免疫组化结果的分析和判断

免疫组化结果的分析和判断 第一节第一节免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则概括起来有免疫组化结果的判断原则概括起来有以下几点以下几点??必须同时设对照染色必须同时设对照染色。。没有对照染色的没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的免疫组化染色结果是不可信的。。??抗原表达必须在特定部位抗原表达必须在特定部位。。如如LCALCA应定位应定位在细胞膜上在细胞膜上CKCK应定位在细胞浆内应定位在细胞浆内PCNAPCNA及及pp5353蛋白应定位在细胞核内蛋白应定位在细胞核内EMAEMA应应定位在细胞膜上定位在细胞膜上等等等等。。不在抗原所在部不在抗原所在部位的阳性着色位的阳性着色一概不能视为阳性一概不能视为阳性。。??阴性结果不能视为抗原不表达阴性结果不能视为抗原不表达由于检测灵敏度有高低之分由于检测方法灵敏度有高低之分有有时可因染色方法灵敏度不够时可因染色方法灵敏度不够而导致阴性而导致阴性反应反应判断时应注意判断时应注意。。??尽量避开出血尽量避开出血、、坏死及切片刀痕坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达和界面边缘细胞的阳性表达特别是酶特别是酶免疫标记免疫标记。。因为这类阳性着色多系内源因为这类阳性着色多系内源干扰干扰或系人为因素所致或系人为因素所致。。??对免疫组化标记结果的意义不能绝对化对免疫组化标记结果的意义不能绝对化应结合临床资料应结合临床资料、、XX线等影像学及实验结果线等影像学及实验结果综合分析综合分析。。一一对照染色的目的对照染色的目的设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。。假阴性的原因主要有三假阴性的原因主要有三??组织处理不当组织处理不当抗原丢失过多或被遮蔽抗原丢失过多或被遮蔽??抗体失活抗体失活、、效价过低或稀释度不合适效价过低或稀释度不合适主要指一主要指一抗抗即特异性抗体即特异性抗体??染色步骤遗漏及差错染色步骤遗漏及差错或显色剂的选择或显色剂的选择、、缓冲液缓冲液的的pHpH和离子强度不当等和离子强度不当等。。假阳性均系由多种因素造成的非特异假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致原因主要有着色所致原因主要有?自发荧光或内?自发荧光或内源酶等干扰?抗体试剂不纯源酶等干扰?抗体试剂不纯特别是一特别是一抗?操作失误如污染、切片干枯或抗?操作失误如污染、切片干枯或显色剂操作不当等?显色剂操作不当等?FcFc受体的干扰等受体的干扰等等。等。二二对照的种类及其选用目的对照的种类及其选用目的对照染色大致可分为对照染色大致可分为四大类阳性组织对照、阴性组织对照阴性试剂对照自身对照??阳性组织对照阳性组织对照指用已证实含有靶抗原的同源及不同指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照时作同样处理和免疫染色的组织对照。。正正确的结果应呈现阳性确的结果应呈现阳性目的是为了证实所目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性用免疫组化染色流程的有效性排除假阴排除假阴性的可能性的可能。。??阴性组织对照阴性组织对照指用已证实不含靶抗原的同步处理和指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照免疫标记染色的组织对照。。正确的结果正确的结果应为阴性应为阴性目的是除外假阳性目的是除外假阳性。。??阴性试剂对照阴性试剂对照是指用于证实在免疫组化染色中所用试是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂剂尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照性而所设立的 同步免疫染色对照包括有包括有空白对照替代对照吸收试验和抑制试验空白对照替代对照吸收试验和抑制试验等等目的在于除外假阳性和证实所用免疫组目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性片免疫标记阳性结果的可靠性。。??空白对照空白对照指以缓冲液指以缓冲液PBSPBS、、TBSTBS等等取代第一取代第一抗体抗体主要的主要的必要时还可做第二抗体及必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代桥联抗体的空白取代其他各步不变的其他各步不变的试剂对照染色试剂对照染色结果应为阴性结果应为阴性。。??取代对照取代对照指以所用方法第一抗体同源动指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清物的正常血清或与本实验无关的抗体或与本实验无关的抗体靶靶生物缺如的生物缺如的取代第一抗体取代第一抗体其他步骤不变其他步骤不变的试剂对照染色的试剂对照染色结果应为阴性结果应为阴性。。??吸收试验吸收试验是指用事先经过量抗原吸收的是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体第一抗体上清液取代第一抗体其他步骤其他步骤不变的免疫染色试剂对照不变的免疫染色试剂对照。。结果应是阴性结果应是阴性或阳性着色明显减弱或阳性着色明显减弱吸收不全时吸收不全时。。??抑制试验抑制试验是指用标记抗体和未标记抗是指用标记抗体和未标记抗体体可以是一抗可以是一抗也可以是二抗或桥抗也可以是二抗或桥抗体体两者的混合物作试剂两者的混合物作试剂其他步骤不其他步骤不变的免疫组化染色试剂对照变的免疫组化染色试剂对照结果其阳结果其阳性着色应成比例的减弱性着色应成比例的减弱等量或等量或1199。。此试剂对照多用于直接法此试剂对照多用于直接法。。这类阴性试剂对照的这类阴性试剂对照的选用原则选用原则是是??空白对照不能省空白对照不能省其他对照在预实验其他对照在预实验中应尽量多做中应尽量多做尤其是应用新抗体试剂尤其是应用新抗体试剂??对照必需与实验片同步进行染色对照必需与实验片同步进行染色??对照的结果应符合要求对照的结果应符合要求。。??自身对照自身对照是指在同一标记切片上的自身是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照组织成分的阴性背景对照。。即与靶抗原阳性即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色结果应为阴性或着色较浅结果应为阴性或着色较浅需与阳性着色需与阳性着色成分呈鲜明对比成分呈鲜明对比。。目的在于排除内源性干扰目的在于排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果结果。。非特异染色非特异染色是指免疫组化染色过程中是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果属假阳性产生的非靶抗原的呈色结果属假阳性又称背景着色能严重干扰免疫组化染色又称背景着色能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断应竭力避免或减轻。其结果的正确判断应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节原因涉及免疫组化染色流程的各个环节可来自可来自??内源性干扰内源性干扰自发荧光自发荧光、、内源酶内源酶、、内源性内源性生物素等生物素等??试剂污染试剂污染质量差质量差交叉反应交叉反应FcFc受体干受体干扰等扰等??组织处理不当组织处理不当组织固定不及组织固定不及时或固定不时或固定不良所导致的抗原弥散移位良所导致的抗原弥散移位、、洗涤不充分所导洗涤不充分所导致的游离试剂残留等致的游离试剂残留等。。纠正的方法视原因而异纠正的方法视原因而异可在预实可在预实验基 础上验基础上采用有针对性的纠正对策采用有针对性的纠正对策即对症下药即对症下药。。免疫组化标记具有一定形态特点免疫组化标记具有一定形态特点若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断结果的正确判断。。内容包括定性内容包括定性、、定位定位和定量三方面和定量三方面。。免疫显色强度和阳性细胞密度是定免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标性定量指标实际工作中常采用强度和实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量密度结合的方法综合计量与抗原含量与抗原含量有关阳性细胞的着色形态及组织分布有关阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标特点主要是定位指标与功能有关与功能有关。。一一、、阳性标记免疫特征阳性标记免疫特征分分““弱弱、、中中、、强强””三级三级。。免疫荧光法免疫荧光法FITCFITC为例为例则表现为浅绿则表现为浅绿色荧光色荧光、、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光免疫酶标记免疫酶标记 HRPHRP--DAB/HDAB/H22OO22则则表现为淡黄色细颗粒表现为淡黄色细颗粒、、棕黄色颗粒和褐棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒黄色粗颗粒后者耀眼易见后者耀眼易见。。图像摄影图像摄影原则上多取强阳性区域原则上多取强阳性区域。。以以HRPHRP--DAB/HDAB/H22OO22为例为例可分为可分为??胞膜胞膜型型??胞核型胞核型??胞质胞质浆浆型型??微绒毛型微绒毛型和和??复合型复合型胞膜胞膜--胞质兼有胞质兼有胞核胞核--胞质兼胞质兼有有或微绒毛或微绒毛--胞质兼有胞质兼有等五种阳性细胞等五种阳性细胞类型类型。。这与抗原所在部位相关联这与抗原所在部位相关联但应注但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象象尤其是复合型图像尤其是复合型图像三三、、阳性标记组织学特征阳性标记组织学特征以以 HRPHRP--DAB/HDAB/H22OO22为例为例免疫组化染色阳性细胞在免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下组织中的分布排列形式可以有如下77种种??局灶型局灶型??弥漫型弥漫型??片块型片块型??网状型网状型??腺管型腺管型??腔缘型和腔缘型和??菊团型菊团型等等。。这主这主要取决于抗原抗体复合物在细胞要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点阳性细胞在组织内的群体分布特点。。四四、、阳性标记强度特征阳性标记强度特征依照细胞阳性依照细胞阳性着色程度着色程度抗原含量抗原含量可分为弱阳性可分为弱阳性??11分中等阳性分中等阳性??22分分强阳性强阳性??33分分。。依照依照阳性细胞数阳性细胞数量量可分为弱阳性可分为弱阳性指阳性细胞指阳性细胞数在数在2525以下以下??11分分中等阳性中等阳性指阳性细胞数在指阳性细胞数在2525——4949??22分强阳性分强阳性指阳性细指阳性细胞数在胞数在5050以上以上??33分分。。目前多采用积目前多采用积分综合计量分综合计量。。计算公式两者相乘计算公式两者相乘或或相加相加。。大多主张大多主张44者为者为阳性阳性66者为强阳性者为强阳性至少随机观察至少随机观察55--1010个个HPFHPF取其均值取其均值。。免疫组化染色的基本要求有二免疫组化染色的基本要求有二??实实验切片的阳性抗原定位准确验切片的阳性抗原定位准确呈色鲜明呈色鲜明背景着色浅或无背景着色浅或无二者的比值应大于二者的比值应大于11阳阳性性//背景背景??对照染色的结果应对照染色的结果应符合要求符合要求。。否则否则所得实验结果都是错误的所得实验结果都是错误的或 为或为假阳性或为假阴性假阳性或为假阴性。。假阳性假阳性是指实验切片呈阳性阴性是指实验切片呈阳性阴性组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结果谓之假阳性。其原因与内源性干扰果谓之假阳性。其原因与内源性干扰试剂不纯交叉反应等有关。试剂不纯交叉反应等有关。假阴性假阴性是指实验切片呈阴性是指实验切片呈阴性阳性组阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果谓之假阴性谓之假阴性。。其原因与组织处理不当其原因与组织处理不当组织细胞抗原丢失或试剂错误组织细胞抗原丢失或试剂错误如漏加如漏加、、错加错加、、失效失效、、变质等变质等操作失误等有关操作失误等有关。。对照结果判断对照结果判断检测标本含抗体结果可靠检测标本含抗体结果可靠检测标本不含抗体结合可靠检测标本不含抗体结合可靠表中表中1155结果无效结果无效66、、77结果可靠结果可靠染色失败原因染色失败原因均为阴性均为阴性均为弱阳性除阴性对照均为弱阳性除阴性对照背景染色过深背景染色过深阳性对照好待检标本弱阳性阳性对照好待检标本弱阳性阳性对照无背景待检标本背景深阳性对照无背景待检标本背景深判断原则判断原则实验实验设计抗体选择抗体选择抗原定位性抗原定位性抗原分布不均一性抗原分布不均一性假阴性常见原因假阴性常见原因抗原丢失或减弱抗原丢失或减弱抗体失效或稀释度不当抗体失效或稀释度不当操作失误操作失误假阳性常见原因假阳性常见原因抗原弥散抗原弥散抗原异位表达抗原异位表达瘤细胞吞噬瘤细胞吞噬病变中正常组织残留病变中正常组织残留抗体交叉反应抗体交叉反应内源性物质着色内源性物质着色边缘、刀痕、皱折、坏死或挤压区域边缘、刀痕、皱折、坏死或挤压区域不作为判断依据。不作为判断依据。免疫组化标准化免疫组化标准化抗原特异性抗原特异性抗体交叉反应和标记谱系抗体交叉反应和标记谱系方法规范化方法规范化结果综合分析和判断结果综合分析和判断IgGDABH2O2PBS纠正的方法视原因而异纠正的方法视原因而异可在预实可在预实验基础上验基础上采用有针对性的纠正对策采用有针对性的纠正对策即对症下药即对症下药。。