乳链球菌乳糖酶基因的分子克隆

乳链球菌乳糖酶基因的分子克隆 262oo3.voL24.No.2恿品科学※基础研究 乳链球菌乳糖酶基因的分子克隆 冉雪琴,王嘉福,吴拥军,朱秋劲 (贵州大学生物技术学院,贵阳550025) 摘要:以LacDNA片段为探针,筛选了pUC19为载体构建的乳链球菌(S.Iactis)6030菌株的质粒DNA文库,得到插入 片段约5.0kb的阳性克隆,并对插入片段进行限制性酶切分析;用ONPG法测定了重组质粒在大肠杆菌细胞中乳糖酶 的表达水平. 关键词:乳链球菌;乳糖酶基因;分子克隆 Abstract:LactosemetabolisminStreptococcuslactis6030wasassociatedwithalargeplasmidbank.The genes encodingB—galactasefromtheplasmidofS.1actis6030wasclonedirlt0theVect0rpUCl9inEsherichia coli.The restrictionendonucleasemapofthe5.0kbPstIinsertfragmentwasanalyzed.Therecombinantplasmidw asex— pressedinEcolibyIPTGinduction,andthe13一galactaseproductionlevelandactivityweredeterminedbythe 0NPGmethod. Keywords:StreptococcusLactis;B—galactasegene;cloningandexpression 中图分类号:TS201.25文献标识码:A文章编号:1002—6630(2003)02—0026—03 乳糖酶又称为B一半乳糖苷酶,广泛分布于自然 界,包括动物组织,植物以及微生物等…,不同来源的 把乳糖水解为半乳 乳糖酶具有相同的专一性[21,即能 糖和葡萄糖,主要用作乳制品的助消化处理剂,以防治 “乳糖不耐症”,也可用作改善乳制品的外观和口感的 处理剂,避免乳糖在乳制品中结晶,并可增加甜度,此 外还可用于风味酸奶,糖浆,果汁,啤酒,糖果等的生产 中,. 乳链球菌(Lacticstreptococci)是工业上用于发酵 乳糖生产乳酸的重要微生物,通过B一半乳糖苷酶的 途径对乳糖进行代谢.研究表明,该菌代谢乳糖的能 力是不稳定的,乳糖代谢的基因与细胞中质粒DNA有 关,经过各种消除试剂的处理后,质粒DNA的缺失导 致乳糖酶II,lac因子III,磷酸一13一半乳糖苷酶及B一 半乳糖苷酶的缺失’.SusanK”等从SLactisLM0232 中分离出质粒DNApLM2001,经过分子克隆分析表 明,23和13kb的kpnI片段和29kbSstI片段可能与3 个磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统有关,而 7kb的SstI片段只与编码磷酸B一半乳糖甘酶基因有 关,Lyang—JaLee0等从乳杆菌中分离出质粒DNA,克 隆了7.9kb的PstI片段获得B—D一磷酸半乳糖苷酶 基因的重组体. 本文以乳链球菌6030为材料,对B一半乳糖苷酶 基因DNA片段进行分离和克隆. 1材料与方法 1.1细菌菌株和质粒 乳链球菌(S.Lactis)6030来源于北京轻工研究 所,菌体用M17培养基37~C培养.大肠杆菌DH5a为 本室保藏菌株,用LB培养基于37~C培养.质粒DNA pUC19购于北京华美生物工程公司,为克隆载体.质粒 pTN143(半乳糖苷酶基因重组质粒)由ThailandKas— esart大学Supal博士惠赠. 1.2试剂和工具酶 5一溴一4一氯一3一吲哚半乳糖苷(x—ga1),异丙 基p—D一硫代半乳糖苷(IPTG),邻硝基酚一B一半乳 糖苷(ONPG)等试剂及工具酶购于北京华美生物工程 公司;地高辛标记和检测试剂盒为Bochringer mannheim公司产品;DNA纯化试剂盒(Geneclean1I kit)为Biosystems公司产品;其他试剂为国产分析纯. 1.3质粒DNA制备与纯化,酶切,连接,转化等,均 按SambrookJ的方法操作,DNA片段的回收以玻璃 粉吸附,参照DNA纯化试剂盒说明程序进行. 1.4基因探针的制备 收稿日期:2002—09—13 作者简介:冉雪琴(1967一)女,副教授,博士,研究方向:原核生物基因表达调控. ※基础研究最品科学2003,V_oj.24,No.227 质粒pTN143经NdeI和EcoRI酶切,用2%琼脂糖 凝胶电泳分离,紫外灯下切含有392bpDNA片段的凝 胶条,DNA纯化试剂盒吸附洗脱,回收DNA片段,用 DIG一11一dUTP随机引物标记法标记DNA,制成地高 辛乳糖酶基因探针,探针的标记和检测参照Boehringer mannheim试剂盒说明程序. 1.5菌落原位及Southern印迹杂交 按照SambrookJ方法操作. 1.6重组质粒的表达及酶活力测定 重组质粒转化大肠杆菌,挑取单菌落接种LB培 养基,培养过夜后按1%比例接种于LB培养基,37? 培养至菌液的OD.oo达到0.4,0.6时,加IPTG至终 浓度为0.5,1mmol/L,37?诱导表达后,离心菌体, 重悬于PH7.4,20mmol/LTris—HC1中,超声波破菌, 然后于4?,1300r/min离心15rain,收集上清用于酶 活力的测定.酶活力测定参照WolfeTI.方法,1个酶活 力单位定义为每min每mgONPG释放1IxmolONP的 酶量 2结果 2.1重组质粒的构建 清亮裂解法提取乳链球菌6030质粒DNA,以1% 琼脂糖凝胶电泳分离后,经Southern印迹杂交分析,乳 链球菌6030中一条大于50kb的质粒DNA带与乳糖 酶DNA探针发生杂交反应;从琼脂糖凝胶中回收 S.Lact/s6030阳性质粒DNA带,经限制内切酶PstI切 割,然后与PstI酶切的质粒载体pUC19连接,热冲击 法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,用含氨苄青霉素, x—gal和IPTG的LB平板筛选重组子,随机挑取200 个含插入片段的白色菌落,用乳糖酶基因探针进行菌 I2l, 1,DNA/Hindlllmarker;2,p1.Z18/Pstl 图1重组质粒pLZ18限制酶分析和Southem印迹杂交 落原位杂交检测,获得3个(菌落18,菌落48和菌落 124)杂交阳性菌落,抽提质粒DNA进行酶切电泳分 析,3个阳性菌落均含有5.OkbPstI插入片段的重组质 粒,取其中一个重组质粒命名为pLZ18,经Southern印 迹杂交分析,插入片段与乳糖酶DNA探针呈现阳性杂 交反应,结果如图1. 2.2重组质粒限制酶切片分析 PLZ18DNA经PsrI酶切得到2.69kb载体片段和 5.Okb插入片段,经HindlII酶切得到2.55kb和 5.14kb两条酶切片段,HinclI酶切得到3.5kb和 4.16kb两条片段,经EcoRV酶切得到3.7kb和4.Okb 的两条片段,而EcoRI,BamHI,KpnI和Sal1分别酶切 后得到一条约7.69kb片段,经与PstI双酶切割后,分 别得到2.69kb的载体片段和5.Okb的插入片段(图 2).说明pLZ18插入片段含有一个HindlII位点,一个 HinclI位点和两个EcoRV位点,而EeoRI,BamHT,Kp— nI,SalI,XhoI,Sinai和Xbal均无酶切位点. 23.1— 9.3— 6.5一 童4.3— 23— 2.0— 23.1— 9.3一 6.5— 4.3— 2.3— 2.0— 1.11.DNA/Hindlllmarker 2.12.pLZ18/Pstl 3.pLZ18/EcoRI 4.pLZ18/Hindlll 5pLZ18/BarnH1 6.pLZI8/Kpnl 7.DIJZ18/PsiI+EeoRI 8.pLz18/Pstl+Hindlll 9pLZ18/Pst1+BamH1 10.pLZ18/Hpal 13.pLZ18/Sal1 14.DI18/Xhol 15.pLZ18/Smal 16.pLZ18/EeoRV 17.p1Z18/Xbal 18.pLZ18/Hincll 19.pLZ18/Pstl+EcoRV 20.pLZ18/Pstl+Hinell 21.pLZ18/Pstl+XhOl 22.DI上18/Hinell+Hpal 图2重组质粒pLZ18限制性酶切分析 2.3重组质粒的表达 重组质粒pLZ18转入大肠杆菌DH5a后,细胞分 别在含有诱导物IPTG和无IPTG的LB培养基中振荡 培养12h,用ONPG法测定细胞中的半乳糖苷酶活性, 282003,Vo1.24,No.2食品斛学※基础研究 同时设置DH5a,DH5a(pUC19)和乳链球菌菌株6030 为对照.结果见表1. 表1半乳糖苷酶活性测定 菌株DH5aDH5apLZ18pLZ18pUC19pUC19S.1actis (IPTG)(IPTG)(IPTG)6030 (IPTG) 酶活力0.0010.0010.0012.30.00110.66.4 (Unit/m1) 不加诱导剂时,DH5a,DH5a(pLZ18)和DH5a (pUC19)均不表达半乳糖苷酶,加诱导剂时DH5a不表 达,DH5a(pUC19)活性最高,而DH5a(pLZ18)活性较 低,与原始菌株S.Lactis6030的酶活力相差3倍左 右. 3讨论 本文将乳链球菌(S.Lactis)6030菌株含半乳糖苷 酶基因的5.Okb—PstI片段克隆于载体pUC19上,得到 克隆体pLZ18,对插入片段进行了限制酶图谱分析,测 定了pLZ18在大肠杆菌细胞DH5a中的表达情况,结 果说明,插入片段能与特异的半乳糖苷酶基因探针发 生杂交反应,插入片段中含有半乳糖苷酶基因序列;重 组质粒转入大肠杆菌细胞中,可以测出半乳糖苷酶的 活性,表明该基因能在大肠杆菌细胞中表达.大肠杆菌 DH5a(K12)染色体的lacpro区域是缺失的,在B一半 乳糖苷酶基因中第11,41氨基酸的核苷酸缺失,而质 粒pUC19含有大肠杆菌B一半乳糖苷酶基因的启动子 及编码仪肽链的DNA序列,质粒DNA的产物与细菌 的产物互补才能恢复酶的活性】.外源基因插入到 pUC19的多克隆位点后,使仪互补破坏,形成的是无 活性的酶,因此,重组质粒pLZ18转入大肠杆菌DH5et 所表达的乳糖酶是来源于乳链球菌(S.Lactis)6030的 插入片段,而非载体本身. 乳糖在S.Lactis中的利用是通过依赖磷酸烯醇式 丙酮酸(PEP)的磷酸转移酶系统(PTS)和渗透酶系 统(permease),PEP:PTS系统由酶II(EII1actose),外膜 蛋白酶111(FactorIIIlaccose)组成,乳糖在体内积累后, 先磷酸化,然后由磷酸一p一半孔糖苷酶(P—B—Ga1) 水解,产生D一葡萄糖和D一半乳糖一6一磷酸,葡萄 糖的代谢通过糖酵解途径,而半乳糖一6一磷酸则通过 D一塔格糖一6一磷酸途径代谢】.渗透酶系统是将乳 糖转运到细胞膜内,再由半乳糖苷酶水解为半乳糖和 葡萄糖.研究表明,乳糖的代谢途径在粪链球菌,乳链 球菌,金黄色葡萄球菌和乳酪乳杆菌等是相同的,乳糖 代谢基因的表达调控在这些微生物中是相当复杂的, 诱导物的不同,可得到不同的结果.如在S.Lact/s,酶 的表达受到生长物质的反馈抑制调控,酶的全部表达 只有在麦芽糖或核糖的培养基上观察到,,在 Lcasei,B一半乳糖的代谢所需的诱导物,即不是半乳 糖,也不是半乳糖一6一B磷酸.因此,pLZ18在大肠 杆菌细胞中的表达水平,可能与诱导物有关. 参考文献: 【1】杨贞耐.乳糖酶特性的研究[J1.食品科学,1990,10: 22—26. 【2】冉雪琴,王嘉福,朱秋劲等.乳链球菌乳糖利用阴性突变 体及其性质研究[J1.食品科学,1998,19(5):10—13. 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