医用纤维蛋白胶亚急性毒性实验研究

医用纤维蛋白胶亚急性毒性实验研究472中国药事2007年第21卷第7期医用纤维蛋白胶亚急性毒性实验研究王春仁,王召旭,宋谊萍,彭新杰,奚廷斐(中国药品生物制品检定所,北京100050)摘要:按照GB/T16886.11医疗器械生物学评价第11部分全身毒性试验的方法,观察了医用纤维蛋白胶对大鼠的全身亚急性毒性反应,其目的是找出纤维蛋白胶毒副反应的靶器官,确定是否有潜在的毒性反应,研究发现纤维蛋白胶浸提液高低剂量连续大鼠腹腔注射给样14天,大鼠一般状况良好,体重增加.给供试品后高剂量雄性和低剂量雄,雌性大鼠的凝血时间与对照组比较明显延长.高,低剂量雌雄性大鼠脾脏系数与对照组比较有显着性差异.病理组织学检查不同剂量浸提液组大鼠脾肿大,充血及生发中心淋巴细胞增生.因此纤维蛋白胶毒性可能的靶器官主要是凝血系统和免疫系统的脾脏,提示可能有潜在的免疫毒性.关键词:纤维蛋白胶,亚急性毒性,止血,免疫毒性中图分类号:R994.2;R994.21文献标识码:A文章编号:1002—7777(2007)07—0472—04TheSubacuteSystemicToxicityInvestighationofMedicalFibrinGlueWangChunren,WangZhaoxu,SongYiping,PengXi~ieandXiTingfei(NationalinstitutefortheContro1ofPharmaceutica1andBiologica1products,Beijing100050)ABSTRACTThesubacutesystemictoxicityofmedica1fibringluewasinvestigatedbasedonthemethoddescribedintheGB/T16886.11BiologicalEvaluationofMedicalDevicesPart11:SystemicToxicityforfindingpossibletargetorganoffibringluewhichpotentiallycausetoxicandsideeffect.Thedeterminationoftoxicitywasbaseduponclinica1observation.animal/organweights,haematologica1parametersandserumbiochemica1analysis,necropsyobservationandhistopatho1ogica1assessmentofselectedtissuesfromanimalsintestandcontrolgroupdidnotexhibitanysignsofclinicalobservationwithbodyweightgainoverthecourseofthestudy.Thebloodclottingtimwwasprolongedinthefemalehighdosegroupandlowerdosegroup.Necropsyfoundthatthespleenenlargementinthetestgroupsandspleenorganindexinthetestgroupswassignificantlydifferencefromthecontrolgroups.Thehistopatho1ogica1observationalsofoundthecongestionandlymphocytesproliferationintheenlargedspleentissue.Thestudyconcludedthatthepotenticaltoxictargetorganofthefibringluewastheimmunologicalspleenandbloodcoagulationsystem.KEyWORDSFibrinGlue;SubacuteSystemicToxicity;Haemostatic;immunotoxieity医用纤维蛋白胶是采用猪血液纯化的纤维蛋白原和凝血酶组成的双组分产品,在临床上广泛使用于创面渗血的局部止血,具有比较良好的止血效果[1_引.但是,纤维蛋白胶作为异种蛋白对人体具有一定免疫原性,因此本文观察了纤维蛋白胶浸提液对大鼠连续腹腔注射所产生的亚急性毒性反应,找出毒副反应的靶器官的情况,确定是否有潜在的毒性反应.1试验材料和方法1.1试验材料1.1.1浸提液制备纤维蛋白胶为市场上购买的产品.临用前将纤维蛋白胶按标准要求制成膜后取面积120am2加生理盐水40mL(按60am/20mL)放人37?1?隔水式培养箱内经24小时萃取.1.1.2试验动物和饲养条件中国药事2007年第2l卷第7期473Wistar品系大鼠3O只,雌,雄各半,挑选大鼠体重120150g,由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供,动物质量合格证号:SCXK1l一00—0010号.购人的大鼠在中国药品生物制品检定所实验动物室饲养观察l周后用于试验.动物实验环境为清洁级,人工光照时间l2小时明,l2小时暗,温度22?,25?,相对湿度4O9/6,5O9/6.笼具为无毒塑料盒,不锈钢丝面罩,体积545×395×2001Tim,每笼5只大鼠.大鼠饮用水为净化水,饲料为无菌块料.1.1.3实验仪器日立7060全自动生化仪(日本制造);MEK-6318K全自动血球计数仪(日本制造);莱卡RM2125石蜡切片机(德国);FRISHER-172自动染色机(美国);SHANDON一2000组织处理机(英国);NIKONFX-35A显微镜(日本制造).1.1.4试剂及溶剂天门冬氨酸氨基转换酶(AST),丙氨酸氨基转换酶(ALT),碱性磷酸酶(ALP),尿素氮(BUN),总蛋白(TP),白蛋白(ALB),血糖(GLU),胆红素(T_BIL),肌酐(CRE),总胆固醇(T_cHO)试剂盒,由北京中生生物高技术公司提供.1.2试验方法1.2.1给供试品途径试验采用腹腔注射给供试品.1.2.2给供试品剂量高剂量组:腹腔注射10mL?kg-;低剂量组:腹腔注射lOmL?kg(高剂量l:l稀释);对照组:腹腔注射等体积生理盐水(10mL?kg).1.2.3试验周期周期l4天.1.2.4试验步骤及观察指标大鼠在实验动物室饲养l周后,按体重随机分为3组,每组lO只,雌,雄各半,分别腹腔注射纤维蛋白胶浸提液10mL?kg-和10mL?kg-(1:l稀释),对照组给予生理盐水,其体积均为10mL?kg体重.给供试品期间密切观察各组动物外观体征,粪便性状,每周称体重1次,根据体重增长调整给供试品量.连续给供试品l4天后,眼眶静脉丛取血,测定血红蛋白浓度(HGB),红细胞数(RBC),血小板数(PLT),白细胞数(WBC),白细胞分类(DC)和凝血时间(cT)等血液学指标;血液经离心分离血清,测定天门冬氨酸氨基转换酶(AST),丙氨酸氨基转换酶(ALT),碱性磷酸酶(AI),尿素氮(BUN),总蛋白(TP),白蛋白(ALB),血糖(GLU),总胆红素(T_BIL),肌酐(CRE),总胆固醇(T—CHO)等血清生化学指标.并于次日处死,系统尸解,称取心,肝,脾,肺,肾,肾上腺,脑,子宫(卵巢),睾丸的重量并计算脏器系数,另取部分组织,肉眼观察后,将上述组织全部放人中性lO9/6甲醛溶液中固定,石蜡切片,HE染色,显微镜下观察各脏器的病理组织学变化.2结果和讨论2.1结果2.1.1一般临床状况给不同剂量的纤维蛋白胶浸提液后,大鼠外观,行为正常,活动自如,毛色光泽,口,耳,鼻,生殖腺和肛门无异常分泌物.2.1.2对体重的影响给不同剂量的纤维蛋白胶浸提液后,体重增加,与对照组大鼠体重的增长相似,无统计学差异.2.1.3对摄食量的影响给不同剂量的纤维蛋白胶浸提液后摄食量的变化与对照组相似,明纤维蛋白胶浸提液对动物的食欲无影响.2.1.4对凝血时间的影响给供试品l4天后,低剂量雄,雌性大鼠的凝血时间与对照组比较有显着性差异.其它指标与对照组比较均无显着性差异.结果见表1.凝血时间的延长可能和纤维蛋白胶产生的纤维蛋白降解产物对凝血因子的抑制作用有关.表1纤维蛋白胶浸提液对大鼠凝血时间的影响凝血时间(秒)组另U——雄大鼠雌大鼠注:1)与对照组比较,P<O.01.2.1.5对血液学指标的影响给供试品l4天后,除低剂量雄性大鼠红细胞压积(HCT)有显着性差异,但均在正常值范围内.高,低剂量雄性大鼠平均红细胞体积(MCV)和平均红细胞浓度(MCH)有显着性差异(对照组测定值大于正常范围).其它指标与对照组比较均无显着性差异,结果见表2.474中国药事2007年第21卷第7期注:1)与对照组比较,P<O.05;2)与对照组比较,P<O.01.2.1.6对血清生化学指标的影响给供试品14天后,除高,低剂量雌雄性大鼠BIL,低剂量雌雄性大鼠AST及低剂量雌性大鼠ALB有显着性差异.高,低剂量雄性大鼠TP和低剂量雌性大鼠TP,GLU及高剂量雌性大鼠ALB,GLU有显着性差异,但均在正常值范围内.其它指标与对照组比较均无显着性差异,结果见表3,7表3纤维蛋白胶浸提液对大鼠转氨酶的影响注:1)与对照组比较,P<O.05.表4纤维蛋白胶浸提液对大鼠尿素氮和肌酐的影响表5纤维蛋白胶浸提液对大鼠总蛋白和白蛋白的影响注:1)与对照组比较,P<O.05;2)与对照组比较,P<O.01.表6纤维蛋白胶浸提液对大鼠胆红素和碱性磷酸酶的影响注:1)与对照组比较,P<O.05;2)与对照组比较,P<O.01.表7纤维蛋白胶浸提液对大鼠总胆固醇和血糖的影响注:1)与对照组比较,P<O.05.中国药事2007年第2l卷第7期4752.1.7对脏器系数的影响给供试品14天后,除高,低剂量雌雄性大鼠脾脏系数与对照组比较有显着差异,其它各脏器系数均在正常值范围内.结果见表8.表8纤维蛋白胶浸提液对大鼠脏器系数的影响注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与对照组比较,P<0.01.2.1.8对病理组织学检查的影响给供试品14天后,肉眼观察脾脏普遍大于对照组.病理组织学检查腹腔各脏器表面浆膜,网膜均可见轻中度炎症.脾肿大,充血及生发中心淋巴细胞增生.肝脏可见灶状小圆细胞浸润,个别动物,C,Pb膜灶状炎细胞浸润,肺间质增宽,淋巴细胞,脑小胶质细胞浸润.两只雄性大鼠睾丸曲细精管堵塞,蓝色物质沉淀.其他脏器未见明显异常.2.2讨论从本试验结果可以看出纤维蛋白胶主要对凝血和脾脏有明显的影响,对其他脏器和系统没有表现出有意义的变化.国外报道_3]用人纤维蛋白原和牛凝血酶组成的纤维蛋白胶在临床使用有引起出血的不良反应,主要机理是人体产生抗牛凝血酶抗体和人凝血酶产生交叉反应,使体内的凝血酶含量降低,导致出血.本研究发现凝血时间延长可能是由于纤维蛋白胶中的纤溶成分导致纤维蛋白降解产生的降解产物对凝血系统的抑制作用.本试验还发现腹腔内有炎症反应,主要可能是注射浸提液刺激有关.脾脏肿大可能和浸提液中的蛋白成分作为异种蛋白刺激免疫系统导致脾脏内淋巴细胞增生,脾脏肿大.在以前的肌肉植入试验(未发表资料)中也发现纤维蛋白胶周围炎症反应虽然不是很明显,但是从细胞的分类可以发现有较多的浆细胞,提示纤维蛋白胶有可能主要通过刺激体液免疫反应,而脾脏也是产生体液免疫的主要器官,可见纤维蛋白胶具有一定的免疫原性和免疫毒性.3结论本实验按照GB/T16886.11(等同ISO1O993.11)规定的方法_4]对纤维蛋白胶浸提液高低剂量连续大鼠腹腔注射给样14天进行了亚急性毒性试验,试验期间大鼠一般状况良好,体重增加.给供试品后,高剂量雄性和低剂量雄,雌性大鼠的凝血时间与对照组比较有显着性差异,凝血时间明显延长.脏器系数高,低剂量雌雄性大鼠脾脏系数与对照组比较有显着性差异.病理组织学检查给予不同剂量浸提液,脾肿大,充血及生发中心淋巴细胞增生,未见其他实质性脏器细胞变性,坏死等与受试动物中毒有关的病变.因此纤维蛋白胶亚急性毒性可能的主要靶器官是凝血系统和免疫系统的脾脏,提示可能有潜在的免疫毒性.参考文献:El-I李洪荣,黄丽杉,李永武,等.医用生物蛋白胶在胸科手术中的应用EJ].中国现代手术学杂志,2001,5(3):214E21陈乾坤,丁嘉安,高文.纤维蛋白胶在胸外科手术中的应用Ij].中国临床医学,2004,11(6):985[3]TomizawaY.Clinicalbenefitsandriskanalysisoftopicalhemostats:areviewEJ].JArtifOrgans,2005,8(3):137[4]ISO:1SO10993.11-2005Biologicalevaluationofmedicaldevices,Part11:Systemictoxicity[J].InternationalStandardOrganization,Geneva,2005