谷丙转氨酶测定方法

谷丙转氨酶测定方法 一、赖式比色法 赖氏法并没有自己的酶活为单位定义。作者以当时卡门氏的速率法为准，测得多份不同ALT活力血清的ALT卡门氏单位。然后在赖氏比色法条件下，测得各份血清反应显色的吸光收值。将每份血清的卡门氏单位和对应比色法吸光值在坐标纸上作图。经过大量实验，对所有实验点以最佳曲线拟合，形成了比色法在某指定比色计上的标准曲线。坐标横轴为卡门氏单位，纵轴为吸光值，比色法结果和卡门氏速率法结果一致。继后作者以底物溶液及丙酮酸标准溶液，按照酶反应实际情况配制成不同浓度的丙酮酸标准溶液系列与2(4二硝基苯肼显色，并与速率法的结果比较。经多年反复实验，最后作者正式可通用于各种比色计的结果为ALT28卡门单位的鼍清在比色法条件下产生相当于0(1μmol丙酮酸，ALT57卡门单位的血清产生相当于0(2μmol丙酮酸，ALT97卡门单位? 的血清产生相当于0(3μmol丙酮酸。这样就使赖氏法标准曲，线上丙酮酸量和对应卡门单位确定下来。1970年将曲线延伸至150卡门单位。赖氏法报告的结果与速率法结果一致。没有条件采用速率法的实验室可以采用此法。 (一)赖氏比色法测定血清ALT 1、试剂 (1)Imol,L磷酸氢二钠:称取磷酸氢二钠(含两个结晶水)17.6g溶解于水中，并加水至1000ml，冰箱内保存。 (2)0.1mol,L磷酸二氢钾溶液:称取磷酸二氢钾13.6g溶解于水中，加水至1000ml，冰箱内保存。 (3) 0.1mol,l磷酸缓冲液(pH7.4):将420ml 0.1ml,L磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol,L磷酸二氢钾溶液混匀，置冰箱内保存。 (4) 底物缓冲液(DL—丙氨酸200mmol,L，α-酮戊二酸2m—mol,L):精确称取1.79g DL-丙氨酸和29(2mgα-酮戊二酸，先溶于约50ml 0.1mol,L磷酸缓冲液中，用lmol,L氢氧化钠(约0.5m1)调到pH7.4，再加磷酸缓冲液至100ml，置冰箱保存，可稳定两周。 底物中可加入麝香草酚(每升底物加0.9g)防腐，置冰箱中至少可保存一个月。分装安瓿灭菌后，室温至少可用3个月。 (5)lmmol/L 2.4二硝基苯肼溶液:称取19.8mg 2.4二硝基苯肼，溶解于100ml lmmol,L盐酸中，置室温保存。 (6)0.4mol,L氢氧化钠溶液:将16.0g氢氧化钠溶解于水中，并加水至1000ml，置带塞塑料试剂瓶内，室温可长期稳定。 (7)2mmol,L丙酮酸标准液;准确称取22.0mg丙酮酸钠(AR)，置于100ml容量瓶中，加0.05mol,L硫酸至刻度。 丙酮酸不稳定，容器开封后易聚合生成多聚丙酮酸，故宜使用可靠的市售丙酮酸标准液。 2(操作: 在测定前将底物在37?水浴中预温5分钟，然后按表1操作。 表1 ALT赖式法测定操作步骤 测定管 对照管 加入物 血清(ml) 0.1 0.1 底物溶液(ml) 0.5 — 混均后，在37?水浴箱中保温30分钟 2.4二硝基苯肼(ml) 0.5 0.5 底物溶液(ml) — 0.5 混均后，在37?水浴箱中保温20分钟 0.4mol/L氢氧化钠溶液(ml) 5.0 5.0 在505nm以蒸馏水调零点，读取各管的吸光值。测定管吸光值减去对照管吸光值后，从标准曲线查得ALT活力单位。 3、标准曲线绘制 (1)按表2顺序加液，制备AIT测定标准管 (2)各管加入2(4-二硝基苯肼溶液0(5ml，混匀，37?保温20分钟后，加入0(4mol,L氢氧化钠溶液5(0ml。 (3)均匀，放置10分钟后:在505nm比色:以蒸馏水调零，读取各管吸光度。各管吸光值减去“o”管吸光值，所得差值 表2 赖式法测定ALT标准曲线的操作步骤 管 号 加入物 4 0 1 2 3 0.1mol,L磷酸缓冲液(m1) 0.10 0.]0 0.10 0.10 0.10 2mmol,L丙酮酸标准液(m1) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 底物缓冲液(m1) 0.52 0.45 0.40 0.35 0.30 相当于酶活力(卡氏单位) 0 28 57 97 150 与对应的卡门氏酶活力单位作图。 4、参考值:5,25卡门氏单位 5、附注 卡门氏单位的定义系lml血清在卡门氏测定法规定的条件下，在温度32?，每分钟能使反应液在340nm波长下吸光值降低0(00lA为一个卡门氏单位。 (二)赖氏比色法测定AST 血清中AST作用于由门冬氨酸和α-酮戊二酸组成的底物，在一定的反应条件下，生成一定量的草酰乙酸，草酰乙酸在反应过程中又自行脱羟生成丙酮酸。在酶反应到达规定时间时，加入2(4-二硝基苯肼，在酸性条件下，终止酶反应，其后的反应原理同ALT测定。 1、试剂 (1)0(1mol,L磷酸盐缓冲液pH7(4 (2) lmmol,L 2(4二硝基苯肼溶液 ) 0(4mol,L氢氧化钠溶液 (3 (4) 2mmol,L丙酮酸标准液 以上四种试剂与ALT比色测定法相同。 (5) AST底物溶液(DL-门冬氨酸200mmol,L，α-酮戊二酸2mmol,L):称取α-酮戊二酸24(2mg和DL-门冬氨酸2(66g，置于一小烧杯内，加入1mol,L氢氧化钠约1(5ml溶解，加0(1mol,L磷酸缓冲液约50ml，调节pH7(4，将溶液移入100ml容量瓶中，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，置冰箱保存。 2、操作 同ALT比色测定法，但酶反应作用时间改为60分钟。 标准曲线绘制，按表3顺序加液，制备AST测定标准管 表3 赖氏法测定AST标准曲线的操作步骤 加入物(ml) 管 号 4 0 1 2 3 0(1mol/L磷酸盐缓冲液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 底物溶液 0.52 0.45 0.40 0.35 0.30 2mmol/L丙酮酸标准液 0 0.45 0.40 0.35 0.30 相当于酶活力(卡门单位) 0 24 61 114 190 其余步骤同ALT标准曲线的绘制 3、参考值: 8,28卡门氏单位 4、附注 (1)绘制好标推曲线是赖氏法的基础。赖氏法测定转氨酶的标准曲线是一条典型的曲线。能否作好这条曲线反映了检验人质的基本操作水平，因此必须反复练习。绘制标准曲线时的操作与反应条件应和实际测定时一致。更换试剂和温度变化时应重新绘制标准曲线。 (2)测定用的底物配制成应用液后，可根据用量，用试管或小瓶分装冰冻保存。测定时取出所需用量，用后将多余的弃去，以保证质量。切忌反复冻融使用。 (3)2(4-二硝基苯肼很易从试剂中析出，每天使用前应仔细观察，一旦发现沉淀，应立即弃去不用。 (4)每批0(4mol,L氢氧化钠掖应用草酸标准液标定，防止由于浓度差异引起显色读数不稳。 (5)每次测定时最好做三管试剂空白、一管28单位标准、一管57单位标准。如果试剂空白管对水的光吸收读数在绘制标准曲线时的空白管均值土0(015A范围内，说明试剂没有问题。两管标准管光吸收值减去空白管光吸收均值后的读数在绘制曲线读数土0(005A范围内，说明操作符合要求。最好能同时测定转氨酶控制物。 (6)丙酮酸和苯肼形成苯腙的反应温度，以及加碱后的显色温度和加液方法，都会影响显色反应。因此在进行一批标本测定时，底物及苯肼试剂应置于37?水浴箱预温，反应时间及加液方法力求一致，保温后置冷水浴中，待冷却后再比色。 (7)严重脂血、黄疸或溶血血清可能会引起测定管吸光值增高，此类标本，必须作血清标本对照管。 (8)酶活力超过150卡门氏单位时，应将血清用生理盐水稀释5,10倍后再行测定。