抗氧化肽的研究进展
1.1 抗氧化肽的研究进展
生物体抗氧化肽的种类
人们对抗氧化肽研究的种类有很多,常见的有大豆肽、乳蛋白肽和肌肽,也有一些特
殊的蛋白肽,如苜蓿叶蛋白肽等 。有些活性肽是直接提取的,也有通过蛋白水解
获得的。
1.1 大豆肽
大豆肽是大豆蛋白水解得到的小肽Wendee Chiang 等采用酶膜反应器连续生产大豆多
肽,由于及时分离了酶解生成的多肽,消除了产物反馈干扰,提高了酶解效率,并采用氧化稳定指数 (OSI检测了大豆分离蛋白及其水解物的抗氧化活性,结果显示大豆分离蛋白酶解后抗氧化活性明显提高。Hua- Mingchen 等采用 5 种蛋白酶对大豆 7S 球蛋白进行水解,
采用硫酸氰铁法检测了不同水解产物的抗氧化活性,并采用 G- 25 凝胶层析和反相高压液 相色谱对水解产物进行分离、提纯,检测不同大豆多肽的抗氧化活性,得到了 6 个抗氧化肽的氨基酸序列。
1.2 乳蛋白肽
乳蛋白肽是乳品深加工的理想产品,刘志东等研究乳清分离蛋白 (WPI) 酶解物对
自由基的清除效果,并证明了木瓜蛋白酶酶解物和胰蛋白酶酶解物对 DPPH 自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除能力和还原能力强于胰凝乳蛋 白酶酶解物和胃蛋白酶
[1]研究了酪蛋白及酪蛋白水解肽的抗氧化活性,认为酪蛋白本酶解物。Sandrine G. Rival 等
身具有抗氧化活性,并不因脱磷酸作用和水解作用而失去这一活性,并使用酪蛋白及酪蛋 白水解肽作为抗氧化剂进行研究。
1.3 肌肽
1900 年俄国首次发现肌肽,它是一种水溶性天然二肽。Eun- Kyung Kim 等[2]通过纯
化鹿肉酶解物来获得抗氧化肽。AI SAIGA 等利用 2 种酶分别水解猪肌原蛋白来获得抗氧化肽,并对木瓜蛋白酶水解后的产物进行分离纯化,获得 5 个具有抗氧化活性的肽片段,
示为 Asp- Ser- Gly- Val- Thr、Ile- Glu- Ala- Glu- Gly- Glu、Asp- Ala- Gln- Glu- Lys- Leu-
Glu、Glu- Glu- Leu- Asp- Asn- Ala- Leu- Asn、Val- Pro - Ser- Ile- Asp- Asp- Gln- Gly- Glu-
Leu- Met,其中 Asp - Ala- Gln- Glu- Lys- Leu- Glu 抗氧化能力最强。
1.3 其他肽
谢正军等对苜蓿叶蛋白抗氧化肽水解用酶进行筛选研究,结果表明碱性蛋白酶 Alcalase 是
制备苜蓿叶蛋白抗氧化肽的最适水解酶。Anne Pihlanto 等[3] 分离得到分子量为 10 kDa~3 kDa 的马铃薯蛋白水解物,并测定其抗氧化活性,从而肯定了马铃薯的生物价值。Dong Wang 等[4]认为从豆豉中提取的肽有很高的抗氧化活性。Hang Guo 等[5]酶解蜂王浆蛋白获得 12 个活性肽片段,这些片段均表现出清除羟自由基的能力。
1.1.2 抗氧化肽的机理
抗氧化肽的抗氧化活性与多肽的相对分子质量大小、氨基酸序列、氨基酸侧链基团、金属盐络合有关。抗氧化肽的肽链长短对活性影响较大,一般认为应在 20 个氨基酸残基以Val、Leu 未能呈现在肽段的 N-端和 C - 端,则抗氧化性显示不 出来。Hua- MingChen 等人利
用大豆蛋白水解获得抗氧化肽 Leu-Leu- Pro- His- His,当去掉 C - 端 His 时,抗氧化活性降低,而去掉 N - 端 Leu 时,抗氧化活性没有影响。他们认为 His 和 Pro 在抗氧化活性序列中有重要作用,因为 Pro- His- His 序列肽段的抗氧化活性最高,当在 Pro 或 His 的位置上导入 Tyr 不会增强活性。有争议的是,Hang Guo 等[5]人的实验却发现 C - 端是 Tyr 的 3 个二肽有较强的抗氧化活性。徐力等[6]制备水
解玉米蛋白制备抗氧化肽,其结构Leu- Asp- Tyr- Glu,其中 Tyr 具有酚羟基结构,能
提供质子猝灭自由基,与 Tyr 邻近的 Asp 和 Glu 的羧酸根具有吸 电子作用,使 Tyr 酚羟基上氧电子云密度减弱,更有利于质子的释放,增强了 Tyr 的质子供体效应。此外,玉米抗氧化肽的 N - 端为疏水性氨基酸 Leu,使抗氧化肽与脂肪酸的相互作用增强,提高了其对
脂质自由基的捕捉能力。因此,抗氧化肽的抗氧化活性是由其分子供氢的能力和自身
结构的稳定性决定的。通过捕捉自由基反应链的过氧化自由基,阻止或减弱自由基链反应的进行,氢原子给予自由基后,本身成为自由基中间体,此中间体越稳定越易形成,其前体就越易清除自由基则抗氧化能力越强。研究发现单纯的氨基酸也有某些抗氧化活性,但其活性远远低于由其所组成的抗氧化肽,这也是生物活性肽的一个显著的特点,即整个肽的活性远大于其组成氨基酸的活性。因此,我们认为抗氧化肽的高生物活性在于肽链 提取法是指从微生物、动植物中提取出一些天然存在的抗氧化肽, Decker等从骨骼肌中提取肌肽 。但因生物体 化学水解法是将蛋白与一定浓度的酸或碱溶液混合,加热至一定温度并保持一段时间,使蛋白质的肽链裂解。该方法简单、成本低,但氨基酸受损严重,活性难以保持,水解程度难于控制,食品工业中通常不采用。
3酶法水解 酶法水解是酶解蛋白得到所需要的肽,该法反应条件温和、反应时间短、效率高,在一定条件下可以定位水解,且反应过程易控制,产品纯度高,成本低廉,可较好地满足肽的生产需要,是获得食品级生物活性肽的常用方法 。
4 发酵法 利用微生物发酵生产多肽时,微生物可对肽的基团进行修饰、重组,制得的肽无异味,可广泛用于食品和医药行业。
5化学合成法 化学合成法更适于合成中等长度肽链的肽,但该法成本高,且有副反应物及残
留化合物。
6 基因重组法 采用基因重组技术制取活性肽因宿主不同其表达的肽也不同,表达产物的分离纯化比较困难,该方法常用于合成肽链相对较长的肽。
抗氧化能力的评价
2.1 抗氧化能力的测定指标
2.1.1 清除自由基
人体在正常生理代谢过程中会产生少量的自由基,如超氧阴离子、羟基自由基等,这些自由基通过与存在于体内的抗氧化酶及其他抗氧化剂的作用而被消除。因此,在正常状态下,体内自由基维持在一定水平并处于动态平衡之中,并不表现出对组织、细胞功能的损伤。然而,随着增龄或在某些病理状态下以及机体受到创伤时,过多的氧自由基不能被及时清除而堆积在细胞内,致使它们与机体内的一些生物大分子,如蛋白质、核酸、脂质等发生反应,生成大量氧化物或过氧化物,影响细胞物质和能量代谢的正常进行。
清除DPPH 和ABTS 所产生的自由基能力是体外评价抗氧化能力的常用指标。另外还原三价铁离子的能力也常作为抗氧化能力的评价指标。DPPH 和ABTS所产生的自由基是一种稳定的自由基,但这种自由基并不在生物体内存在。为了使测定更接近体内的情况,氧自
由基吸收能力这一指标越来越多的用于抗氧化能力的测定,此方法的原理是根据样品猝灭自由基所产生的荧光的能力大小来评价其抗氧化能力高低。
2.1.2 抑制脂质过氧化
抑制脂质过氧化的测定方法主要有电子自旋共振法、共轭亚油酸体系测定法、硫代巴比妥酸法。以上检测方法均可用于检测受试物是否可抑制脂质过氧化反应,从而了解其抗氧化性能。电子自旋共振法一般用于氧化初始阶段的测定,主要测定活性物质诱捕自由基的能力。共轭亚油酸体系测定法选用共轭亚油酸,一种自身很易于氧化的物质作为过氧化评价体系,添加活性物质测定其对共轭亚油酸过氧化的抑制作用,从而评价其抗氧化能力。硫代巴比妥酸法以脂质过氧化产物丙二醛(MDA)为测定指标,抑制MDA 的生成已广泛作为评价抗氧化肽抑制脂质过氧化能力的重要指标。
目前有许多方法应用于抗氧化能力的测定,但由于原理各不相同,所以不同方法间的比较就显得十分困难,而且这些体外的化学评价方法最大的问题就是不符合体内的情况,使其测定结果对于体内研究没有预测意义。近 20 年来,活性氧和自由基的研究成为现代生命科学的前沿和热点,评价和筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。因而各种抗氧化的测定方法也在不断的发展。越来越多的研究者采用体外细胞培养的方法,测定抗氧化肽对由过多自由基所造成的DNA 损伤的保护作用。
抗氧化剂体外抗氧化的试验特点是快速、灵敏。它们在实际应用中可检测到某种物质具有的抗氧化能力,可作为筛选活性试验,同时也能对受试物的抗氧化原理有初步的了解。相对于体外研究,抗氧化作用的体内研究较少,体内抗氧化机理还需要进一步深入研究。
2.2 影响抗氧化能力的因素
2.2.1 底物蛋白
生物活性肽通常由两至十几个氨基酸残基组成,以非活性状态存在于蛋白质的长链之
中,在蛋白质的水解非活性状态存在于蛋白质的长链之中,在蛋白质的水解过程中,具有活性作用的基团逐渐暴露出来,它们的活性就被释放出来。蛋白结构中氨基酸的种类、数量以及氨基酸的排列顺序都与其水解产物中抗氧化肽的含量、组成、活性强弱有着密切的联系,同时也影响最终抗氧化肽的分离纯化难易程度。有文献报道,许多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力,如组氨酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸等。因此在选择原料制备抗氧化肽时,必须注意底物的结构、性质。
2.2.2 蛋白酶
肽是蛋白质经酶水解而得,不同蛋白酶的酶切位点各不相同,因此即使对于同一种蛋
白,用不同蛋白酶水解所得的肽,其氨基酸组成和分子量大小也会有所不同,而这些正是影响肽抗氧化活性的主要因素,因此选用合适的蛋白酶就成为制备高活性抗氧化肽的重要因素之一。
2.2.3 水解度
对某一底物蛋白的水解产物而言,其氨基酸组成和分子量大小与抗氧化活性有明显的
相关性。随着水解过程的进行,水解度逐渐增大,水解产物中蛋白质、肽、氨基酸的组成、含量会发生相应的变化,但不同的蛋白质其自身性质不同,因此其合适的水解度也不同,需通过具体实验才能确定。
2.2.4 pH 值
由于抗氧化肽和水解酶的蛋白质特性,pH 值的变化一方面会影响蛋白酶的活力,从而
直接影响了酶与底物蛋白的结合与催化,每个催化反应都有一个最适宜的p H 。另一方面由于抗氧化肽在不同pH 下的离子状态不同,因此不同pH值会影响抗氧化活力的稳定性。
2.2.5 温度
不适宜的温度会影响蛋白酶的酶活。另一方面过高的温度会使抗氧化肽变性失活,因
此在抗氧化肽制备过程中,浓缩干燥的方式以及温度的控制就显得十分重要。当干燥温
度超过 100?会显著减弱抗氧化肽的活性,真空冷冻干燥对于抗氧化活性的保护好于热风干燥。然而在温和的温度下暴露过长时间也会造成抗氧化能力的减弱,有报道发现在40?,pH5 的条件下,8h 以内抗氧化能力基本没有变化。但放置2d 后,抗氧化能力便明显减弱。 总体来说目前对于抗氧化肽在浓缩干燥过程中由于温度所造成的活性损失,还缺乏系统性的深入研究。
2.2.6 肽的化学结构
肽的抗氧化活性与其氨基酸序列、组成有着密切的关系。有研究表明,含有组氨酸的
肽可能具有螯合金属、猝灭活性氧和清除羟基自由基的能力。另有研究报道氨基酸残基的氧化是抗氧化肽能够清除自由基的原因之一,但是游离氨基酸并没有表现出抗氧化活性,因为肽的一级结构是构成其具有抗氧化作用的必要因素。然而到目前为止抗氧化肽的作用机理和构效关系还有待进一步研 究 。
1.2 蛋白质酶解技术研究进展
1.2.1 蛋白质酶解技术及其产物特点
蛋白质酶促水解反应(简称酶水解或酶解)是指应用生物蛋白酶对生物组织的蛋白质进行分解, 使大分子蛋白质变成小分子活性多肽及氨基酸, 以利于吸收和使用。酶解技术是蛋白质
、酶工程和生物工程相结合的产物, 近年来被广泛应用于医药、食品和饲料等领域。
1.2.2 酶解技术在植物蛋白加工中的应用
1.3 酸枣仁的研究进展
1.3.1 酸枣仁的化学成分
酸枣仁为鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子。其味甘、酸,性平,归心、肝、胆经,具有养心安神、敛汗生津、补肝之功效,主要用于心神不宁及自汗、盗汗等证。陈藏器谓:“其枣圆小而味酸,其核微圆而仁稍长,色赤如丹”说明古今用药基本一致。为了更好的了解酸枣仁的化学成分和药理性质。
研究表明,酸枣仁除含一般的营养素,如碳水化合物、蛋 白质、油脂外,还含有 多种生物活性成分。对酸枣仁化学成分 的研究 已有二十多年 的历史,近年来有了较大的突破。 目前 已分离鉴定的酸枣仁特征性化合物有20余种,包括脂肪酸、白桦脂酸、白桦脂醇、总黄酮、当药素、酸枣仁皂苷及阿魏素、酸枣仁多糖等,且含有多种氨基酸及微量元素。其药用 的物质基础较受关注 的是枣仁皂苷 A、B、B1 、黄酮苷、酸枣多糖等物质。
1.3.1.1酸枣仁皂苷
酸枣仁皂苷是酸枣仁的主要成分为三萜类化合物,包括白桦脂酸、白桦脂醇、酸枣仁皂苷,其皂苷由皂苷元和糖、糖醛酸或其他有机酸组成。通常按照皂苷被水解后生成的皂苷元的化学结构,可将皂苷分为三萜皂苷和甾体皂苷。酸枣仁皂苷的苷元为枣仁苷元,糖部分组成不同。枣仁苷元属新的达玛树脂烷系的四环三萜皂苷,其中五元环上的一个碳原子连接两个活泼氧原子,具有较强的还原性,容易被氧化开环形成三环化合物,具有较强的中枢抑制作用。普遍认为,皂苷是酸枣仁的有效镇静成分,其为三萜类化合物,在结构上与人参、三七等的皂苷类有效成分较为接近。
脂肪油含有约32%的脂肪油,油的可皂化部分中检出41种成分,鉴定了24种,大部分为脂肪酸类;即己酸甲酯、庚酸甲酯、辛酸甲酯、壬酸甲酯、2,4-葵二烯酸-1、葵酸甲酯、十
一烷酸甲酯、 2 -丁基 - 辛醇-1、十四烷酸甲酯、十五烷酸甲酯、十六烷酸甲酯、十七烷酸甲酯、9,12- 十八碳二烯酸甲酯、9-十八烷酸甲酯、十八烷酸 甲酯、9-十八烷酸甲酯、11-二十烷酸 甲酯、二十三烷酸 甲酯、二十四烷酸甲酯、二十五烷酸甲酯、二十六烷酸甲酯。
酸枣仁生物碱
酸枣仁中分离得到酸枣宁B、酸枣宁D、酸枣宁F、酸枣宁 G、酸枣宁 G1、酸枣内宁、鼠李宁、鼠李叶素等复杂环肽类生物碱 。
黄酮类
斯皮诺素、6—芥子酰斯皮诺素、6—阿魏酰斯皮诺素、6—对香豆酰斯皮诺素、当归素、酮苷、6,8—二—碳葡萄糖基芹菜素、芹菜素—6—C—[(6—O—对羟基苯甲酰) —ß—D—吡喃葡萄基(1?2)] —ß—D— 吡喃葡萄糖苷。
其他成分
含挥发油、糖分、蛋 白质、有机酸、氨基酸、维生素C、阿魏酸、苦味质、粘液质、植物 甾醇、多种无机元素(K、Na、Ca、Fe、Cu、Mn、Cd、Se、Mo)等。
1.3.2 酸枣仁的药理作用
镇静催眠作用
研究表 明,酸枣仁具有镇静催眠作用。酸枣仁是临床常用 的镇静催眠药物,药理研究和临床用药表明,酸枣仁可 以延长睡眠时间,与戊巴比妥等有协同作用,对多数失眠、入睡困难和睡眠易醒的人都有较好的疗效。有人以5%的酸枣仁提取物给小鼠灌胃,发现其能明显抑制正常小鼠的活动次数,抑制苯丙胺的中枢兴奋作用,降低大鼠的协调运动,明显延长戊巴比妥钠阈剂量的小鼠睡眠时间以及增加戊巴比妥钠阈下催眠剂量 的入睡动物数,具有较明显的镇静催眠作用。
抗惊厥作用
目前的研究表 明,酸枣仁亦有抗惊厥作用。采用士的宁致小鼠惊厥法,观察酸枣仁对小 鼠惊厥潜伏期、死亡时间和死亡率的影响。发现小鼠口服酸枣仁提取物100mg/kg,出现惊厥的时间及死亡时间均明显延长。而且,实验证明起抗惊厥作用的主要物质是酸枣仁总生物碱及其环肽生物碱成分 。
抗焦虑作用
临床及实验研究表 明,酸枣仁具有抗焦虑 作 用。运用动物模型高架十形迷宫诱发的动物焦虑状态,研究不同给药剂量 的抗焦虑作用效果评价,结果表明酸枣仁具有一定的抗焦虑作用。酸枣仁抗焦虑作用的机制可能涉及到对中枢神经递质、神经调质、免疫细胞因子、下丘脑—垂体—肾上腺轴的整体调控,提高相关脑区的单胺类递质的含量,增强GABAA受体表达以及脑组织中1L-1ß、GR表达,保护焦虑症伴有的高皮质酮状态可能引起神经细胞损伤等。酸枣仁对焦虑引起或伴随的内分泌—免疫失调等复杂病态的治疗具有优势。 对学习记忆的影响
现在使用的以苯二氮卓类为代表的镇静安眠药物通常具有严重的削弱学习记忆功能的副作用,据报道酸枣仁不但不会干扰小鼠的学习记忆功能,反而对其有加强作用。有人用跳台法和避暗法研究了酸枣仁油对小鼠学习记忆的影响,以酸枣仁油 胃,实验表 明酸枣仁油大中小剂量组小鼠的错误潜伏期延长,错误次数减少,说明酸枣仁油可以增强正常小鼠的记忆功能,对正常和记忆损坏小 鼠的学习记忆功能均有改善和提高作用 。
对心血管系统的作用
降压作用研究表明,酸枣仁水煎液和醇提物对狗、猫、鼠,无论是口服、腹腔注射或静脉注射均具有明显的降压作用。实验表明,酸枣仁对颈上交感神经节无阻断作用,对中枢降压反射及 α和β 受体也无影响。因对心肌收缩力、心率和冠脉流量均无明显影响,说明其降
压作用与心脏功能的改变无关。
防治动脉硬化及 降血脂作用
实验发现,酸枣仁具有防治动脉硬化及降血脂作用。有人以酸枣仁总皂苷 以64mg/kg腹腔注射,连续20d,能明显降低正常饲养大鼠血清的胆固醇,显著升高高密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇第二组分,说明酸枣仁总皂苷可通过降低血脂和调理血脂蛋白构成,对动脉粥样硬化的形成和发展有抑制作用。另有实验表明,以酸枣仁粉10g/(kg?d)加喂实验动物家兔,三个月后,实验组的TC、LDL和TG明显低于对照组,而HDL和HDL/LDL水平明显高于对照组。主动脉和心脏冠状动脉As病理切片结果表明,冠状动脉As发生率
明显低于对照组。
免疫增强作用
研究表明,酸枣仁能增强细胞免疫功能,明显促进抗体生成。对放射性引起的白细胞降低有一定的保护作用,能增加单核巨噬细胞的吞噬功能,也能延长被 Co 照射动物 的存活时间。有人以酸枣仁提取物5g/kg给小鼠口服,能明显提高小鼠淋巴细胞转化值,小鼠溶血素生成也明显高于对照组,能明显增强小鼠单核—巨噬细胞的吞噬功能,可明显增加小鼠的 迟发型超敏反应并能拮抗环磷酰胺引起的小鼠迟发型超敏反应的抑制作用。
抗诱变、防治癌症的作用
研究表明,酸枣仁具有较好 的抗肿瘤、抗诱变、防治癌症的作用,可以提高机体的非特异性免疫功能,能明显延长艾氏腹水癌小鼠的生存天数,生命延长率大于50%。其中总黄酮、总皂苷及 白桦脂酸是抗诱变和防癌的有效成分。
抗炎作用
大量的研究证实,酸枣仁提取液具有 明显的抗炎作用,能抑制小鼠腹腔、背部皮肤及耳廓毛细血管的通透性,对大 鼠后足蛋清性肿胀及大 鼠腋下植入纸片产生的肉芽肿均具有抑制作用。
抗衰老
经 测 定,酸 枣 仁 油 中 总 维 生 素E含 量 为18.67mg/100g 油,酸枣仁中皂化物含量为 1.6%,其中大多数具有一定 的活性,尤其是角鲨烯具有较好的抗氧化作用,当角鲨烯和维生素E同时存在时,可增强抗氧化作用,从而说明酸枣仁具有较好的抗衰老作用。另外,酸枣仁对内毒素发热小鼠 SOD的降低具有一定 的保护作用。近代生物医学提示,自由基和人类衰老有密切联系,机体有一系列抗氧化酶来解毒,SOD就是其中之一,具有阻碍生物膜过氧化、预防衰老的重要作用。实验结果证 明,给小 鼠静脉和腹腔注射 内毒 素 引起长期高热,从而 使 小鼠SOD含量下降,酸枣仁液连续6d口服给药,再行内毒素注射,血及肝脏组织SOD与正常组接近,酸枣仁组SOD含量高于模型组,与口服生理盐水组有较大差异,提示酸枣仁对内毒素所致发热小鼠SOD降低具有保护作用,从而具有抗衰老作用。