人胎盘组织造血干-祖细胞的分离富集

人胎盘组织造血干-祖细胞的分离富集 人胎盘组织造血干/祖细胞的分离富集 【摘要】 为了探索从胎盘组织中分离富集造血干/祖细胞(HSPC) 的标化，采用机械法加胶原酶消化法制备人胎盘组织单个细胞悬 液，用羟乙基淀粉(6% HES)法从中分离出单个核细胞(MNC)，再经 免疫磁珠分选法分选出CD34-、CD34+CD38-、CD34+CD38+ 3个细胞亚 群，用流式细胞术对各阶段分选细胞进行表型分析并计算分选细胞的 富集度和回收率。结果表明:机械法加胶原酶消化法制备的人胎盘组 织单个细胞悬液中单个核细胞(MNC)数达(12.30?3.51)×108， 与脐血初始样品所含的MNC数(8.86?5.38)×108 比较差异无统计 学意义，而其CD34，细胞所占百分率,(3.93?2.31)%,则明显高 于脐血,(0.44?0.29),,。胎盘组织单个细胞悬液经6% HES分离 后MNC和CD34，细胞的回收率分别为(45.3?11.7),和(51.1? 9.8)%;MNC经免疫磁珠分选后，其CD34，细胞的纯度和回收率分别 为(73.4?14.1),和(52.7?11.7)%。结论:本实验所建立的" 机械法加胶原酶消化法-HES分离MNC-MACS分选目标细胞"的分离纯 化可从胎盘组织获得高丰度、高富集度、高活性的HSPC，为进 一步研究胎盘HSPC提供了比较经济、效果较好的分离富集。 【关键词】 CD34抗原;造血干细胞;胎盘;免疫磁珠细胞分选;脐 血 Isolation and Enrichment of Hematopoietic Stem/ Progenitor Cells from Human Placenta Tissue AbstractThe aim of this study as to establish the standard protocols for isolating and enriching hematopoietic stem/ progenitor cells from human placenta tissue derived from PT ere separated by hydroxyethyl starch contained in MNC ere isolated by Magnetic Activated Cell Sorting ×108 from a single-cell suspension of human PT by mechanical method and collagenase digestion, no significant difference existed as pared ith umbilical cord blood initial sample ,×108,, but the percentage of CD34+ cells in MNC of human PT as %, much higher than that in UCB ,%, . recovery rate of MNC and CD34+ cells from PT after separation ith 6% HES ere % and % , respectively. After MNC being sorted by MACS, the enrichment and recovery rate of CD34+ cells in CD34+ group ere % and % respectively. It is concluded that the protocols established here for isolating and enriching hematopoietic stem/progenitor cells from human placenta can acquire HSPC ith high abundance, enrichment and viability and may be a useful reference of isolating methods for future related study. Key ordsCD34 antigen; hematopoietic stem cell; placenta; MACS; umbilical cord blood 造血干/祖细胞(hematopoietic stem/ progenitor cells， HSPC) 存在于人骨髓 、动员的外周血和脐血等组织中,1-3,。新近，有学 者提出人胎盘组织中含有比脐血更为丰富的造血干细胞,4,;人胎盘 组织中CD34+ HSPC的百分率是脐血的8.8倍，并且人胎盘组织中免 疫细胞成分较少，极有希望成为今后HSPC的新来源,5,。从人胎盘 组织分离出高活性、高丰度的HSPC是对其进行相关生物学特性等研 究的前提，目前尚无有关人胎盘组织HSPC分离的优化方案可循。本 研究旨在建立从胎盘组织中分离、纯化HSPC的标化流程，为今后人 胎盘组织HSPC的深入研究打下良好的基础。 材料和方法 主要试剂 胶原酶(collagenase ?)、羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch， HES)为 Sigma公司产品。RPMI 1640、新生牛血清(FCS)购自于Gibco 公司。荧光标记单克隆抗体CD38-FITC、CD34-PE及CD34绝对计数试 剂盒为Becton Dickinson公司产品。免疫磁珠细胞分选试剂盒购自 Miltenyi Biotec公司。 胎盘与脐血的收集 收集足月分娩的人胎盘，同时采集同一胎盘的肝素抗凝脐血，HBsAg， 共5份。胎盘和脐血均于6小时内进入分选程序。 胎盘组织单个细胞样品的制备 多点剪取胎盘全层组织约80 g，用Hank液反复漂洗，尽量除尽胎盘组织中的残留血液，将其剪碎，再用Hank液漂洗3次。加入0.025,胶原酶消化20分钟，用不锈钢网过滤，细胞滤液260×g离心5分钟，细胞沉淀用100 ml RPMI 1640悬浮混匀。 人胎盘组织单个核细胞(MNC)的分离 胎盘组织单个细胞悬液按4?1的比例加入6%羟乙基淀粉(6% HES)，混匀, 22?下静置45分钟至红细胞完全沉降。吸取富含单个核细胞的上层液，按1?3的比例加入Hank液， 400×g 离心8分钟。 弃上清，沉淀物用2 ml 含15% FCS的RPMI 1640悬浮，再按1?3的比例加入RBC裂解液，作用5分钟。 260×g离心5分钟，细胞沉淀物用含15% FCS的RPMI 1640洗涤、悬浮，经350目尼龙膜过滤。镜下计数MNC细胞，台盼蓝染色观察细胞活力(细胞活力应 90%)。MNC细胞样品进行FCM分析，并作为磁式分选的起始样品。脐血按1?1的比例加入Hank稀释后，同上述6% HES法分选MNC。 CD34，细胞及其亚群的免疫磁珠分选 按照免疫磁珠细胞分选试剂盒的分选策略，分选胎盘和脐血MNC为CD34+和CD34-细胞组分，进而再将CD34+细胞组分分选为CD34+CD38+、CD34+CD38- 2个细胞亚群。 细胞样品的流式细胞术分析 调整待测样品细胞浓度到1×106/ml，于含20 μl相应荧光标记单克隆抗体(CD34-PE、CD38-FITC)的上样管内加入100 μl细胞悬液，混匀，室温避光静置20分钟。每管加入2 ml RBC裂解液，混匀，室温静置10分钟， 180×g 离心5分钟，弃上清，重新悬浮细胞。每管加入2 ml含0.1, NaN3 的PBS,混匀， 180×g离心5分钟，弃上清，再悬浮细胞;每管加入0.5 ml 1,的多聚甲醛，混匀，2-8?避光放置，逐一上机分析。绝对计数则将细胞样品置于含微球的TruCOUNT管，其样品制备方法按试剂盒(ProCOUNTTM Progenitor Enumeration Kit)说明进行。采用Cell Quest软件对标记样品进行分析。单个核细胞和CD34+细胞绝对计数用ProCOUNT软件采集(每管采集2×104个细胞)和分析。MNC及CD34+细胞的回收率和富集度按下面公式计算 ,6,:CD34+细胞回收率(%)=,分离产物的总 细胞数×产物的CD34+(MNC)细胞纯度/起始标本CD34+(MNC)细胞总数,×100%CD34+细胞的富集度(%)=,分离产物中CD34+(MNC)细胞数/分离产物的总细胞数,×100%统计学分析 实验数据采用统计软件SPSS for Windos 10.0进行处理。如方差齐，采用t检验对各组之间进行两两比较;如方差不齐，则采用t' 检验。 结果 胎盘组织MNC数及CD34+细胞百分率 结果见附