鲫鱼肝胰脏中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的分离纯化及性质的研究（可编辑）

鲫鱼肝胰脏中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的分离纯化及性质的研究（可编辑） 囊萎大学 硕士学位论文 鲫鱼肝胰脏中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的 分离纯化及性质研究学科门类: 工堂 作者姓名: 杨锋 指导教师: 菱塞金塾援 直筮盔塾援 专业名称: 食品科学 学位授予单位: 集差太学 论文答辩日期: 窆生鱼旦曼垒旦学术诚信声明 兹呈交的学位论文,是本人在导师指导下独立进行的研究工作及 取 得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不 包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承 担由此 论文产生的权利和责任。 声明人签名:哥切钎 时间刁年占冈目. 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作者签名: 导师签名: 杨遂、 时间:洲屏鲫鱼肝胰脏中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的 分离纯化及性质研究 摘 要 ...是丝 胰蛋白酶, ...和胰凝乳蛋白酶, ‘氨酸蛋白酶家族中的主要水解酶,也是肽链内切酶。胰蛋白酶专一裂解碱性氨基酸残基 ,羧基侧链的肽键;而胰凝乳蛋白酶则专一水解、和等疏水氨基酸 残基羧基侧链的肽键。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶不但在鱼体内起着重要的生理功能,而且 在低温下具有较高的酶活性,是具有潜在重要应用价值的工具酶。目前,国内外关于鱼类 胰蛋白酶的研究较多,但对胰凝乳蛋白酶的研究却很少。本课题首次以淡水鲫鱼为研究对 象,对其肝胰脏中胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶进行了分离纯化,研究其酶学性质,并制备了 抗胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶多克隆抗体,为今后研究淡水鱼胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的生 理功能以及这类酶在生物、医药以及食品加工中的应用提供了理论基础。 本课题分离纯化胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的方法包括硫酸铵分级盐析、 .阴离子交换层析、 .凝胶过滤层析、.阳离子交 换层析和.疏水层析等。本研究得到了两种类型的胰凝乳蛋白酶阴离子 和一种阴离子 型胰凝乳蛋白酶和阳离子型胰凝乳蛋白酶 型胰蛋白酶。 ?和结果表明 、 和都得 、 和的分子量分别 到了高度纯化。.显示 、 为 、 和 。以..?为底物, 的最适温度分别为和 .;当 ,最适值分别为 .和 .。 水解底物..时,的最适温度和最适值分别是和 、 和在。以下稳定性较好,值的耐受范围 为.至.。丝氨酸类蛋白酶抑制剂对、 和产生 强烈抑制,并且两种酶的抑制效果相似。底物特异性实验表明, 该酶对荧光底物 、 和可被 ???的分解能力最强。 和矿离子激活,而被、、、:、和离子在一定程度上抑 制。动力学实验表明,以?为底物,、 的‰值分别为.和. /,所对应的‰值分别为.和. ‘;而的‰ 和 值和‰值分别为. /和. ~。免疫印迹实验表明, 可以与抗鲫鱼 抗体呈阳性反应;可与抗鲤鱼 抗体呈阳性反应。 关键词:胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,鲫鱼,纯化,免疫印迹,同源性, 性质研究 \ .. .. . . .. , ..,. , 舶 .丘 , . ?, 凡? ?.., . ,, . . . 一 ?? .,. ... . ,,,,.. 墨砒 .‰ / . . ? ?嬲, . . .‰‰, ? .? 也八 .. : ,,,, 录 目 第一章引言??. .鲫鱼简介..: .胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶研究现状?.. ..胰凝乳蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶?. ..胰凝乳蛋白酶分离纯化?. ..胰蛋白酶原和胰蛋白酶??. ..胰蛋白酶分离纯化 .胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶应用的研究.. .本课题研究的内容与意义??.. 第二章材料与方法 .材料? ..实验用鱼? ..试剂? ..实验所用溶液及其制备?. ..实验所用仪器 .方:法. ..蛋白酶活性的测定??.. ..蛋白酶浓度的测定 .. ?、?及..提取纯化?一 ..性质.. 第三章结果与讨论??.: .鲫鱼胰凝乳蛋白酶的纯化及性质研究 ..鲫鱼胰凝乳蛋白酶的纯化 硫酸铵分级范围确定?. 胰凝乳蛋白酶的柱层析分离?. ...胰凝乳蛋白酶的性质研究一 电泳和酶谱分析? 抑制剂对胰凝乳蛋白酶的作用.. ?金属离子对胰蛋白酶活性的影响 鲫鱼胰凝乳蛋白酶的温度范围和温度稳定性? 鲫鱼胰凝乳蛋白酶的范围和稳定性?一 鲫鱼胰凝乳蛋白酶的动力学参数 鲫鱼胰凝乳蛋白酶的免疫印迹反应.鲫鱼胰蛋白酶的纯化及性质 研究 ..鲫鱼胰蛋白酶的纯化 ..胰蛋白酶的性质研究??.. 电泳和酶谱分析? 蛋白酶抑制剂及底物特异性作用 金属离子对胰蛋白酶活性的影响 鲫鱼胰蛋白酶的温度范围和温度稳定性 鲫鱼胰蛋白酶的范围和稳定性. 鲫鱼胰蛋白酶的动力学参数鲫鱼胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶抗体 的制备及其免疫交叉反应?。 第四章讨论与展望??. 定谢??..? 参考文献? 在学期间发表的学术论文 主要缩略语及中英文对照表 缩写 全称英文 全称中文 .匝 .疏基乙醇 过硫酸铵 二氨基联苯胺 ,毛二硫苏糖醇 反式环琥珀酸.亮氨 .“ 酰氨.胍基丁酮 乙二胺四乙酸 甘氨酸冲 辣根过氧化物酶苯甲基磺酞氟 十二烷基硫磺酸钠 圮 匝 四甲基乙二胺 ,’’ 翮三氯乙酸 牛血清白蛋白 第一章引言 蛋白酶在食品工业中发挥着越来越重要的作用。商业化蛋白酶主要来源于动物、植物 及微生物,但来源于海洋及其它水产动物的蛋白酶并没有得到广泛的应用【】。 年,我国水产品总产量达,万【】。每年水产品加工保鲜过程中产生的下脚 料废弃物万年以上【】,占整个鱼下脚料%以上的内脏作为蛋白酶资源 无论在基础研究还是商业化应用都具有重要意义【】。然而水产加工工程中产生的下脚料一 般是作为低利用价值的饲料和肥料【】或者直接丢弃导致环境污染。因此,将水产品加工下 脚料转变成高利用价值的生物工具酶或生化试剂是提高其利用价值和解决环境污染的有 效手段。 另一方面,由于鱼类是浮游动物,它们的生存需要体内的消化酶随其生存环境改变而 变化,因此,来源于变温动物鱼类的消化酶活性要比来源于哺乳动物的甜锚】。鱼类胰脏含 有胰蛋白酶 ...和胰凝乳蛋白酶 ...等,这些酶可以广泛应用于食 品加工生产过程【】;同时二者在生物、医学方面也有广泛应用【。。因此,从鱼下脚料中 获取具有高利用价值的工具酶和生化制剂越来越有研究利用价值。 在鱼内脏的许多蛋白水解酶中,来自胰腺中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶是起消化作用 的主要蛋白酶,它们在蛋白质的分解和生物生命活动中扮演重要的角色。本文以我国淡水 水域广泛分布且产量较大的鲫鱼为研究对象,对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶进行了分离纯化 并对其性质作了较为详细的分析。 .鲫鱼简介 鲫鱼 ,图.属鲤形目、鲤科、鲫属的一种。身体似鲤,但体较 扁而高;头小,眼大,无须;下咽齿一行,侧扁;背鳍基部较长,背鳍、臀鳍均具有带锯 齿的粗状硬刺。鲫鱼在中国除青藏高原外各地各种水域皆产。地方名有:鲫瓜子、鲋鱼、 鲫拐子、朝鱼、刀子鱼、鲫壳子。鲫鱼对生态环境具有很强的适应能力,能耐低氧耐寒, 。 不论浅水、深水、流水、静水、清水、浊水甚至污水都能适应生长【 鲫鱼又是杂食性鱼类,它们的食谱极为广、杂,其动物性食物以枝角类、桡足类、苔 藓虫、轮虫、淡水壳菜、蚬、摇蚊幼虫以及虾等为主;植物性食物则以植物的碎屑为最主 要,常见的还有硅藻类、丝状藻类、水草等。 鲫鱼不仅味道鲜美,营养丰富,而且具有食疗保健等功能。《本草纲目》载:“合小豆 煮汁服,消水肿:炙油涂,主妇人阴疳诸疮,杀虫止痛;酿五倍子煅研,治下血;酿茗叶 煨服,治消渴;酿胡蒜煨研饮服,治膈气。鲫鱼肉肥籽多,味尤鲜美,故民间有“冬鲫 夏鲇之说。我国古医籍《本草经疏》也对鲫鱼有极高评价:“诸鱼中惟此可常食。图一鲫鱼 . 鲫鱼所含的蛋白质品质优良、必需氨基酸齐全、易于消化吸收, 是肝肾疾病,心脑血 管疾病患者的良好蛋白质来源,常食可增强抗病能力。此外,鲫鱼也被认为有健脾利湿, 和中开胃,活血通络、温中下气之功效,对脾胃虚弱、水肿、溃疡、气管炎、哮喘、糖尿 病有很好的滋补食疗作用。 鲫鱼的肝胰脏图.为弥散型,暗红色,从胸腹腔横膈膜稍后起,分散在肠道的 外表面。 图.鲫鱼内脏 ...胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶研究现状 ..胰凝乳蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶 胰凝乳蛋白酶原为胰凝乳蛋白酶的前体物质。哺乳动物牛胰凝乳 蛋白酶原是由个氨基酸残基组成的,具有对二硫键的单肽链蛋 白质,当受到胰蛋白酶作用后,和间的肽链断开,才具有酶活性,这种酶称为. 胰凝乳蛋白酶。.胰凝乳蛋白酶的活性最高,但不稳定。它再作用于其它的.胰凝乳蛋白 酶分子上,使另一个.胰凝乳蛋白酶失去两个二肽及,而形成酶的稳 定形式.胰凝乳蛋白酶。它是由条肽链组成,、两条链及、两链间各通过一 对二硫键相连,.胰凝乳蛋白酶的活性只有.胰凝乳蛋白酶的%,酶活性部位的氨基酸 残基、和分别来自、二肽链【刀。其酶原激活过程如下图. 所示。 :霉膏 .?啊.嚣口?‘,, ‘、.?参 . 图胰凝乳蛋白酶原的激活 . 胰凝乳蛋白酶或?又称一糜蛋白酶、胰乳酶,在胰脏 中以酶前体物质胰凝乳蛋白酶原的形态生物合成,随胰液分泌出去。在小肠受到胰蛋白酶 和胰凝乳蛋白酶的分解作用,转变成活性的胰凝乳蛋白酶。胰凝乳蛋白酶属于肽链内切酶, 主要切断多肽链中的芳香族氨基酸残基的羧基一侧。牛.胰凝乳蛋白酶的氨基酸残基数为 个,分子量约 ,第位组氨酸、位天冬氨酸、位丝氨酸等三个残基在 催化作用中起着中心作用,是组成丝氨酸蛋白酶活性中心的重要部分。位丝氨酸受二 异丙基氟磷酸的作用产生特异的修饰而丧失活性,这是丝氨酸蛋白酶的典型特点。 胰凝乳蛋白酶与同样存在于胰脏里的胰蛋白酶虽然在结构和催化机制方面非常相似,但底 物特异性完全不同。 ..胰凝乳蛋白酶的分离纯化 、羊四、人【】和牛【】等。 最早报道的分离纯化主要是来自哺乳动物猪【 国外研究鱼胰凝乳蛋白酶纯化主要是从鲤鱼 瞄】、角鲨鱼 】、 】、格陵兰鳕鱼 “三.【、北大西洋鳕鱼 虹鳟鱼 【、凤尾鱼【刀、沙丁鱼 】 】。而国内仅有香港大学报道了从草鱼肝胰脏 分离纯化胰凝乳蛋白酶。尽管鱼胰凝乳蛋白酶与猪、牛的胰凝乳蛋白酶在底物特异性上很 相似,但是鱼类胰凝乳蛋白酶与哺乳动物的胰凝乳蛋白酶相比仍有一定的差异性,这些差 篡差太堂亟?堂焦途塞 鲤鱼旺腿壁生堕堡自醛型煞趟乳堡自酶的筮离纯丝区丝厦硒究 异性包括鱼类胰凝乳蛋白酶具有较高催化活性、低的热稳定性以及多肽链氨基酸的组成, 研究表明在鱼类中存在两种具有相同活性但不同类型的胰凝乳蛋白酶。与哺乳动物的 胰凝乳蛋白酶一样,鱼类胰凝乳蛋白酶也是肽链内切酶,它们的分子量为. ;最 ...和. 适和温度范围分别为 。在酸性条件下或温度 以上不稳定【, 】 ..胰蛋白酶原和胰蛋白酶 胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶都是以酶原的形式在胰腺中产生的。胰蛋白酶原 由胰腺细胞分泌,进入小肠后,在有的环境中受到肠激酶 的激活作用后,.之间的肽键被打断,从氨基端水解下一个酸性肽图。这 种水解使其构象发生变化,形成胰蛋白酶的活性中心,,,由酶原转 变成具有酶活的胰蛋白酶。胰蛋白酶不仅可以激活胰蛋白酶原,而且还可以激活胰凝乳蛋 白酶原、弹性蛋白酶原及羧肽酶原,具有重要的生理功能。被肠激酶激活后的胰蛋白酶是 所有胰蛋白酶原的共同激活剂,在它的控制下,可以使所有的胰蛋白酶同时起作用【。胰 蛋白酶对各个胰脏蛋白酶原的激活作用如图所示。 原 跌蚤臼锋娘的漱请 图胰蛋白酶原的激活 . 胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶一样同属于丝氨酸蛋白酶家族的消化酶,是食物蛋白质消化 的重要蛋白酶。胰蛋白酶也是一种肽链内切酶,专一裂解有碱性氨基酸残基, 羧基侧链的肽键。此外,胰蛋白酶还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酯键与酰胺键。胰 蛋白酶因分布的广泛性及结构的保守性,作为酶的模型,人们对其在蛋白质水平和基因结 构水平均进行了深入的研究。迄今为止,关于胰蛋白酶基因序列的报道在上已超 过,条。 胰蛋白酶原 肠激酶 \?肽 胰凝乳蛋白酶原 弹性蛋白酶原 一 胀.姒酶一 胰凝 .蛋白酶 弹性奎 , 晤 , 豁陆 一 羧肽 图胰蛋白酶对各种蛋白酶原的激活 .? ..胰蛋白酶的分离纯化 国外学者等【】在年最先对牛的胰蛋白酶晶体进行了纯化研究, 年等采用氨基酸测序的方法得到了牛胰蛋白酶全部氨基酸序歹。年, 等【采用.射线衍射的方法测定出了牛胰蛋白酶的三维结构。之后蛋白酶研究学者分别分 离纯化和鉴定出许多种冷血动物和温血动物的胰蛋白酶。其中哺乳动物包括人】、牛【、 狗【、鼠和猪?等。关于鱼类胰蛋白酶的研究已有大量报道,包括草鱼 、马苏大麻哈鱼 【明、鲤鱼 【、鲶鱼 【州、柳叶鱼 】、沙丁鱼 】、 【蛔、格陵兰鳕鱼 】、风尾鱼 大西洋鳕鱼 蝴、虹鳟鱼 【、大西洋鲑鱼 、金枪鱼 孙、 、阿拉伯六线鱼 大西洋狐鲣鱼 【刊、狭鳕鱼 和鳜鱼 】、等。除鲤鱼、鳜鱼、鲶鱼、草鱼外,关于淡水鱼类胰蛋白酶的报道很少。到 年,国内外研究学者已经分离纯化出种软骨鱼和种硬骨鱼的胰蛋白酶。 文献报道的鱼类胰蛋白酶的分子量一般是通过.或凝胶过滤的方法来测定 的。年,】报道胰蛋白酶的分子量为... 。但是从很多鱼类分离出的胰 蛋白酶的分子量都在这个范围之外,等【】测得风尾鱼胰蛋白酶的分子量为. ,拶】得出大西洋蛙的胰蛋白酶分子量为. ,而鲤鱼【】贝为. 。综 合国内外的研究表明,鱼类胰蛋白酶的分子量主要范围是在...。鱼类胰蛋白酶 ...范围内,因 适宜值一般在 ...,最适反应温度在.,等电点在 此,在中性条件下绝大部分的胰蛋白酶都是碱性蛋白酶,只有少数是酸性蛋白酶。这与哺 ...,因此,哺乳 乳动物相比有很大的差异,哺乳动物的胰蛋白酶的等电点一般为 类动物胰蛋白酶大都属于酸性蛋白酶。 .胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶应用的研究 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶在食品工业、水产养殖业、医药工业及现代生物技术等领域 均有重要的应用。 在食品加工方面,等】在研究鱼露加工时发现加入胰凝乳蛋白酶和胰蛋白 酶不仅能缩短鱼露的水解时间,而且还能增加鱼露的总氮、可溶性蛋白、游离氨基酸和总 氨基酸的含量。等【年也报道了鱼露生产过程中加入沙丁鱼的内脏能缩短 发酵时间,加快生产进程,原因是沙丁鱼内脏含有胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。冯志彪等【】 则在年进行了螺旋藻蛋白质胰蛋白酶促水解的研究。肖凯军等】利用胰蛋白酶水解 鲨鱼鳍软骨提取粘多糖,通过正交实验得出了胰蛋白酶酶解鲨鱼 鳍软骨的最佳。杨萍 等研究了胰蛋白酶对青磷鱼鱼肉水解蛋白.氨态氮含量和可溶性蛋白得率的影响,确定 了最佳水解条件。 在水产养殖方面,和】研究发现对营养的需求和具有高消化能力的胰 蛋白酶对阿拉斯加狭鳕鱼 鱼苗的成活扮演着重要角色,可以将 胰蛋白酶作为一种生物标记来检测养殖饲料的数量和质量,低的胰蛋自酶含量表明鱼苗缺 少食物而处于饥饿状态,这样可以衡量鱼体的健康状况。田希文等人【】以发育到第期的 乌苏里白鲑 鱼卵巢为材料,利用胰蛋白酶使固定在卵巢上的 卵粒脱离下来,并研究了不同温度、盐度和胰蛋白酶浓度对鱼卵分离速度和效果的影响。 医学方面,胰凝乳蛋白酶在眼科、皮肤科做临床局部应用已被肯定【 。国内临床上胰 凝乳蛋白酶主要用于眼科手术,也可用于伤口或局部炎症,以减少局部分泌和水肿。近年来, 随着临床药理学研究的不断发展,胰凝乳蛋白酶的临床应用范围也日渐广泛。其临床应用 主要包括以下方面:治疗脂肪硬化。胰凝乳蛋白酶具有分解蛋白、消化脓液及坏死组 织、助长肉芽生长的作用,可使凝固的蛋白、脂肪变软溶化,并促进新生肉芽的生长,从而 达到促进愈合的目的。李升香等娜】用.胰凝乳蛋白酶治疗因肌肉注射致脂肪硬化患者 例,效果显著。治疗皮肤慢性溃疡。马利斌【刿以外用胰凝乳蛋白酶为主,根据疮面的 大小,坏死组织的多少,用.支含量 单位的酶粉针剂,临床治愈例,无效例, 治愈率为.%。治愈的例中,疗程最短 ,最长 。治疗骨伤科。宋明【】 将胰凝乳蛋白酶应用于治疗粘连型肩周炎、创伤性疤痕粘连、创伤性关节炎、滑囊炎等, 共有多例次接受治疗,除例有过敏反应外,均取得了满意的疗效。治疗腰椎 间盘突出症。郑光亮等【】应用高浓度.胰凝乳蛋白酶对应节段治疗各型腰椎间盘突出症 例。治疗有效率达.%。治疗结核性脓胸。曹立华【‘】等对结核性脓胸例均 采用胰凝乳蛋白酶肌肉注射,每日次,每次胸穿后胸腔内注射胰凝乳蛋白酶. 。 取得了满意疗效。 在医药方面,猪和牛胰脏中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶被用来作为人和动物的治疗试 剂已有多年的历史。总体上讲,胰蛋白酶在医药领域主要有个方面的应用: 用来作为口服药物治疗胃肠紊乱;胰蛋白酶可作为清创剂,消除创伤部位坏死组织。 段作纬等研究胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶急救药盒救助毒蛇咬伤,结果表明,患者全 部治愈,治愈率达%,从而为治疗毒蛇咬伤开辟一条新的途径。作为消炎药物而 降低炎症。陆智杰等年采用及的方法对胰蛋白酶的及其蛋 白的表达进行检测,结果显示胰腺癌组织中人胰蛋白酶水平明显高于正常胰腺组 织, 显示胰腺癌组织的胰蛋白酶水平明显增高,表明胰蛋白酶基因和蛋白水平的 上升与胰腺癌的发生有密切关系。胰腺癌还可作为血栓溶解剂治疗血栓紊乱【。 .本课题研究的内容与意义 鲫鱼作为我国内陆一种重要的养殖淡水鱼类,因其肉味鲜美、营养丰富,同时还具有 食疗保健的功能,为消费者所喜爱,市场需求量也日益增长。本文 以淡水鲫鱼为材料,从 其肝胰脏中纯化得到了两种胰凝乳蛋白酶和一种胰蛋白酶。在酶学性质研究中,本课题研 究了其分离纯化方法、最适温度与温度稳定性、最适与稳定性、底物特异性、各种 蛋白酶抑制剂的抑制作用、金属离子的作用、酶动力学、制备了特异性多克隆抗体并实现 了免疫印迹反应。 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶是鱼体内一种重要的消化酶。研究鲫鱼胰蛋白酶具有以下意 义:首先,低温下仍具有高活性的酶在食品工业和医药工业中有着广泛的用途,对鱼体内 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的研究可为这类酶的开发利用提供理论基础。其次,鱼类消化酶 的酶学性质是反映鱼类消化生理机能的一项重要指标,研究鲫鱼胰凝乳蛋白酶和胰蛋白对 养殖鱼饵料的配制具有重要的指导意义。第三,鲫鱼作为我国淡水经济养殖鱼类,产量高。 因此,如能将鱼类加工的下脚料转变成工具酶,应用于食品加工或作为生化试剂也具有重 要研究意义。迄今为止,国内外对鱼类胰凝乳蛋白酶和淡水鱼胰蛋白酶的纯化研究相对比 较少,因此本研究能补充相关研究的不足。 第二章材料与方法 .材料 ..实验用鱼 鲜活鲫鱼 购于厦门市集美区菜市场,每尾重约 左右。 ..试剂 层析树脂及荧光合成底物 、 、?和?为 公司美国产品。荧光合成底物 ?、 、 、 、 ?? ? ?、舢争、和???为 。 日本公司产品。 ’ 蛋白酶抑制剂 、 、、 ?? 为.,,美国 来自于公司,德国。.为 公司产品。和 /,,美国公司产品。 .,.等所用试剂 十二烷基硫酸钠,电泳纯、二硫叔糖醇、丙烯酰胺为.公 司美国产品;标准蛋白分子量 为公司 产品;、溴酚兰为公司产品;考马斯亮蓝为公司美国 产品;明胶和 .为公司产品。 所用试剂 牛血清白蛋白为北京科宏达生物技术有限公司产品。标记的羊抗 兔 二次抗体为公司产品。二氨基联苯氨为公司 产品。兔抗鲫鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶多克隆抗体由本实验室 制得。 其它实验试剂 其它实验试剂均为国产分析纯。 ..实验所用溶液及其制备 胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶纯化与活性测定所用溶液 / . / 缓冲液 和. 蒸馏水中,用/ 称取. ?溶解于,为母液。 调节至.,至终体积 缓冲液 / .. / / . / 缓冲液稀释成 .。 酶活测定用反应终止液 ‘ 水:异丙醇:甲醇::?,、,。 阳离子交换柱.用缓冲液 /: 溶液:. ?每升. 溶液:. /;每升. / ., 缓冲液。 将溶液和按一定比例混合成终浓度为 不同条件所用缓冲液体系 ...,. .缓冲液; ...,. / 缓冲液; ...,. / .缓冲液; .. / .,. 缓冲液。 . .所用溶液 凝胶储备液%:%/丙烯酰胺;%/,.亚甲叉双丙烯酰胺;溶 解于去离子水,避光保存于棕色瓶中; ,室温贮存; 粉末溶解于去离子水,至终体积 %: 四甲基乙烯二胺; ,?贮存; 过硫酸铵%: 过硫酸铵溶解于去离子水,至终体积 /嘶, .,.% .甘氨酸电泳缓冲液: /甘氨酸 /., 样品缓冲液: /二硫苏糖醇,%, .%溴酚蓝,%甘油; / .; 曲分离胶缓冲液贮液:. ? 浓缩胶缓冲液贮液:. .; /. 考马斯亮蓝染色液:在 甲醇:水:,/和 冰乙酸的混合液中溶 解. 考马斯亮蓝,用滤纸过滤除去颗粒状物质。 所用溶液 /, .; %.甘氨酸电泳缓冲液: /甘氨酸 样品缓冲液: 浓缩胶缓冲液, %甘油,.%溴酚蓝; 凝胶储备液%,四甲基乙烯二胺、过硫酸铵%、分离胶缓冲液贮 液、浓缩胶缓冲液贮液、考马斯亮蓝染色液、脱色液同.所用溶 液。 所用溶液 蛋白转移缓冲液:. 碱;. ; 甘氨酸;. 甲醇;加去离子水至 : .; ?: /? ;加去离子水至 ;一 : .; 脱脂牛奶%:. 脱脂奶粉溶解于 / 底物显色液: 溶解于 .;%过氧化氢 . 弘。 /明胶的配制 。 明胶加适当蒸馏水,加热使之溶解,定容至 .%的 溶液的配制 . 的 .加缓冲液定容至 。 银染色所用溶液 %甲醇 甲醇加蒸馏水; %甲醇 甲醇加蒸馏水; /二硫苏糖醇 在 . / 的蒸馏水中加入 ; .%/ 蒸馏水中加入. ; 显影液 碳酸钠溶液: 蒸馏水中; %/甲醛加入 无水碳酸钠溶于 的碳酸钠溶液即为显影液。 ..实验所用仪器 表.实验所用仪器 . 仪器名称 生产商 垂直电泳槽 ,美国 可见.紫外分光光度计 德国 计 ,美国 高速冷冻离心机 ,美国 超纯水系统 ,美国 免疫印迹转移装置 ,美国 凝胶成像装置 ,英国 漩涡震荡器 ?蛆,中国 蛋白质纯化系统 .,美国 恒温水浴锅 ,美国 超低温冰箱 ,美国 低温冷柜 海尔,中国 电子天平 上海精科天平,中国 荧光分光光度计 ,日本 搅拌超滤装置 ,美国 离心浓缩装置 ,美国 组织捣碎机 ,瑞典 脱色摇床 南达生物技术开发公司,中国 .方法 ..蛋白酶活性的测定 胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶活测定主要方法如下:胰蛋白酶和胰 凝乳蛋白酶分别以 ?和.为荧光底物。具体操作如下:稀释适 当的酶液 加入到 的 / .缓冲液中,再加入 . /的荧光底物 ,在水浴加热 后立即加入. 的终止液终止反 应。将反应液置于荧光分光光度计中,在激发光波长 ,发射光波长 条件下 测定反应所释放出的.氨基.甲基香豆素.,的荧光强度, 并以此推算出酶活力。胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活力单位分别定义为每释放和 所需要的酶量。 ..蛋白酶浓度的测定蛋白质含量按法测定【。柱层析过程中蛋白质含量的检测采用紫外分光光度计 在波长下进行,以牛血清白蛋白为标准蛋白。 . ?、及 . 各阶段的纯化效果及纯化蛋白质的.参考法【。用.分 析并用标准蛋白质... 做对照,考马斯亮蓝染色。 电泳中使用的标准蛋白质及对应的分子量分别为:.半乳糖甘酶 ,牛血清 白蛋白. ,鸡卵白蛋白 ,猪肌乳酸脱氢酶 ,限制性核酸内切 。 酶 ,牛乳.乳球蛋白. ,鸡蛋白溶菌酶. .所用胶具体制备步骤如下: 胶浓度的选择 . 根据文献资料知道鱼类胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的分子量介于 之间, 因此,选用分离胶的浓度为%; 分离胶按表的组成配置,小心注入准备好的玻璃板间隙中,并为浓缩胶留有足够 空间。轻轻在顶层加入少量去离子水; 待凝胶聚合完成后,吸掉覆盖层水。气温在以下时,应适当延长凝胶聚合时间; 按表.的组成配制浓缩胶,注入分离胶上端,小心插入梳子避免产生气泡。待凝胶 完全凝固后即可用于实验。 表 %分离胶所用溶液 % 凝胶体积 去离子水 . . 丙烯酰胺溶液% . . . /? % . . 过硫酸铵溶液% . 样品的化处理:将样品和×上样缓冲液以:的比例混合均匀,在? 下加热 充分化后即可上样,每个泳道的上样量为. ,标准蛋白上样量为 “。样品在通过浓缩胶时采用 稳流方式电泳,待样品进入分离胶后,采用 稳流方式电泳。待指示剂迁移至凝胶底部时,停止电泳,时间约为. 。电泳结束 后,从装置上卸下玻璃板,小心撬开玻璃板取下凝胶后,用考马斯亮蓝染色液浸泡,微波 炉加热染色,每次 直到胶呈现深蓝色即可停止加热。在室温下冷却后倒出染色液,用 脱色液浸泡并慢慢摇动,使凝胶脱色至条带清晰为止。如样品蛋白含量较低,可采用银染 一 色法提高灵敏度。 表 %浓缩胶溶液 % 凝胶体积 去离子水 . . 丙烯酰胺溶液% . . /。 . . % 过硫酸铵溶液% . ~正 . 也称非变性凝胶电泳,与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在 电泳过 程中和电泳后都不加入变性剂。最主要的有以下几点: 凝胶的配置中非变性凝胶不加,而变性凝胶有; 电泳载样缓冲液中非变性凝胶不仅没有,也没有巯基乙醇; 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它自身所带的电荷以及分 子大小,而. 电泳中蛋白质分离只与其分子量有关,与蛋白质原来所带电荷无 关; 因为是非变性凝胶电泳,电泳时候电流不能太大,以免电泳过程 中产生的热量太多而 导致蛋白变性。每个步骤都要在?的条件下进行,这样才能保持 蛋白质的生物活 性,也可以降低蛋白质的降解作用。 蛋白凝胶的银染色 室温下,凝胶在摇床上缓慢摇动,并进行下面的步骤: 在%甲醇溶液中浸泡两次,每次 ; 在%甲醇溶液中浸泡 用蒸馏水迅速洗次; 在 /中浸泡 ; 在.%溶液中浸泡 。 先用水快速洗次,每次不超过 ; 曲加入显影液,在显影液中浸泡数分钟,直至显现蛋白条带; 加入固体柠檬酸每显色液中加约 柠檬酸停止显影; 用铝箔纸盖住凝胶使避光,继续浸泡 ; ,再置暗室蒸 用蒸馏水彻底清洗,凝胶在铝箔下在暗处蒸馏水中浸泡 馏水中,使蛋白质条带显色明显: 将凝胶移置凝胶成像仪中可见光照射成像。 明胶酶谱胶的制备参照.胶的制备,只是分离胶中用. 的明胶溶 液替 换. 蒸馏水,其余与.胶的制备相同。 酶的酶谱检测和分析 在电泳槽中加入?预冷好的缓冲液,取纯化后的上样子%聚丙烯 电泳直至溴酚蓝到达分离 酰胺凝胶,每孔加样品山。将样品在?下,稳定电流 胶底部,中止电泳。 取出凝胶,放入.% .中,置于摇床上摇动× 以去除。倒掉 .后用蒸馏水洗.次,然后将凝胶放入 /..缓冲液中,在 ?反应 后取出凝胶,进行考马斯亮蓝染色,倒出考马斯亮蓝染色液后用 脱色液缓慢 摇动脱色,直至条带清晰为止。 图.:酶活性测定方法明胶酶谱 :..胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的纯化方案 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶纯化方案如图.所示。在整个蛋白酶纯 化过程温度控制在 左右。 鱼 宰杀 理 预 酶 粗 液 鲫上处?? ’厂???????????? 。土 上 .上 阴离子型胰蛋白酶 . 上 阴离子型胰凝乳蛋白酶 阳离子型胰凝乳蛋白酶 图鲫鱼胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶纯化 . 实验鱼预处理 将鲜活鲫鱼击杀,取其肝胰脏,去离子水洗净并称重。 样品预处理 将 / . / 缓冲液中, 切碎的肝胰脏放入 ,收 用组织捣碎机 /次,进行组织捣碎。均质后酶液在, ,。离心 集上清酶液作为胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶粗提液。 硫酸铵分级沉淀 硫酸铵分级沉淀的确定 参照鳜鱼胰蛋白酶‘的纯化方法确定硫酸铵饱和浓度从%开始, 以.%饱和度 为间隔测定。 经预处理的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶粗酶液慢慢加入边加硫酸 铵边搅拌固体硫酸 铵至饱和度为%, 静止 后,在 下,, 收集所得 转速,离心 / . / , 沉淀并溶解于少量的 缓冲液中,经 . , 的上清定义为%饱和浓度硫酸铵沉淀的“馏分;按上述步骤分 离心 别进行%、%、.%和.%饱和浓度硫酸铵的“馏分”测定。测定每步 所得“馏分溶解的沉淀和上清的蛋白质含量和总酶活力,计算各 部分比活力及质量 百分比。 硫酸铵分级沉淀 根据硫酸铵沉淀实验的结果选取%.%饱和浓度硫酸铵沉淀的“馏 分,将目的沉 / . / 淀“馏分”装入透析袋,以 缓冲液作外液透 . 析 ,期间更换.次透析液。透析后样品在 下,, ,得到上 离心 清酶液即可上样于.阴离子交换柱层析。 .阴离子交换柱层析 / / 将上述酶液上样于事先以 缓冲液平衡 . / ,以相同缓冲液在流速为 好的阴离子交换柱.柱.× 下进行流洗小时以上,分别收集蛋白酶经.离子交换柱层析的吸 附部 / 分与未吸附部分. /管。吸附部分以. 的缓冲液作线性梯度洗脱, 洗脱总体积为 。分别测定胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶在吸附部分和未吸附部分的酶活 力及蛋白含量,分别收集活性部分的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶并用.超滤膜进行超滤 浓缩。 凝胶过滤层析 / 用 / .. / . 缓冲液平衡 凝胶过滤柱. 。分别将未吸附部分阳离子部分与吸附部分阴离 子部分胰凝乳蛋白酶浓缩后的样品上样于该凝胶过滤层柱,然后以平衡液缓冲液以. /的流速洗脱,每管收集 .凝胶 。.未吸附部分经 / 过滤柱后,收集胰凝乳蛋白酶活性部分在 .缓冲液中透析,然后上 凝胶过滤柱后,收集胰凝乳蛋 样于阳离子交换柱.。同样,经 白酶活性部分加入地使其终浓度为 /,然后上样于疏水层析柱 .作进一步纯化。 同样将.柱吸附且具有胰蛋白酶活性的组分浓缩后也上样于 / / 柱,然后以含. 的 .平衡液继续洗脱,每 . 管收集 ,流速为. /。得到高度纯化胰蛋白酶。 .疏水层析与离子交换层析 ./ /. .柱的吸附部分上样于用 /。 缓冲液平衡过的疏水层析柱?. ,流速为. / .缓冲液洗脱,然后再用 先用线性梯度 /? / 线性梯度% / ? .缓冲液洗脱。被 .洗脱下来的活性部分得到了高度纯化,定义为 /. / .缓 。.柱的未吸附部分上样于以 ,流速为. /。吸附部分用 冲液平衡过的阳离子交换柱.. .. / / .缓冲液作线性梯度洗脱,从. 盐离子浓 。 度洗脱下来的活性部分同样得到了高度纯化,定义为 ..性质分析 分子量的确定和纯度鉴定 本研究以.测定高度纯化的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的分子量; 用 .、.鉴定所纯化酶的纯度。用明胶一酶谱?测定 酶对明胶的分解能力。 范围和稳定性 范围的测定在以下缓冲液浓度均为./中进行:.缓冲液 ...; ...;缓冲液 ...;.缓冲液 ...,按照酶活力测定方法分别测定胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的 剩余酶 缓冲液 活力。稳定性的测定方法是将胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶置于上述 各个的缓冲液中并 在室温下放置后,按照酶活测定方法测定其剩余酶活力。 最适温度和热稳定性 在. 的范围内,不改变上述酶活测定方法的其他条件,测定酶的最适温度范围。 、 、 、 、 、 、 、 、 将酶加入到缓冲液中,分别在 和 的水浴锅中恒温孵育 后,按照酶活测定方法测定其剩余活性,从而 推测其热稳定性。 底物特异性测定 按照酶活力测定方法,测定胰蛋白酶分解各种荧光合成底物底物的活力, 以胰凝乳蛋白酶分解荧光底物.为对照。 抑制剂对蛋白酶活力的影响 将丝氨酸蛋白酶抑制剂、 、,胰凝乳蛋白酶特异性抑制 剂、、天冬氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂. 和金属蛋白酶抑制剂、分别加入到纯化的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶溶液中, 使其达到相应的终浓度。将蛋白酶和抑制剂在室温下作用 后,分别测定蛋白酶的剩 余活力,以不添加抑制剂的蛋白酶活力为对照。 金属离子对蛋白酶活力的影响 / 将酶活溶于 . .缓冲液中,分别加入以下金属离子、 / 、、、、、、和并使它们的终浓度分别为 和 /,分别测定、、、、、和对酶活力的影响。按 照酶活力测定方法测定其剩余酶活力,以不添加金属离子的酶活 力为对照。 酶动力学研究 将所纯化得到的胰凝乳蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶分别以 .和...为底物,将底物浓度配为:.肛/、 . , /、. 条件下反应 /、. /、 /和 /在 测定酶在不同浓度的荧光底物下的酶活力,各浓度下反应的平均 速度代替反应初速率。 将米氏方程、,‰?一】两侧取双倒数,得到方程式:/‰?//‰, 以//作图,得一直线,即为双倒数直线图,其中‰为反应最大速 率,【】为底物浓度。直线的横轴截距为?慨,纵轴截距为/‰.‰‰?】,其中】 为酶浓度。从而可得到相应的动力学参数‰、疋砒和整砒/‰。 鲫鱼胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶抗体的制备及其免疫交叉反应 抗体制备方法简述如下:纯化的胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶抗原分别和佐剂按比 例充分混匀后,按量注入到兔子皮下及肌肉中。每隔周加强免疫一次,一共注射四次。 第一次注射时,抗原即胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶和完全弗氏佐剂按:的比例混 合总体积 ,其中蛋白含量约“,分别注入到待免疫的兔子腹部皮下以及大腿 肌肉各处。饲养七天后,进行第二次免疫注射,方法同第一次,佐剂改用不完全弗氏佐剂。 第三、四次的注射同第二次。第四次免疫七天后,将兔子共只麻醉开腹,用注射器 在下腹大静脉和大动脉处采血。每只兔子采得血液约 ,所得血液于?下温育 后,所得上清约 即为 后,?放置过夜,血液凝固后得到上清,离心 兔抗胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的抗血清,分装后于.?下冷冻保存待用。 ’ 本研究分别制得兔抗鲫鱼胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶两种多克隆抗体。 免疫交叉反应依照】法进行。 基本操作如下:首先将蛋白质样品进行.。所用的预染标准蛋白分别为: 一牛乳糖 ,.副肌球蛋白 ,牛肝谷氨酸脱氢酶 , 兔肌醛缩酶. ,兔肌磷酸丙糖异构酶. ,牛乳球蛋白 ,鸡 。 蛋白溶菌酶. ,牛肺抑肽酶. 待电泳结束后,取出凝胶,在蛋白转移缓冲液中将凝胶、硝酸纤维素滤膜、滤纸等按 图.所示置于装置中确保各层对齐并不残留气泡,在常温下对凝胶中的蛋白质进行半 干法电转移 左右;若是湿转,则需将湿转电泳槽放入层析柜中,低温下 ,恒 压转 左右。电转移后的凝胶用考马斯亮蓝染色以检测凝胶上是否仍有蛋白残留从而确 定转膜效果。将硝酸纤维素膜置于含有丽春红的溶液中染色,待蛋白带出现后;用 漂洗直至丽春红被完全去除。之后将膜浸泡于%脱脂牛奶中封 闭 ,.洗涤残留 的牛奶,加入一抗:,胰凝乳蛋白酶的一抗是兔抗鲫鱼胰凝乳蛋白酶多克隆抗 体;胰蛋白酶的一抗分别是大鼠抗鲤鱼胰蛋白酶和兔抗鲫鱼多克隆抗体平放在平 缓摇动的摇床上室温孵育 或者?过夜;洗涤次,每次 ,加入 标记的羊抗兔:,或标记的兔抗大鼠:,作为二抗,反 应 后用充分洗涤。加入新配制的显色液,反应至硝酸纤维素膜上黄褐色条 带出现为止,水洗终止显色。 电极阴 三层滤纸 维素膜 、电极阳 图 装置示意图.?第三章结果与讨论 .鲫鱼胰凝乳蛋白酶的纯化及性质研究 ..鲫鱼胰凝乳蛋白酶的纯化 采用上述纯化方法,本研究从鲫鱼肝胰脏中纯化得到一种阴离子型和一种阳离子型的 。 胰凝乳蛋白酶,分别定义为 和 硫酸铵分级范围确定 在蛋白质分离纯化过程中,硫酸铵分级沉淀是一种简便实用的粗分离手段。硫酸铵是 中性盐,硫酸铵盐析通过不断增加溶液中的盐浓度,使蛋白质表面的电荷集团与极性基团 和溶液中的离子配对,瓦解以电荷为基础的蛋白质。蛋白质相互作用,促进蛋白质表面取得 疏水相互作用,在短时间内形成蛋白质聚集体而达到从水中分离出来的效果。 表硫酸铵分级盐析实验本实验采用硫酸铵分级盐析进行粗分级分离,如表.所示。当硫酸铵饱和度为% 时,分馏段胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶比活力不高,分别占其活性百分比的.%和.%。 硫酸铵“馏分饱和度为?%时,沉淀下来的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的比活力分别为 .和.,分别占总活力的.%和.%;但是在.%饱和度下,质量百分比 并不高,约占总蛋白质量的.%。此时,.%一“馏分沉淀下来的胰凝乳蛋白酶和胰 蛋白酶的活力百分比均达到最高值。当硫酸铵饱和度在%以上时,沉淀的胰凝乳蛋白酶 和胰蛋白酶活力百分比不高,二者活性百分比为 %和.%;但是在% 以上硫酸铵饱 和度质量百分比最高,占总质量百分比的.%。 四四眦 伽 姗 枷 姒图鲫鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶纯化硫酸铵盐析的。/ : ;: :.% 粗酶液; :%“馏分”::%“馏分”; :.%“馏分”; “馏分”; :.%“馏分”; :%上清。 从图.可看出,在硫酸铵饱和度为.%时,沉淀析出的蛋白质量较少,大部分 蛋白质主要集中在%、%饱和度的沉淀和%饱和度的上清中,这和表.硫酸铵 “馏分参数质量百分比相符合。表.硫酸铵“馏分参数显示胰凝乳蛋白酶和胰蛋白 酶的活性主要集中在.%硫酸铵分级沉淀中,同时图.显示在.%硫酸铵分级沉 淀中析出的蛋白质相对较少,也即杂蛋白相对较少,便于目的蛋白酶的分离纯化。因此, 本实验选择?%的硫酸铵饱和度盐析,对鲫鱼胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶进行粗分离。 胰凝乳蛋白酶的柱层析分离 离子交换层析是利用蛋白质表面的电荷基团与带相反电荷的不溶性基质结合,再通过 增加洗脱液中的离子强度将蛋白质置换下来而达到分离的方法。.是一种有 代表性的阴离子交换树脂,它能结合中性下带负电荷的官能团,对分离等电点在中性 以下的蛋白质非常有效。由图.可知,经过.柱层析,粗酶液被分成未吸 活性,收集活性 附部分和吸附部分。未吸附部分有阳离子型胰凝乳蛋白酶 活性,经过 较高部分进一步纯化;吸附部分则有阴离子型胰凝乳蛋白酶 线性梯度洗脱,取活性部分继续纯化。同时在线性梯度洗脱部分收集活性组分进 行纯化。作为初级层析,.是去除杂蛋白和提高酶比活力的有效手段,同时, 和阴离子型 该柱层析也能有效将吸附段中的阴离子型的胰凝乳蛋白酶 分离开来。 二?《苗廿??《 善兽量一害鼍《启,异爻 .. / 图 .离子交换柱层析.×啪, 特征吸收值.?;水解 ?棚一一耵订活性?;水解活性?。 , 一; . /一.×仃 ?;? ?.凝胶过滤层析是根据蛋白质分子量大小和形状进行分离的方 法,即基于不同蛋白质通 过凝胶微孔的迁移能力的不同而达到分离的目的。分子量和形状 较大的蛋白质在凝胶中经 过的途径短,先从层析柱中出来,而分子量小的蛋白质由于还需 要经过凝胶孔内部,经过 凝胶过滤介质,它的 路径长而后从层析柱中被洗脱出来。本实验使用 有效分离范围是,来自.未吸附部分和吸附部分的胰凝乳蛋白酶 经过此柱后的分离效果如图.和.所示。、姜 曼詈 ; 詈 皇 ?《苗四声《 . / 凝胶过滤层析.× , 特征吸收值 图阴离子型胰凝乳蛋白酶的 ?;水解棚?活性?。. .× ,. 越一;?? . . . . 一皇/是;一备《 . . . , 凝胶过滤层析.× 特征吸收值 图阳离子型胰凝乳蛋白酶的 一;水解?活性?。 一 ..× ,~;??. 活性部 被阴离子交换柱.吸附并具有胰凝乳蛋白酶 。 去除了大量的杂蛋白。再通过疏水层析柱 分过凝胶过滤柱 的高度纯化,结果如图.所示:.管用. .,实现了 /进行线性洗脱,大部分杂蛋白被除去,而胰凝乳蛋白酶并没有被 洗脱下 来,.管采用.%/的乙二醇洗脱,胰凝乳蛋白酶在%左右的乙二醇浓 度下 。因此,疏水层析柱对分离目的蛋白胰凝乳蛋 被洗脱下来,得到银染纯的白酶和其它杂蛋白是非常有效的。 眩 专 叫 似 占 点 啷 口?代《苗二爵七?《 ? . ,砌特征吸收值~; 图阴离子型胰凝乳蛋白酶的.疏水层析.×. 水解..脚一.弦活性?。...锄 , 一;?. 阳离子交换树脂是在不溶性载体上结合有中性下荷负电的官能 团,这类树脂适用 于分离等电点在中性以上的蛋白质。.树脂是一种强阳离子交换 树脂。本实验 采用.离子交换层析对.柱未吸附部分的胰凝乳蛋白酶继续纯 。 化,该柱用 .缓冲液平衡,通过纯化得到了 /的 结果如图.所示,当浓度为. 被洗脱下来。由于 /时, 未被阴离子交换树脂.吸附,而被阳离子交换树脂 .吸附,所以推定其为阳离子型胰凝乳蛋白酶。 眈 耋 加 们 /:一扫善,『 耋 暑?《苗?舌?童《 。/ .. ,衄特征吸收 图纯化阳离子型胰凝乳蛋白酶的.离子交换层析.×. 值一;水解?活性?。. , ?; .... .弘 、及 通过硫酸铵盐析和..、 .印柱层析的方法,从鲫鱼肝胰脏中纯化得到了两种胰凝乳蛋白 酶奶, 的最终得率分别为.%.%,纯 。 和 和 化倍数分别为和.倍表。 的纯化结果 表鲫鱼 和 ./ % .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . ..胰凝乳蛋白酶的性质研究 电泳和酶谱分析 均显示单 和 在.图谱上图. 、,一条带,所对应的分子量分别为 和 。该结果表明,鲫鱼胰凝乳蛋白酶的分 【、风尾鱼. 子量与文献报道的鳕鱼 、北大西洋鳕鱼 和 . 【、虹鳟鱼. 【、草鱼 和 【】、沙丁鱼 【】的胰凝乳蛋白酶分子量相接近。与其它鱼胰凝乳蛋白酶一样【,,鲫鱼胰凝乳蛋白酶即 。 使在还原剂存在下,在.上也显示出单一的条带图. 但是与鱼胰凝乳蛋白酶不同,哺乳动物牛凝乳蛋白酶在.的作用下被分解 为三条链链、、【们。通过降解法分析北大西洋鳕鱼胰凝乳蛋白酶端序 列发现,该酶是由两条多肽链组成的】,链个残基和链个残基。表 明与哺乳动物不同,鱼凝乳蛋白酶可能仅含有两条多肽链。如草鱼胰凝乳蛋白酶在还原条 . 件下,链和链被打开,由于链太小不能在.上显示出来, 只能检测到链【。因此,鲫鱼胰凝乳蛋白酶可能与北大西洋鳕鱼 的一样,在酶原激活过 程中仅停留在或、形式而并没有转变成 形式。 能分解明胶图. 有趣的是,通过明胶酶谱发现 ,而 和牛胰凝乳蛋白酶并没有在明胶酶谱上显示出条带,这种现象在 其它鱼胰凝乳蛋白酶中 的 没有类似的报道。但是,】等人年发现一种来自 胰凝乳蛋白酶型的蛋白酶同样也能分解明胶。比表现出较 与 高的对底物...的催化活性。这些结果暗示鲫鱼 一样都是非特异性胰凝乳蛋白酶。因此,为了进一步研究比较鲫 鱼 草鱼 ,尤其是它们的分子结构关系,对二者进行蛋白质测序 和 或利用基因工程方法确定它们的一级结构是有必要的。 四 四 触 眦 枷 枷 萎 姗 踟 枷 四 斛她 的电泳分析。非还原状态 图.鲫鱼胰凝乳蛋白酶和 ; 、加入的、.和明胶酶谱。: . : ; ; : 。 .. , , , ; ;,: : : : : 蛋白酶抑制剂的作用 的抑制效果如表?所示。 各种蛋白酶机制剂对 与 和强烈抑制;而 两种胰凝乳蛋白酶被蛋白酶抑制剂、 则产生部分抑制,胰凝乳蛋白酶特异性抑制剂也同样起抑制作用,尤其 是对 的抑制作用尤为明显。天冬氨酸蛋白抑制剂、金属蛋白酶抑制 剂和几乎不起抑制作用。该结果与报道的北大西洋鳕鱼【】、凤尾鱼【、虹 鳟鱼【】胰凝乳蛋白酶对抑制的敏感性相一致。抑制剂抑制效果实验表明本研究纯化得到的 两种蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类,性质上与胰凝乳蛋白酶非常相似。 表.蛋白酶抑制剂对鲫鱼胰凝乳蛋白酶的抑制作用 竺竺 婴竺坠二亘逦画巫互 二巫%巫叵 . . ‘ 龇 三 孑 . . 锄 . . 、 . . . . . . . .金属离子对胰凝乳蛋白酶活性的影响 / 关于金属离子对鲫鱼胰凝乳蛋白酶活性的影响, /和 、在 有轻 时对 和 有轻微的激活作用;对 却有一定的抑制作用。其它金属离子如、、 微的激活作用,然而对 的活性有不同程度的抑制 、、、对 和 作用表。 表金属离子对鲫鱼胰凝乳蛋白酶活性的影响。 . 胰凝乳蛋白酶的最适温度和热稳定性 鲫鱼胰凝乳蛋白酶的最适温度如图.所示,选择温度范围为. , 的最适温度分别为和 。鲫鱼胰凝乳蛋白酶的最适温度与 和 已报道的虹鳟鱼 】、沙丁鱼 】胰凝乳蛋白酶相似。鱼体内胰凝 乳蛋白 在 表现出的剩余活性 酶的最适温度可能与它们的栖息环境有关。 的剩余活性%高。温度对鲫鱼胰凝乳蛋白酶的热稳定性 %比 影响如图所示。在 以下