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项目申报书重要人兽共患胞内寄生菌病流行特征及病原致病机制研究

2017-11-14 15页 doc 76KB 13阅读

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项目申报书重要人兽共患胞内寄生菌病流行特征及病原致病机制研究项目申报书重要人兽共患胞内寄生菌病流行特征及病原致病机制研究 项目名称: 重要人兽共患胞内寄生菌病流行特征及 病原致病机制研究 首席科学家: 陈创夫 石河子大学 起止年限: 2010年1月-2014年8月 依托部门: 新疆生产建设兵团科委 教育部 一、研究内容 研究内容 1(布鲁氏菌病、斑点热和无形体病分子流行病学和流行规律研究 三种病原中国流行株病原特征及分子流行病学研究:通过在重点疫源地进行全面系统的流行病学调查~建立我国三种病原菌种资源库~分析我国三种病原流行株的种型特点以及优势株演替和遗传变异规律~确定危...
项目申报书重要人兽共患胞内寄生菌病流行特征及病原致病机制研究
项目申报书重要人兽共患胞内寄生菌病流行特征及病原致病机制研究 项目名称: 重要人兽共患胞内寄生菌病流行特征及 病原致病机制研究 首席科学家: 陈创夫 石河子大学 起止年限: 2010年1月-2014年8月 依托部门: 新疆生产建设兵团科委 教育部 一、研究内容 研究内容 1(布鲁氏菌病、斑点热和无形体病分子流行病学和流行规律研究 三种病原中国流行株病原特征及分子流行病学研究:通过在重点疫源地进行全面系统的流行病学调查~建立我国三种病原菌种资源库~分析我国三种病原流行株的种型特点以及优势株演替和遗传变异规律~确定危险媒介和宿主动物及其在疾病传播中的作用。 2(布鲁氏菌、斑点热立克次体、无形体侵染和胞内寄生机制的研究 (1) 三种病原基因组学和蛋白组学研究:通过基因组学、蛋白组学、转座子突变等功能基因组学技术研究布鲁氏菌标准菌株、疫苗株和我国流行株,牛种、羊种、绵羊种布鲁氏菌019株,~筛选影响布鲁氏菌毒力和致病性的主要基因及相关外膜蛋白~鉴定其生物学功能,研究布鲁氏菌在宿主细胞内、外生长时菌体基因及蛋白表达谱的变化~并揭示差异表达蛋白的生物学功能,通过对我国斑点热立克次体代表株与国外斑点热立克次体比较基因组学和蛋白组学研究~发现我国斑点热立克次体的主要毒力基因及相关蛋白~明确其生物学功能,通过对我国无形体流行株的基因组学研究~分析我国无形体流行株的遗传学特征~明确其与世界各地流行株的差异。 (2) 布鲁氏菌侵染巨噬细胞、上皮细胞及其胞内寄生机制研究:通过酵母双杂交、免疫共沉淀、噬菌体展示、siRNA等技术筛选布鲁氏菌侵染巨噬细胞、上皮细胞过程中的宿主因子和相关蛋白~确定其生物学功能,研究布鲁氏菌的调控基因及效应分子干扰布氏小体与溶酶体融合以及抑制宿主细胞凋亡的分子作用机制, (3) 斑点热立克次体与血管内皮细胞相互作用机制研究:通过蛋白双向电泳、基质辅助激光解析/电离串联飞行时间质谱分析等发现斑点热立克次体与血管内皮细胞之间发生特异性相互作用的分子~明确其毒力相关分子在致病中所起的作用。 (4) 无形体侵染粒细胞分子机制研究:通过酵母双杂交和免疫共沉淀技术筛选无形体与粒细胞之间发生特异性相互作用的关键分子~确定其在病原体侵染宿主细胞过程中的作用。 3(布鲁氏菌、斑点热立克次体免疫的分子机制研究 (1) 布鲁氏菌主要保护性抗原及其表位研究:利用体外抗原诱导表达、ELISPOT和Tetramer等研究技术~筛选布鲁氏菌主要保护性抗原及其T、B细胞抗原表位。 (2) 布鲁氏菌主要保护性抗原表位与宿主MHC分子相互作用研究:利用基因芯片和蛋白芯片技术筛选与布鲁氏菌主要保护性抗原蛋白递呈相关的宿主MHC分子种类~研究其结构特征和表达的时空变化~揭示宿主MHC对布鲁氏菌主要保护性抗原的限制、表达、处理和提呈的影响。 (3) 布鲁氏菌免疫逃避的分子机制研究:通过FACS、ELISA、ELISPOT、免疫细胞和/或分子缺陷动物验证技术等~研究Breg、Treg在布鲁氏菌感染免疫过程中作用的分子机制~阐明布鲁氏菌感染免疫应答及免疫逃避的分子机制。 (4) 斑点热立克次体免疫的分子机制研究:通过对我国斑点热立克次体与免疫应答启动细胞—树突状细胞之间~激活树突状细胞与T淋巴细胞之间的的相互作用研究~发现斑点热立克次体与宿主免疫细胞之间相互作用的分子~揭示斑点热立克次体诱导免疫应答的分子机制。 二、预期目标 ,一,总体目标 掌握我国布鲁氏菌病、斑点热和无形体病的流行特征和规律~阐明三种病原致病的分子机制~取得一批在国际上具有重要影响的研究成果~提高我国在三种传染病防控基础研究领域的国际地位~为国家在疫病防控和公共卫生安全等方面提供科学技术储备及咨询服务。培养一批在人兽共患胞内寄生菌病研究领域的专业拔尖人才。 ,二,五年预期目标 1(深入认识我国布鲁氏菌病、斑点热和无形体病的流行特征和规律~完成我国三种传染病的分子流行病学调查报告~为疫病防控提供科学决策依据。 2. 建立我国三种病原的菌种资源库和三种传染病的流行病学数据库,建立三种病原流行株遗传信息库。 3. 发现三种病原中国流行株新的毒力基因并阐明其生物学功能~揭示三种病原侵染、胞内寄生、致病和免疫的分子机制~为研发新型疫苗、诊断试剂和筛选药物作用候选靶位基因奠定坚实的理论基础。 4. 培育具有我国优势特色的三种传染病创新研究团队2~3个~培养在国内外相关研究领域有一定影响力的学术带头人3~5名~培养博士研究生25名和硕士研究生60名。 5. 完成高水平SCI收录研究论文60篇以上。 三、研究 ,一, 学术思路 围绕严重危害人民生命健康和畜牧业经济发展重要人兽共患传染病的防控~保障公共卫生及生物安全这一国家重大需求~重点解决疫病流行规律和病原致病分子机制两个关键科学问。从病原特征及分子流行病学、病原生态学两个方面研究三种传染病的流行规律,从病原基因组与蛋白组、胞内寄生机制、免疫分子机制三个方面研究三种病原的致病分子机制,图1,~为开展疫病防控、新型药物、诊断试剂和疫苗研发奠定坚实科学基础。 图1 项目学术思路 ,二, 技术途径 本项目拟通过以下技术途径来实现预定的目标~具体如图2: 图2 项目技术路线 ,三, 创新性 1(通过对我国各个地区全面系统的流行病学调查~首次提供三种传染病在全国范围内的流行病学本底资料~建立三种胞内寄生菌的菌种资源库~构建三种传染病流行病学数据库。 2(对致病性发生改变的中国流行株进行基因组测序与注释、比较基因组学和蛋白表达谱分析研究~揭示其特有的分子特征、新的毒力基因和遗传变异规律~建立三种病原流行株的遗传变异信息库。 3. 从分子、细胞、机体水平研究三种病原中国流行株与宿主相互作用关系~全面、系统、深入地揭示中国流行株侵染、胞内寄生及免疫逃逸的分子机制。 ,四, 与国外同类研究相比的特色 1(三种传染病在我国的分布范围广~危害严重。我国的生态环境复杂多样~自然疫源地生态环境和地理景观因素差异很大~有十分丰富的资源。采用流行病学与生态学相结合、现场与实验室相配合、病原学和分子生物学技术相补充的方法~研究生态环境多样性与疫病发生发展之间的相互关系~为三种传染病流行病学数据库的建立提供了丰富的数据资源。 2. 布鲁氏菌在我国长期流行~自1953以来积累了来源于我国不同地域、不同年份的布鲁氏菌株2400多株~菌种资源丰富~这为分析布鲁氏菌的遗传多样性、分子流行病学规律提供了有利的研究条件。 3(本课题组分离的布鲁氏菌绵羊种019株~生物学特征独特~能感染恒河猴~提示该分离株对人有潜在的感染性~这与国际公认绵羊种布鲁氏菌不感染人的特性明显不同。序列分析发现~019株Omp25、Omp2a、omp2b、omp31、virB10等基因与国际标准株63/290相应基因相比存在明显的差异。弄清这种差异的生物学意义将有利于阐明布鲁氏菌绵羊种019株跨宿主感染的分子机制。 4(黑龙江立克次体为我国1983年从黑龙江绥芬河分离的一个斑点热立克次体新种~为远东斑点热的病原体~其致病性与西伯利亚立克次体标准株存在差异。因此~对黑龙江立克次体流行株的基因组和蛋白质组进行研究~发现其独特的分子特征~为进一步揭示其致病性改变的机制奠定基础。 5. 2006年我国首次报告确诊的人粒细胞无形体感染病例~其中1人感染者死亡~而且首次发现人粒细胞无形体病可以在人与人之间相互传播。这中国无形体流行株临床表现为重病型~而且其传播途径也发生了改变~这可能与病原体毒力变异有关。因此~在国内建立无形体培养方法~分离我国不同地区人及动物宿主无形体本土分离株~填补我国分离株菌种资源的空白,研究分析我国无形体病原分离株分子遗传学特征~阐明我国无形体病的致病机理具有重要意义。 6. 本项目组在国际上首先构建了绵羊基因组MHC区段高密度物理图谱并对该区段近250万碱基进行了基因测序和注释~该研究成果将有利于揭示布鲁氏菌感染绵羊前后MHC表达谱的变化与病原特异性抗原递呈的关系。 ,五,取得重大突破的可行性分析 1(具有丰富的资源优势 迄今为止~已分离鉴定了来源于全国不同地域、不同年份的布鲁氏菌菌株共计2400多株~病原所处的生态环境比较清楚,另外~我国目前正处于经济建设全面发展阶段~自然资源的大量开发和生态环境建设~势必会对当地的自然生态环境和景观产生影响~形成了次生和原始生态系统并存的格局~为开展相关研究提供了多样、可比的研究现场。因此~我们的研究与国际同行相比~具有明显的资源优势。 2(良好的前期研究基础 项目组成员在布鲁氏菌病、斑点热和无形体病的流行病学、致病机制方面做了大量的研究工作~已在《JAMA》、《Emerging Infectious Disease》、《PLoS ONE》、《Journal of Clinical Microbiology》、《American Journal of Tropical Medicine and Hygien》、《BMC Infectious Diseases》、《BMC Microbiology》、《Journal of Medical Virology》等权威期刊上发表了一系列的论文。 3(成熟的技术平台 项目参加单位拥有传染病预防控制国家重点实验室、病原微生物和公共卫生安全国家重点实验室、家畜疫病病原生物学国家重点实验室、农业生物技术国家重点实验室、农业微生物学国家重点实验室、新疆地方与民族高发病教育部重点实验室、上海国家动物医学研究中心~构成了完善的流行病学调查和感染与免疫 研究平台~包括微生物基因组学研究平台、功能基因组研究平台、功能蛋白组学研究平台、生物信息学和数据库的研发平台以及生物芯片研发平台。 4(具有优势互补的研究队伍 参加本项目的人员主要来自石河子大学、军事医学科学院微生物流行病研究所、中国疾病预防控制中心传染病控制所、中国农业大学、南方医科大学、华中农业大学、中国农业科学院兰州兽医研究所、中国农业科学院上海兽医研究所8个科研院所。学术带头人和学术骨干来自医学、兽医学的相关研究领域~在人兽共患病流行病学、病原微生物学、基因组学、免疫学等领域~优势互补~研究实力雄厚。 四、年度 2010年1月至2010年12月 (1) 选择代表性样区~进行现场调查和动物宿主和媒介标本的采集~对其进行多种病原体的~并进一步进行分型鉴定和变异分析。完成本年度3个代表性样区的调查和标本检测,完善病原体变异分析。 (2) 标准菌株转座子突变文库构建和突变株毒力表型筛选及鉴定,标准株衍生具有致病表型菌株转座子突变文库构建和致病性表型筛选,羊布鲁氏菌外膜相关蛋白原核表达载体构建及诱导表达,羊布鲁氏菌标准株)流行株间差异表达的鉴定,人工培养条件下牛布鲁氏菌标准株及其衍生的VirB基因缺失株间差异表达蛋白的鉴定。完成羊种布鲁氏菌转座子突变文库毒力表型筛选)插入位点序列测定和实验动物体内的毒力测定,完成羊种布鲁氏菌标准株衍生具有致病性表型菌株的转座子突变文库致病性表型筛选和插入位点序列测定,完成羊布鲁氏菌外膜相关蛋白原核表达载体构建及诱导表达)鉴定,利用绵羊布鲁氏菌标准株)流行株初步鉴定二者间差异表达蛋白,完成人工培养条件下牛布鲁氏菌标准株及其衍生的VirB基因缺失株间差异表达蛋白的鉴定。 (3) 布鲁氏菌侵染过程中细菌外膜蛋白和侵染细胞膜蛋白相互作用的筛选研究:采用同位素掺入方法~对布鲁氏菌蛋白进行标记~提取带有标记的布鲁氏菌外膜蛋白~采用布鲁氏菌侵染巨噬细胞、上皮细胞~提取细胞膜蛋白~进行双向电泳~转膜后与同位素标记的布鲁氏菌外膜蛋白进行杂交试验~对相互作用的蛋白进行质谱分析,布鲁氏菌在胞内转运过程中细胞特异表达蛋白的筛选研究:采用布鲁氏菌侵染巨噬细胞、上皮细胞~应用同位素分子标记方法~筛选布鲁氏菌侵染细胞后特异表达的基因~进行生物信息学分析,设计Q-RT-PCR凋亡因子基因的特异引物~建立对Bad、Bid 、Bax~Bcl-2、 Bcl-x、Bcl-w 等细胞凋亡因子的检测方法, (4) 建立T、B细胞表位测定技术平台,重组布鲁氏菌弱毒菌菌株M5-90、bp26和omp31蛋白,M5-90、bp26和omp31蛋白免疫绵羊,合成bp26和omp31蛋白重叠多肽,制备免疫绵羊PBMC和血清样品。建立成熟的布鲁氏菌T、B细胞表位测定技术平台,完成多肽合成,完成重组蛋白表达与纯化,建立免疫羊实验组与对照 组。 (5) 进行我国斑点热立克次体基因组研究:完成黑龙江立克次体全基因组测序~绘制它的全基因组完成图,将其与其它立克次体的全基因组序列进行比较分析~发现黑龙江立克次体的基因组特征。进行我国斑点热立克次体功能基因组的研究:克隆斑点热立克次体编码蛋白基因~构建一张斑点热立克次体编码蛋白基因芯片~建立分析立克次体功能基因组的工作平台。 (6) 进行无形体血清学和病原学调查~锁定疫区~建立无形体分离技术~分离并鉴定中国本土人粒细胞无形体及动物分离株~初步研究其生物学特征。 (7) 发表SCI收录论文10篇~培养博士研究生5名和硕士研究生12名。 2011年1月至2011年12月 (1) 进行代表性样区的现场调查和病原体检测及变异分析~进行主要宿主动物线粒体b基因和组织相容性复合体,MHC,遗传多态性研究~进行优势宿主、媒介的遗传多态性与所携带病原体变异关系的关联分析。完成5个代表性样区德调查和标本检测~完成5种宿主动物遗传多态性与所携带病原体变异关系的关联分析。 (2) 构建毒力相关基因缺失菌株及其互补菌株,初步鉴定致病性表型突变菌株致病性表型,布鲁氏菌功能性外膜相关蛋白的初步筛选,牛种和羊种布鲁氏菌标准株)流行株及疫苗株间差异表达蛋白的鉴定,细胞感染状态下牛布鲁氏菌标准株及其衍生的VirB基因缺失株间差异表达蛋白的鉴定,完成毒力相关基因在牛种菌和羊种菌中缺失株和互补菌株构建。完成转座子插入突变株致病性表型的动物试验初步确认,完成感染动物体内布鲁氏菌优势抗原蛋白筛选,通过免疫动物检测初步筛选变态反应蛋白种类,通过共感染试验探讨影响布鲁氏菌侵入的膜相关蛋白存在状况,分别利用牛种菌和羊种菌~完成布鲁氏菌标准株)流行株和疫苗株间差异表达蛋白初步鉴定,完成绵羊种菌差异表达蛋白测序,完成细胞感染状态下牛布鲁氏菌标准株及其衍生的VirB基因缺失株间差异表达蛋白的鉴定。完成人工培养状态下差异表达蛋白测序。 (3) 布鲁氏菌侵染过程中细菌外膜蛋白和侵染细胞膜蛋白相互作用的鉴定研究:建立布鲁氏菌侵染巨噬细胞、上皮细胞cDNA文库~采用酵母双杂交、生物 信息学方法对筛选的与布鲁氏菌外膜蛋白互作的细胞膜蛋白结果进行验证与分析,与布鲁氏菌VirB、BvrS/BvrR调控相关蛋白的筛选研究:构建布鲁氏菌VirB、BvrS/BvrR基因的重组载体~基因重组的方法将布鲁氏菌的特异表达基因进行敲除~筛选并鉴定布鲁氏菌VirB、BvrS/BvrR基因缺失株~对野毒株、缺失株进行比较蛋白组学分析~进行生物信息学分析,与野毒株和VirB、BvrS/BvrR基因缺失株进行比较蛋白组学分析结果进行比较分析~获得差异表达蛋白基因,布鲁氏菌侵染巨噬细胞、上皮细胞前后细胞基因表达谱差异研究:采用基因芯片技术研究布鲁氏菌侵染巨噬细胞、上皮细胞前后细胞基因表达谱~获得差异表达蛋白~采用RNA干扰技术筛选并验证与细胞凋亡相关的差异表达蛋白, (4) 测定免疫羊细胞与体液免疫反应水平,筛选bp26和omp31抗原T与B淋巴细胞表位。完成实验T、B细胞免疫反应水平测定,完成T、B细胞抗原表位筛选。 (5) 进行我国斑点热立克次体功能基因组的研究:用斑点热立克次体编码蛋白基因芯片分析国内外斑点热立克次体菌株的全基因DNA~分析它们之间功能基因组的差异~发现我国斑点热立克次体功能基因组特征。进行我国斑点热立克次体全蛋白质组和免疫组的研究:完成黑龙江立克次体全蛋白质组和免疫蛋白质组图谱~将其与其它立克次体蛋白质组和免疫蛋白组进行比较~发现黑龙江立克次体的蛋白质组特征和蛋白抗原特征。 (6) 分离并鉴定中国不同地域人粒细胞无形体及动物流行株~进一步研究其分子遗传变异特征。 (7) 发表SCI收录论文10篇~培养博士研究生5名和硕士研究生12名。 2012年1月至2012年12月 (1) 进行代表性样区的现场调查和病原体检测及变异分析~进行媒介、宿主和病原体的遗传多态性和进化关系研究~综合比较分析病原体多样性与优势媒介、宿主种间、种群间以及种群内遗传多态性相关性。完成5个代表性样区的调查和标本检测~完成部分媒介、宿主和病原体的进化关系研究。 (2) 确定不同毒力相关基因对布鲁氏菌毒力和生物学特性的影响,构建牛种菌和羊种菌致病性相关基因缺失菌株及其互补菌株,羊布鲁氏菌外膜相关蛋白的功能鉴定,不同菌株间差异表达蛋白测序和基因表达鉴定,细胞感染状态下差异 表达蛋白基因鉴定和表达。完成动物试验以观察不同毒力基因缺失株在体内、外对牛种菌和羊种菌毒力的影响,初步研究缺失株的生物学特性。完成致病相关基因在牛种菌和羊种菌中缺失株和互补菌株构建,完成免疫动物针对优势抗原蛋白的免疫学反应及其消长检测,完成变态反应蛋白对细胞病理学影响的检测,在促进布鲁氏菌侵入的蛋白检测阳性时~完成该蛋白对应的宿主细胞受体检测,完成牛种菌和羊种菌不同菌株间差异表达蛋白测序和相关基因表达载体构建、诱导表达,完成细胞感染状态下布鲁氏菌差异表达蛋白测序和相关基因表达载体构建、诱导表达。 (3) 布鲁氏菌特定外膜蛋白在侵染过程中的功能研究:构建含有筛选出的布鲁氏菌外膜蛋白基因的重组载体~基因重组的方法将布鲁氏菌的特异表达基因进行敲除~筛选并鉴定布鲁氏菌特异表达基因缺失株~分别用野毒株和缺失株侵染巨噬细胞、上皮细胞~通过检测胞内布鲁氏菌的数量研究布鲁氏菌外膜蛋白的功能,构建布鲁氏菌VirB、BvrS/BvrR基因缺失株:构建含有特异表达基因缺失的重组载体~基因重组的方法将布鲁氏菌的特异表达基因进行敲除~筛选并鉴定布鲁氏菌特异表达基因缺失株,筛选巨噬细胞、上皮细胞与凋亡相关的关键分子:分别采用布鲁氏菌差异表达蛋白基因缺失株、野毒株侵染巨噬细胞、上皮细胞~进行细胞形态学动态观察~并检测Bad、Bid 、Bax~Bcl-2、 Bcl-x、Bcl-w 等细胞凋亡因子的表达变化~确定布鲁氏菌在巨噬细胞、上皮细胞内抑制宿主细胞凋亡的关键分子。 (4) 筛选与布鲁氏菌主要保护性抗原蛋白递呈相关的宿主MHC分子种类~研究其结构特征和表达的时空变化,研究绵羊MHCI/II分子对布鲁氏菌bp26和omp31主要保护性抗原分子的提呈和识别,T、B细胞抗原表位鉴定。完成M5-90、bp26和omp31蛋白抗原表位的绵羊MHC限制性图谱的绘制, 揭示宿主MHC对布鲁氏菌主要保护性抗原的限制、表达、处理和提呈的影响,完成T、B细胞抗原表位鉴定。 (5) 进行我国斑点热立克次体与血管内皮细胞相互作用的研究:采用蛋白质组学方法分析黑龙江立克次体与血管内皮细胞结合蛋白以及在宿主细胞内表达蛋白~通过生物信息学分析这些蛋白的性质及功能~发现黑龙江立克次体与宿主细胞相互作用的蛋白分子~揭示其致病的分子机制。 (6) 对我国人和动物无形体分离株进行基因组测序~绘制其全基因组图谱~ 将其与无形体国外分离株全基因组进行比较分析~阐明中国流行株基因组特征。 (7) 发表SCI收录论文10篇~培养博士研究生5名和硕士研究生12名。 2013年1月至2013年12月 (1) 进行代表性样区的现场调查和病原体检测及变异分析~进行媒介、宿主和病原体的遗传多态性和进化关系研究~综合比较分析病原体多样性与优势媒介、宿主种间、种群间以及种群内遗传多态性相关性。完成5个代表性样区的调查和标本检测阐明不同疫源地三种病原主要流行株~基本建立我国三种病原菌株资源库。 (2) 进一步探讨毒力相关基因缺失株的生物学特性,探讨不同致病性基因对牛种菌和羊种菌致病性的影响程度,探讨羊布鲁氏菌变态反应原蛋白对细胞免疫反应的影响,不同菌株间比较获得的毒力相关基因和保护性抗原基因检测及其缺失株和互补菌株构建,不同生长环境下比较获得的毒力相关基因和保护性抗原基因检测及其缺失株和互补菌株构建,进一步试验检测不同毒力基因缺失菌株毒力、致病性以及相应基因在布鲁氏菌感染中的作用。完成不同致病性基因对牛种菌和羊种菌致病性影响的检测,完成布鲁氏菌变态反应原蛋白对细胞免疫反应影响的检测,完成保护性抗原基因筛选和蛋白质组学方法获得的毒力相关基因及保护性抗原基因缺失株与互补菌株构建,完成人工培养和细胞感染田间下获得的毒力相关基因及保护性抗原基因缺失株与互补菌株构建。 (3) 宿主细胞特定膜蛋白在布鲁氏菌侵染过程中的功能研究:蛋白或转录水平研究布鲁氏菌采用单克隆抗体或RNA干扰技术将巨噬细胞、上皮细胞的膜蛋白封闭或沉默~采用野毒株进行侵染巨噬细胞、上皮细胞试验~通过检测胞内布鲁氏菌的数量研究巨噬细胞、上皮细胞膜蛋白的生物学功能,与布氏小体-溶酶体不融合相关的布鲁氏菌效应分子功能研究:采用布鲁氏菌野毒株、特异表达基因缺失株侵染巨噬细胞、上皮细胞~用荧光抗体标记细胞的溶酶体、布氏小体、内质网等细胞器~验证布鲁氏菌在胞内运输、繁殖过程中特异表达基因的功能, 布鲁氏菌抑制细胞凋亡关键因子的生物学功能研究:将获得的布鲁氏菌特异表达蛋白进行标记~点硝酸纤维素膜,将基因芯片获得的细胞差异表达蛋白进行杂交~获得互作蛋白~分析布鲁氏菌抑制凋亡的分子机制。 (4) T、B细胞抗原表位与宿主MHC相互关系分析,T、B细胞保护性抗原表位限制关系。揭示T、B细胞抗原表位与宿主MHC相关性,绘制T、B细胞保护性抗原表位MHC限制图谱。 (5) 进行我国斑点热立克次体与树突状细胞相互作用的研究:将斑点热立克次体重组蛋白抗原刺激成熟前树突状细胞~用流式细胞仪分析刺激后树突状细胞的表型和ELISA法检测细胞因子表达~发现具有激活树突状细胞能力的潜在立克次体保护性抗原。进行斑点热立克次体抗原激活树突状细胞与T淋巴细胞相互作用的研究:将不同抗原刺激成熟的树突状细胞分别与T淋巴细胞相互作用~用流式细胞仪分析淋巴细胞相关细胞因子的表达~以及用ELISA法检测培养液中相关细胞因子水平~揭示立克次体保护性抗原诱导特异性免疫应答的分子机制。 (6) 对我国人和动物无形体分离株进行致病机理初步研究~研究无形体与宿主细胞相互作用~初步阐明我国人和动物无形体致病机制。 (7) 发表SCI收录论文10篇~培养博士研究生5名和硕士研究生12名。 2014年1月至2014年8月 (1) 进行代表性样区的现场补充调查,我国三种病原菌种资源库的建立,整合多种信息的三种传染病流行病学数据库的建立,病原基因型分布与疫病发生的关系分析。掌握我国重要疫区内动物与人群中三种传染病的流行、特征和规律,阐明不同疫源地三种病原主要流行株~建立我国三种病原菌种资源库。阐明病原基因型分布与疫病发生的关系~建立整合多种信息的三种传染病流行病学数据库。 (2) 明确不同毒力相关基因对布鲁氏菌生物学特性和感染及维持的影响,探讨不同致病性相关基因对布鲁氏菌生物学特性和致病作用的影响,探讨布鲁氏菌变态反应原蛋白的分子作用机制,蛋白质组学途径毒力相关基因和保护性抗原基因的功能验证。完成体外和小鼠体内的毒力基因互补试验及其相关指标检测~确定相关基因在布鲁氏菌生物学特性、感染及维持过程中的作用,完成体外和小鼠体内检测确定相应基因缺失的突变株生物学特性和致病性作用,完成免疫相关通路关键信号分子的检测~通过比较试验探讨相关蛋白诱导变态反应的机制,完成经蛋白组学获得基因的验证~并通过基因互补试验进行确认。 (3) 应用已经建立的布鲁氏菌强、弱毒株感染小鼠模型~分析比较Breg、Treg、CD4+、CD8+、IL-6、IFN-r在布鲁氏菌感染过程中的动态变化~揭示造成布鲁氏菌致病的关键免疫细胞和分子~阐明Breg、Treg在致病过程中的作用和机制。 (4) 补充完善项目各课题相关实验~汇总课题~完成研究报告和研究论文的撰写。 (5) 发表SCI收录论文10篇~培养博士研究生5名和硕士研究生12名。
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