pH 8.0 Tris-HcL缓冲液作为空白对照,2.8mL 30?预热的BAEE-0.05mol/L pH 8.0 Tris-HcL。向第二个池中加入100μL胰蛋白酶液+100μL粘蛋白,立即混匀并计时,于253nm处测其光密度,每隔半分钟读一次数,共5分钟。 1(1(4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定粘蛋白分子量 按表1制备10%的分离胶,表2制备3.6%的浓缩胶后灌胶,插入样品梳,再进行样品的稀释,取5μL粗品粘蛋白(C),加入45μL蒸馏水为稀释后的粗品粘蛋白(C),取5μL纯化的粘蛋白(P)加入45μL蒸馏水1 为稀释后的纯化粘蛋白(P),然后然后分别取C和P 30μL,分别加入30μL上样液,混匀,煮沸5min,再分别1 取C和P150μL,加入50μL上样液,混匀,煮沸5min。待浓缩胶聚合后小心移出梳子,把凝胶玻璃板重新11 固定于电泳装置上,正负极槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。将待电泳分析的样品依次加入点样孔,点样顺序及点样量见表3。以电极线将电泳槽与电泳仪电源相接,调节电泳仪电源的电压旋钮,样品在浓缩胶时,(百晶)恒压150V,样品进入分离胶后,(百晶)恒压200V,继续电泳,直至溴酚蓝到达分离胶底部,将电压旋钮调至0,关闭电源。按要求回收电极液。从电泳装置上卸下玻璃板,用刮勺撬开玻璃板。切去凝胶右下角(对应于点样孔1),将凝胶放入平皿。将考马斯亮蓝R250染色液加入平皿,没过凝胶,脱色摇床震荡染液10分钟,用滴管将染色液回收到试剂瓶。用水洗去凝胶表面的浮色,弃水,放入沸水中煮,直至凝胶背景 [5]的蓝色退去。测量相对迁移率后扫描拍照。 表1 10%分离胶的配制 总体积 5 mL 30%胶母液(mL) 1.65 pH8.9buffer含SDS,TEMED(mL) 1.25 无离子水(mL) 2.1 10%APS(μL) 40 表2 3.6%浓缩胶的配制 总体积 2 mL 30%胶母液(mL) 0.24 pH6.7buffer含SDS,TEMED(mL) 0.5 无离子水(mL) 0.9 10%APS(μL) 30 表3 点样表 点样孔 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 样品 C C C C Marker BSA P P P P 1111 点样量(μl) 10 5 20 10 20 10 10 20 5 10 2 结果与分析 3 2.1 结果 2. 1. 1 鸡蛋类粘蛋白的纯化: 对蛋白粗品进行离子交换层析的时候,记录吸光度变化的时间及对应的吸光度的值,当A值急剧上升时收集,计时,更换试管收集对应的洗脱液,当吸光度的值上升到最高值时,计时,下降到数值稳定时,可停止收集洗脱液,洗脱过程时间与对应的吸光度情况见表4,用0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液洗脱收集到的洗脱液为杂蛋白,第二个峰值处的洗脱液多为具有抑制胰蛋白酶活性的的卵类粘蛋白,即部分纯化的卵类粘蛋白,第三个峰值处为杂蛋白。 在本实验中,DEAE柱层析时洗脱液的流速为1.9 mL/min。 表4 离子交换柱层析蛋白峰收集表 时间 吸光度 时间 吸光度 时间 吸光度 时间 吸光度 时间 吸光度 时间 吸光度 0:17:17 4 0:23:31 69 0:24:19 55 0:25:00 29 0:26:55 60 0:31:36 33 0:23:14 10 0:23:35 70 0:24:30 45 0:25:10 27 0:27:48 50 0:32:08 30 0:23:21 30 0:23:48 74 0:24:42 38 0:25:53 40 0:28:47 50 0:33:35 22 0:23:26 50 0:24:11 63 0:24:50 30 0:26:30 50 0:30:32 40 0:33:37 14 80 70 60 5028040 30吸光度A20 10 0 0.0010.0020.0030.0040.00 洗脱体积(mL) 图1 离子交换层析纯化蛋白色谱图 分析: (1)之前用0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液洗脱粗品时,吸收峰并无变化,一直维持在0水平,说明粗品基本已经除去; (2)吸收峰在迅速升起后略呈波浪型曲折下降,原因可能为:?加洗脱液时不稳定,造成压力不恒定,致使流速不恒定而造成,?装柱过程中有气泡产生,造成流速不恒定。 改进: 加洗脱液时,尽量保持恒定速度,减少不稳定因素;缓慢装柱,尽量使纤维素平面保持水平。 2. 1. 2 BAEE法测定胰蛋白酶的酶活力及卵粘蛋白的抑制活力 一个胰蛋白酶活力单位(BAEE单位):在253nm下,光吸值每分钟增加0.001即为1U。 抑制活性计算 BAEE单位:(Iu/mL)=(A1-A2/0.001)×N 4 A1=胰蛋白酶活性 A2=加鸡卵类粘蛋白的胰蛋白活性 N=稀释倍数 加入粘蛋白前后胰蛋白酶A的变化情况见表5。 253 表5加入粘蛋白前后胰蛋白酶A值 253 时间初始 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 (s) 值 胰蛋 白酶 2.988 3.483 3.452 3.508 3.501 3.506 3.475 3.556 3.585 3.535 3.514 A253 加入 粘蛋 白的 3.081 3.116 3.112 3.124 3.118 3.141 3.128 3.153 3.161 3.170 3.180 胰蛋 白酶 A 253 3.60 3.58 3.56 3.542533.52A3.50 3.48 3.46 3.44 0306090120150180210240270300 时间/s 图2未加粘蛋白的胰蛋白A值随时间变化 253 5 3.19 3.18 3.17 3.16 3.15253A3.14 3.13 3.12 3.11 3.1 0306090120150180210240270300 时间(/s) 图3加粘蛋白后的胰蛋白A随时间变化 253 由图2和图3,取近似一条直线上的3个值,得 胰蛋白酶活性(取150s到240s数值):109U 加入粘蛋白后胰蛋白酶活性(180s到240s数值):17U 所以,粘蛋白抑制活性 = (109U,17U) ,0.1mL = 920U/mL 分析: 活力较高,A曲线不能呈稳定的直线上升,读数不稳定 253 改进: 改进粘蛋白的保存条件,注意加样过程样品的保温,减少其自然分解;改进测定仪器,熟练掌握仪器的 使用。 2. 1. 3 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳测定类粘蛋白分子量 (1)经过考马斯亮蓝染色及沸水中煮后脱色,照相后结果如图4。 10 6 5 4 3 2 1 图4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图 图注:各泳道分别为 1:10μL粗品(C); 2:5μL粗品(C); 3:20μL粗品(C); 4:10μL粗品(C); 11 5:20μL Marker;6:10μL BSA; 7:10μL纯品(P); 8:20μL纯品(P); 9:5μL纯品(P); 10:11 6 10μL纯品(P)。 染色结束后,测量蛋白质及示踪染料的迁移距离,见表6。蛋白质的迁移距离是指从分离胶的起始位到蛋白质条带的前缘。计算Rf值:Rf=蛋白质的迁移距离/示踪染料的迁移距离,蛋白质的迁移距离为分离胶界面到蛋白质条带的实际位置的距离。示踪染液迁移距离Y=5.50cm,纯品粘蛋白平均迁移距离X=3.96cm,Rf=0.72。 (2)绘制蛋白质分子量对数与相对迁移率的标准曲线 本试验使用的是低分子量标准蛋白Marker,由6种标准蛋白组成,以已知蛋白质分子量的常数值为纵坐,Rf为横坐标绘图,可得到一条直线,求出回归方程。 标 Marker的相对分子质量与Rf关系见表6。 表6 Marker中蛋白的相对分子质量的对数与相对迁移率Rf的关系表 蛋白质名称 兔磷酸化酶 BSA 兔肌动蛋白 牛碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡血清溶菌酶 分子质量 66200 43000 31000 20100 14400 97400 相对分子质量的对数 4.988 4.821 4.633 4.491 4.303 4.158 标准蛋白质中蛋白的相对分子质量的对数与Rf的关系可表示如图5所示 5.1y = -1.0124x + 5.1841 5 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 标准蛋白质各蛋白分子量对数4.3 4.2 4.1 00.20.40.60.811.2 图5 标准蛋白质的相对分子量对数与Rf的关系 迁移率Rf 表7 各蛋白质迁移率及分子量 Marker BSA P C C 1 1 2 3 4 5 6 10 平均距3.70 3.70 3.50 3.50 1.15 2.15 2.65 3.80 5.05 5.40 2.15 3.96 离(cm) 迁移率 0.67 0.67 0.64 0.64 0.21 0.39 0.48 0.69 0.92 0.98 0.39 0.72 分子量 32047 32047 34673 34673 97400 61660 43000 31000 20100 14400 61660 28840 分子量4.79 4.24 4.51 4.51 5.14 5.14 5.10 4.79 4.63 4.49 4.30 4.16 对数 7 由图中公式,y = -1.0124x+5.1841代入纯蛋白迁移率,得个蛋白质相对分子量,见表7，纯类粘蛋白的分子量为28840Da。 分析: 电泳条带不齐,原因为点样孔内不平整,加样未加好;纯蛋白条带不清晰甚至看不到,原因为考马斯亮蓝染色时间短,造成部分条带未显色,或为纯蛋白取量少。 改进: 小心移出梳子,尽量使点样孔平整,增加粘蛋白样品取样量,适当增加染色时间。 3 讨论 (1)取蛋清时注意勿将蛋黄吸入，以避免杂蛋白干扰，在向蛋清中加入有机溶剂(三氯乙酸-丙酮溶液(体积比1:2))时，要不断搅拌，这样才能使蛋白充分分离，并且不会导致局部的有机溶剂浓度过高，不会是蛋白质发生永久性失活。 (2)纯化过程要详细记录各操作始末时间，由于一些在峰值附近的数据变化的较快，一定要注意对时间的记录。同时粗品提取成功与否直接影响此步操作，第二个峰的峰值只有88，没有出现第三个峰值则说明粗品中的粘蛋白浓度低。而收集所需峰值的蛋白是接下来实验的关键，后续的性质测定都是对纯品的测定。 (3)BAEE法测定蛋白的活性要注意保持酶的最适温度，防止酶活性的变化，加样过程注意混合均匀。 (4)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中首先要注意胶的浓度，分离胶和浓缩胶配量表的不同，在配完胶后应立即向平板中灌胶，以防胶在烧杯中凝固，灌胶时尽量防止气泡的产生;再次，点样顺序及浓度不要弄错，避免试剂溢出，污染凝胶。 (5)对于总体试验来说，本实验包括的操作方法有蛋白质的粗提蛋白质的纯化、蛋白质的活性测定、SDS—PAGE凝胶电泳法测蛋白质的分子量等。由于此次试验综合性较强，且时间较长，包括的操作方法也较复杂，使用的仪器也较多，故而要求我们时刻保持谨慎的心理，争取做好每一步。同时要强调团体间的合作性，只有团体间互相配合默契才能使实验有条理的进行，不能各行其用，而且对于各步做过的样品一定要谨慎处理，不能随便扔掉，从而造成数据的丢失甚至影响下一步试验的成功。因为综合性试验各步样品关联性很大，所以决不可粗心大意，要经思考之后再做处理决定。 参考文献 8 [1] KATO I, SCHRODE J, KOHR W J, et al. 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