转反义B71基因治疗延长大鼠肝移植物存活时间研究

转反义B71基因治疗延长大鼠肝移植物存活时间研究 山东大学 博士学位论文 转反义B7-1基因治疗延长大鼠肝移植物存活时间的研究 姓名:米曰堂 申请学位级别:博士 专业:普通外科学 指导教师:徐克森;牛军 20080524原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 期:潲。 论文作者签名:越日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 日 期: 论文作者签名:拉导师签名:山东大学博上学位论文 论文一 共刺激分子反义真核表达载体的构建及鉴定 专业 普通外科 导师 徐克森教授牛军教授 研究生 米日堂 中文摘要 【研究背景】 终末期肝病为我国的常见病、多发病。肝脏移植是最佳治疗方法乃至唯一选 择。随着手术技术不断完善,以及免疫抑制剂的应用,肝脏移植得到广泛开展,但 肝脏移植后影响器官存活的最大障碍是受体对移植器官的排斥反应。抗排斥药物 能够达到抑制肝脏移植排斥反应的效果,尽管其疗效较好,但由于其带来的全身 免疫系统受抑、药物中毒及增加其他恶性肿瘤的发生率等严重的毒副作用,另外 应用抗排斥药物所带来的高昂的治疗费用,其应用仍有一定的局限性 。随着 分子生物学的发展以及对排斥反应认识的不断深入,近年来,人们将转基因技 术引入了器官移植领域,阻断共刺激分子诱导免疫耐受的基因治疗在肝脏移 植中已经成为一种新的途径。 选择在肝移植排斥反应发展过程中起重要作用的基因作为靶点,是肝脏移植 排斥反应转基因治疗的关键之一。随着对肝脏移植排斥反应发生、发展分子生物 学机制的研究深入,已发现在肝脏移植排斥反应的发病过程中涉及到多个共刺激 分子通路的过度表达。细胞活化需要双信号:第一信号是识别 上的抗原肽.复合体,这一信号决定了细胞活化特异性;第二信号是细胞 上的与上分子的结合形成的所谓.共刺激通路,它对维持和 进一步活化细胞至关重要;之后,活化的细胞表达分子,和 都是细胞上与结合的同源受体,与结合负调节细胞的活化‘。 当细胞只有第一信号而缺乏第二信号时将导致该细胞进入克隆无能状态,其 后果是表现为特异性的细胞免疫耐受。山东大学博士学位论文 器官移植抗排斥反应的基因治疗包括:?免疫抑制相关基因的克隆与表达。 人们试图通过向移植器官内转入特定目的基因其多数表达产物具有调节免疫及 炎症反应的活性,使移植器官表达转基因产物,而获得局限于移植器官的区域 性免疫抑制及炎症抑制。从而减缓排异反应和缺血再灌注损伤,并避免了应用免 疫抑制剂所带来的毒副作用。目前常用的涉及共刺激通路的转基因研究方法 为, 用编码的腺病毒载体行体外灌注移植物如肝脏、胰腺、心,移 植物局部表达的蛋白具有竞争性抑制.共刺激通路的作用 ,免疫抑制作用仅限于移植物,没有全身反应。?另外反义基因技术也被 用于器官移植时封闭免疫因子。可直接设计合成相关基因的反义寡核苷酸 片段或克隆反义基因片段导入细胞表达反义起作用。等‘刎表明体外用 反义细胞间粘附分子..寡核苷酸转染大鼠移植心脏,可以减轻慢排反 应。 反义基因疗法是基因治疗重要组成部分,其基本原理是根据核酸碱基互补配 对规律设计出能与靶基因特定区域结合的或,影响靶基因的表达,抑 制其功能。/是最早发现和研究最多最重要的共刺激分子通路,在多种实 体器官移植中阻断.表达对于诱导免疫耐受非常重要‘??,甚至能够达到降 低免疫药物用量或停用免疫抑止药物的作用。为了进一步研究.反义基因对 肝 脏移植免疫耐受的诱导作用,我们构建.的反义真核表达载体,为上述工作 的展开奠定一定的基础。 【目的】:构建能在真核细胞表达的含大鼠.反义基因片段的载体,为进一 步研究一反义基因抑制肝脏移植的排斥作用奠定基础。 【方法】: 和 .设计含有 酶切位点的一对引物,通过技术扩增 获取质粒载体上的目的片段,经过纯化的 . 和.载体经过连接,转化,鉴定而得到中间载体质 粒.。 .经 和 双酶切..一及.真核表达 载体后,使用连接酶连接,构建反义.表达载体。 和 酶切位点与全基 .真核表达载体的 因序列所含酶切位点相反. ?东大学博士学位论文 .构建好的重组质粒采用、酶切及测序鉴定。 【结果】: .反义基因重组体经过 和 双酶切和以重组体为进行 检测,得到左右的目的基因片段。 .基因测序证实所克隆的目的片段为,并成功连接到质粒载体 上,测序证明,插入的目的片段碱基序列与报道 的完全一致,且反方向插入载体。 【结论】: 成功构建了大鼠.反义真核表达载体,为研究器官移植时阻断 ?/共刺激通路抑制排斥反应的发生奠定了基础。 【关键词】:共刺激分子;.:反义基因:基因治疗;真核表达载体山东大学博士 学位论文??. : : .::. . . . , . .【..,.【’’.. . . . .【.. ., ?/东大学博士学位论文 ? . , .. .【’ ??.? . ,.. , / . .【 ’】. . .一./ ., ... ?.:? . :. ,山东大学博士学位论文 ? ,一 一?. , , . .一? 一 , 一 . . 缸 , . : . . . ? . . :?? . . : ;; ; ; 山东大学博上学位论文 中英文对照 抗原呈递细胞 ? 碱基对 ?细胞毒淋巴细胞相关抗 一 细胞毒淋巴细胞相关抗原融合蛋白 互补脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 ..细胞间粘附分子.主要组织相容性抗原复合物 分钟聚合酶链式反应核糖核酸 秒钟 细胞抗原受体 山东大学博士学位论文 论文一 共刺激分子反义真核表达载体的构建及鉴定 专业 普通外科 导师 徐克森教授牛军教授 研究生 米日堂 前 言 随着基因工程的发展,近年来,人们将转基因技术引入了器官移植领域。人 们试图通过向移植器官内转入特定目的基因其多数表达产物具有调节免疫 及炎 症反应的活性,使移植器官细胞表达转基因产物,而获得局限于移植物的区 域性 免疫抑制及炎症抑制。从而减缓排异反应和缺血再灌注损伤,并避免了应用 免疫 抑制剂所带来的毒副作用。其中,反义基因治疗作为一种可特异性阻断或调节致 病基因表达的技术手段,余年来不断发展、完善,在多学科疾病的治疗方面显 示了广阔的发展前景。 反义基因技术是指利用基因重组原理,构建表达载体,离体或在体内表达反 义,抑制或调节靶基因表达的一种方法。反义基因的长度可达几十至几千 个。该技术可针对在疾病发生、发展过程中发挥重要作用的生长因子、受体、 关键酶、原癌基因、抑癌基因或凋亡相关基因,通过反义基因技术特异性地进行 结合,封闭或调节其功能及产物表达,从而达到治疗目的。已发现在肝脏移植排 斥反应的发病过程中涉及到多个共刺激分子通路的过度表达。.共刺激通 路是发现最早和最重要的共刺激通路,它对维持和进一步活化细胞至关重要。 目前关于共刺激通路/在器官移植抗排斥反应中的研究主要集中在 应用一或应用腺病毒载体的办法在供肝冷保存期转染的转基 因治疗办法诱导免疫耐受。动物试验证实仅阻断..共刺激分子通路可以 诱发对移植器官的特发性免疫耐受。尚无通过构建共刺激分子反义基因阻断共刺 激分子通路诱导免疫耐受的相关研究。我们构建了.的反义真核表达载体,为 相关研究工作的展开奠定一定的基础. 东大学博士学位论文 材料与方法 . 材料 .质粒与菌株 质粒?由新西兰 教授惠赠。 该质粒以克隆载体为骨架,插入共刺激分子一全基因序列,重组质 粒全长. ,含有氨苄青霉素抗性基因。 真核表达载体反义基因载体:由新西兰 教授惠赠。含有氨苄青霉素抗性基因,目的基因的插入多克隆位点其酶 切位点和与共刺激分子?全基因序列所含酶切位点和 相反。 载体:购自公司。 菌株:为本室保存菌种,不具有氨苄青霉素抗性。可作为宿主菌供载 体扩增和原核表达。 .生化试剂 工具酶:、限制性内切酶及 连接酶购自大连宝生物公司。 分子量:.购自大连宝生物公司,由片段、 、、、、、构成;一购自 公司,由片段、、、、、构成。 质粒小量提取试剂盒和产物回收试剂盒购自德国公司。 .一般试剂 液体培养基:精解蛋白胨;酵母提取物;氯化钠;以双蒸水定 容至,/ 调值至.,最后定容至。高压蒸 汽灭菌,冷却至室温后,置于冰箱冷藏备用。 氨苄青霉素溶液:以灭菌双蒸水将氨苄青霉素粉末配制成/ 的储存液,保存于.的冰箱内备用。 液体培养基:高压灭菌后的液体培养基冷却至室温后,于超净工作台 上加入氨苄青霉素溶液,使其终浓度为./。贮存备用。 固体培养基:按每 液体培养基加入琼脂的比例配制成含% 琼脂的液体,高压灭菌,在液体未凝固之前,于超净工作台上倒入已高压灭 山东大学博士学位论文 菌的平皿中,待培养基凝固之后,置于冰箱冷藏备用。 固体培养基:按每 液体培养基加入琼脂的比例,配制成含 %琼脂的液体,高压灭菌,冷却至。时,于超净工作台上加入氨苄青霉 素溶液,使氨苄青霉素终浓度为,/。在液体未凝固之前,于超净工作 台上倒入已高压灭菌的平皿中,待培养基凝固之后,置于冰箱冷藏备用。 ./ 溶液:以双蒸水配制而成,高压蒸汽灭菌。 , 溶液:/葡萄糖,/ /., 溶解后高压灭菌。 ,%。 碱溶液.:./ ,/ 。 酸溶液.:/ 饱和酚.,氯仿,异戊醇:。 无水乙醇及%乙醇。 .,高压灭菌。 缓冲液:/?.,/ / 酶:溶解胰蛋白酶于的/的乙酸钠 .中。溶解后,水浴中煮沸,使酶失活。用/ 水溶液 的?调至.,贮存于.?备用。 :含有酶终浓度为/的缓冲液。 主要实验仪器 台式高速低温离心机。 .型高速台式离心机:上海医疗器械六厂产品。 电子天平、高速低温离心机。 数显电热恒温水浴箱:上海跃进医疗器械公司产品. .水浴振荡器:哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品。 型电泳仪:德国公司产品。 紫外分光光度仪:产品。 定量仪为公司产品。 凝胶自动成像系统:美国 公司产品。 .为产品. 凝胶定量分析软件 仪:产品。 微量移液器:法国公司产品. 山东大学博上学位论文 涡旋混合器:北京同正生物技术发展公司产品。 .方法 . .基因片段的扩增、回收及纯化 .. 扩增.基因片段 引物的设计与合成 根据公布的.全基因序列:,设计特异性针对 .基因片段的引物,引物序列经分析,与其它片段无同源性。 为便于重组子的连接,在上、下游引物的’端分别加上合适的酶切位点带下 划线部分。 .基因片段的引物序列: 上游引物 含酶切位点 : ’一鱼四篁?’ : 下游引物 含 酶切位点 ’鱼墅哟’ 以上引物均由上海博亚公司合成,引物粉末以灭菌双蒸水配制成./ 的母液,保存于.备用。使用前,以双蒸水稀释至/。 扩增.基因片段 以为模板,扩增一基因片段。在止的反应体 .止, ..,上下 系中进行:模板,反应缓冲液.., 游引物各.,耐热聚合酶.止。反应条件如下:预变性: ?变性,?退火,延伸,共循环次;最后延伸。 琼脂糖凝胶电泳鉴定产物: 取 扩增产物,加止×上样缓冲液,充分混匀,分别上样于% 含的琼脂糖凝胶,同时上样分子量 用于标定片段大 小。恒压电泳,在凝胶扫描仪上观察结果并拍照记录。 .. .基因片段的大量扩增、回收与纯化 反应大量扩增.基因片段: 以一为模板,反应体系增加至,体系中各成分见 本节..按比例均增加一倍,反应条件同上。.基因片段分别扩增管,东大学博 士学位论文 产物总体积为“。 产物的回收与纯化: 产物分别在两块含的%琼脂糖凝胶中电泳。紫外灯 将上述 下观察,待目的片段迁移至凝胶/左右的位置时,用清洁的手术刀切下含所需 区带的凝胶,利用公司凝胶回收试剂盒,分别回收基因片段。具 体步骤如下: .将上述切下的凝胶块放入管中,称量后,加入倍体积的 相当于,温浴,至凝胶块完全溶解。 .将倍体积异丙醇加至样品中混匀,以增加片段的回收量。 .将回收柱放入收集管中,再加入已溶样品,离心。 .弃去收集管中的残液,将回收柱放回原收集管中。 .再加. 至回收柱中,离心,进一步去除残余凝胶。 . 加入. 至回收柱中,离心。 .弃残液,离心。 至膜中央,静置 .将回收柱放置于另一清洁管中,加此 后,离心,即可回收目的基因片段。 . 用紫外分光光度计测定所回收产物的浓度及纯度。 .目的基因与中间载体的连接和重组子的转化 ..目的基因的酶切、回收与纯化 目的基因的酶切、回收与纯化: 以上通过大量扩增、回收纯化获得的.基因片段,分别经相应的内切酶 双酶切,酶切体系如下: 回收产物 此止 止 双蒸去离子水 止 总体积 “ 酶切反应在水浴中进行,后将.基因片段的全部酶切反应液分别 经%琼脂糖凝胶电泳,利用凝胶回收试剂盒回收酶切产物方法同..,产 山东大学博上学位论文 物最终溶于 中。 ..目的基因与载体的连接 所含的高效连接液将产物与质粒相 利用公司. 连。在微量管中配制连接反应体系如下,全量为: 一质粒 回收片段 灭菌双蒸水 总体积 :连接过夜。连接产物直接用于转化大肠杆菌 加入 感受态细胞。 ..重组质粒的转化 感受态菌的制备: .取.冻存菌,加入 液体培养基中,?水浴摇床, ,振荡培养过夜。 .用取菌环取活化菌液,划线接种于固体培养基平板上,孵箱内 培养过夜。 . 用取菌环挑取平板上的一个单菌落,接种于 液体培养基中, ?水浴摇床,,振荡培养过夜。 液体培养基中,?水浴摇床, .取过夜菌液.接种到 ,振荡培养?。 .菌液在冰上放置后,移入个管,每管菌液.,, ?离心。 弃上层培养液,离心管倒置,每管加入冰预冷的./ 溶液,吹打使菌体悬浮,冰上放置,,离心。 溶液 .弃上清,离心管倒置,每管加入冰预冷的./ .,轻轻吹打使菌体悬浮。 重组质粒的转化: ?在含/氨苄青霉素的平板上滴力 刖札的?和止 删的,用无菌棒均匀途布于整个平板表面,置至液体完 全消失。 山东大学博士学位论文 感受态细胞于无菌管中,轻轻混匀, ?取止连接产物与“ 冰上静置. ?热激,冰上放置. 液体培养基,置 ?加入 摇床培养. ?将菌液,离心,弃上清,剩余菌液吹打均匀涂布于 含有?的平板上,待菌液完全吸收后,翻转平板避光培养 过夜。 ?取出平板于放置数小时,使蓝色充分显色. ?鉴定带有重组质粒的克隆. 目的重组质粒的筛选和鉴定 ?挑取平板上分界清楚的几个白色菌落和一个蓝色菌落分别接种于 ./液体培养基中, 摇床培养舶。?抽提质粒按 ..试剂盒说 明书操作 . 感受态菌的培养。从平板培养基上挑选单菌落接种至 的含有 抗生素的液体培养基中,过夜培养。 .取的过夜培养菌液,, 离心分钟,弃上清。 剧烈振荡使菌体充分悬浮。 .用的含 .加入止的?轻轻地上下翻转混合.次,使菌体充分裂解, 形成透明溶液此步骤不宜超过分钟。 ,轻轻上下翻转混合.次,直至形 .加入的预冷的 成紧实凝集块,然后室温静置分钟。 .室温, 离心分钟,取上清。 安置于 上。 .将试剂盒中的 中,, .将上述操作步骤的上清液转移至 离心分 钟,弃滤液。 中,, .将的 加入 离心秒,弃滤液。 中,, .将的 加入 离心秒,弃滤液。 .重复操作步骤。 安置于新的. 膜的中央 .将 的离心管上,在 东大学博士学位论文 ,室温静置分钟。 处加入此预热至的 ., 离心分钟洗脱。 .. 自动测序与序列分析鉴定阳性重组子 构建好的重组子,将其相对应的菌液保存于含%甘油的培养基中。菌种 送至上海博亚公司进行自动测序。 自动测序 采用测序通用引物对插入片段进行测序。测序模板制备采用法,反应试剂选 用 , ,自动测序仪采用 。 序列分析 将测出的序列与公布的的相应序列进行比对,并用软件做同 源性分析。 经测序和序列分析,所插入片段的序列与中.基因序列 完全一致的重组质粒即为阳性重组子,分别命名为.,并保存相应 菌液于一备用。 .反义载体质粒的转化、扩增与提取 .. 感受态的制备同前面.. ..反义载体质粒的转化同前面.. ..试剂盒小量提取质粒同前面.. . 与反义载体的连接、转化及初步鉴定 ..质粒、的酶切及目的基因片段的回收、纯化 质粒一、的酶切 .在两个新的无菌管中,建立两个酶切体系,依次加入下列试剂: 管质粒... 止 “ 双蒸去离子水 止 山东大学博士学位论文 总体积 管止 质粒 眦 止 止 双蒸去离子水 皿 总体积 “ .混匀,短暂离心,置代水浴。 .取止反应液,.%琼脂糖凝胶电泳观察结果。 目的基因片段的回收与纯化 .取止反应液电泳观察酶切是否完全;如酶切完全,则将总反应液全部 经.%琼脂糖凝胶电泳。 .用清洁的手术刀切下含所需区带的凝胶,凝胶尽可能小。 .将凝胶块放入一个无色管中称量后,加入倍体积的骶至管中 一.。 .温浴,每轻振荡混匀一次,至凝胶块完全溶解。 .将倍体积异丙醇加至样品中混匀,以增加片段的回收量。 .将柱放入收集管中,再将已溶样品加至柱上,离心。 .弃去收集管中的残液,将柱放回原收集管中。 .再加.至柱上,离心,进一步去除残余凝胶。 .加入.至柱上,离心。 .弃残液,离心。 .将柱放置另一清洁离心管中,加至膜中央,静置 后,离心,即可回收目的基因片段。 :瑚,以计算浓度及纯度。 .用 测定、 ..目的基因与载体的连接、转化及初步鉴定 目的基因与载体的连接 在新的两个管中,依次加入下列试剂: 管 山东大学博上学位论文 质粒 ? 连接酶 连接酶 双蒸去离子水 ? 总体积 感受态细菌的制备及转化 同..。 阳性重组子的筛选鉴定 ?重组子的酶切筛选:随机挑选数个氨苄抗性菌落,分别小量扩增制备重组 质 粒。 .得到的阳性克隆用限制性内切酶单酶切,酶切体系如下:止 质粒 止 双蒸去离子水 总体积 .得到的阳性克隆用限制性内切酶酶切,酶切体系如下:止 质粒 儿 止 止 双蒸去离子水 总体积 , .混匀,短暂离心,水浴。 .取止反应液,%琼脂糖凝胶电泳,鉴定连接效果。 ..目的基因插入方向的鉴定和序列分析 东大学博士学位论文 自动测序 采用测序通用引物和对插入片段进行测序。测序模板制备采用法,反应试剂 选用 ,自动测序仪采 , 用 。 一 序列分析 对测出序列与克隆载体中的相应序列进行分析,并用、、软件做同源性分析。 ?东大学博上学位论文 职 甲 当日 木 . .基因片段的扩增、回收及纯化 . 扩增?基因片段 以.?为模板,扩增.基因,产物经%琼脂糖凝胶电泳, 结果显示获得长度为的基因片段图。 .回收、纯化产物 .基因大量扩增的产物经凝胶回收试剂盒回收、纯化,获得 高纯度.基因片段,回收产物经紫外分光光度计测定,纯度 /为.,浓度为/。 ...中间表达载体的构建及鉴定 .目的基因和载体的酶切回收 回收获得的.基因产物,分别经双酶切,产物经回收 后,紫外分光光度计测定纯度/为.,浓度为 /。 .阳性重组子的筛选和鉴定自动测序与序列分析 利用测序引物对酶切筛选阳性的重组子进行自动测序,并对结果 进行同源性分析,测序结果见图。同源性分析结果显示,所测序列与 公布的.基因序列:中的.基因片段%同源, 表明成功构建了包含.基因的真核表达载体一..。 . 反义.一真核表达载体的构建及鉴定 .目的基因和反义载体的酶切回收 片段的回收 和线性化载体 大量提取纯化质粒...和,酶切后对目的基因片段回 片段。一片段和线性 收纯化,得到大量.片段和线性化的 化的 经:稀释后,经 测量, 纯度/分别为.和.,浓度分别为/和/。 的连接。 质粒用于与. .目的基因与载体的连接、转化 目的基因与载体以摩尔比为:的最适比例进行连接反应,将 山东大学博士学位论文 连接产物转化感受态菌,涂布平板,。倒置培养过夜,可见涂有目 的基因连接产物转化菌的平板长出十余个均一的菌落,说明转化实验成功。 但是除阳性重组子以外,自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的基 因插 入载体形成的重组子均能转化细胞并形成菌落,只有未转化的宿主细胞不能 生 长,故必须进一步筛选阳性重组子。 。目的基因插入方向的鉴定和序列分析 ..阳性重组子的酶切鉴定 含反义的阳性重组子的酶切鉴定 随机挑取数个单一菌落,分别小量扩增并抽提重组质粒,经限制性内切酶 单酶切消化鉴定质粒的分子量图,经酶切鉴定插入 片段的大小,%琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图。双酶切,若 .插入载体,则会得到大小分别为的插入片段; 的和酶切位点和.本身所含的和酶切位点方向相反, 决定了插入的方向性为反义.。 图中可见,单酶切后分子量为.,双酶切后释放出 的插入片段,证实. 片段成功反向克隆入。 ..阳性重组子的鉴定自动测序与序列分析 利用两段通用的测序引物、对重组质粒.一进行部分测序 反应图,并与其基因序列标号为: 做同源性分析。结果显示该序 列包括.的’端,’端。该质粒中基因插入方向与.编码方 向相反,因此进一步证实限制性内切酶酶切鉴定方向的正确性。 测序结果见图。 东大学博士学位论文 讨 论 肝脏移植是终末期肝病的最佳治疗方法乃至唯一选择。随着手术技术不断完 善。以及免疫抑制剂的应用,肝脏移植得到广泛开展,但肝脏移植后影响器官存活 的最大障碍是受体对移植器官的排斥反应。抗排斥药物能够达到抑制肝脏移植后 排斥反应的效果,尽管其疗效较好,但由于其带来的全身免疫系统受抑、药物中 毒及增加其他感染性疾病和恶性肿瘤的发生率等严重的毒副作用,另外应用抗排 斥药物所带来的高昂的治疗费用,其应用仍有一定的局限性邡。 随着基因工程的发展,近年来,人们将转基因技术引入了器官移植领域。人 们试图通过向移植器官内转入特定目的基因其多数表达产物具有调节免疫及炎 症反应的活性,使移植器官表达转基因产物,而获得局限于移植物的区域性免疫 抑制及炎症抑制。从而减缓排异反应和缺血再灌注损伤,并避免了应用免疫抑制 剂所带来的毒副作用。器官移植中的抗排斥反应的基因治疗主要包括以下方面。 一免疫抑制相关基因的克隆与表达:在基因水平克隆和表达与抗排斥反应相关 的免疫抑制因子,使免疫抑制作用局部化、持续化、针对性强,具有较大的优越性。 二反义核酸技术一封闭免疫因子的作用:可直接设计合成相关基因的反义寡 核苷酸片段或克隆反义基因片段导入细胞表达反义起作用。三转基因技 术?异种移植的基因改造:异种移植往往需要对某些基因进行改造和修饰,转基 因技术为获得理想的转基因产物提供了技术保障。四基因敲除技术?诱导免 疫耐受:基因敲除技术能定向灭活某目标基因,在诱导免疫耐受和进行基因修饰 和改造方面具有重要意义。五基因工程抗体:结合免疫学中的单克隆抗体技术 和基因工程技术而产生的基因工程抗体是近年来基因治疗的又一研究热点。目前 已研究成功的基因工程抗体类型主要有:?小分子抗体:单链抗体、抗体等; ?人一鼠嵌合抗体;?重构抗体或人源化抗体;?重组全分子抗体。其中反义基 因技术在器官移植抗排斥反应中的应用为广大专业人士所关注,这一领域目前 正方兴未艾。具有良好的应用前景。 反义技术于年首次提出,其基本原理就是根据核酸碱基互补原则,用人 工合成或生物体表达的特定互补的或片段反义核酸以抑制或封闭专 一靶基因表达,抑制其功能。其中,或中包含编码蛋白质信息的一条 核苷酸序列称为正义链,与其互补配对的另一条称为反义链。在器官移植治疗中, 山东大学博士学位论文 反义核酸可以在转录或翻译水平阻断靶基因的异常表达,促进细胞正常分化或诱 导细胞凋亡,以达到治疗的目的。 关于肝脏移植排斥反应的转基因治疗,选择在肝移植排斥反应发展过程中起 重要作用的基因作为靶点,是基因治疗的关键之一。随着对肝脏移植排斥反应发 生、发展分子生物学机制的研究深入,已发现在肝脏移植排斥反应的发病过程中 涉及到多个共刺激分子通路的过度表达。细胞活化需要双信号‘.?;第一信号 是识别上的抗原肽复合体,这一信号决定了细胞活化特异性; 第二信号是细胞上的与上分子的结合形成的所谓.共刺激 通路,它对维持和进一步活化细胞至关重要;之后,活化的细胞表达分 子,和都是细胞上与结合的同源受体,与结合负调节 ’ 细胞的活化 。当细胞只有第一信号而缺乏第二信号时将导致该细胞进入 克隆无能状态,其后果是表现为特异性的细胞免疫耐受。 目前常用的涉及共刺激通路的转基因研究方法为,?用编码的 在大鼠心脏移植时应 病毒载体行体外灌注移植物。 用编码的腺病毒载体转染供体,能够达到降低心肌细胞坏死脱 落,减少心肌间质炎细胞的浸润,降低排斥反应的发生,延长移植物的存活达 术 后.天。 研究证实,在大鼠肾脏移植时,应用腺病毒载体编码的 转染供体时,单核细胞浸润减少,能够抑制混合淋巴细胞反应和和 ?冽应用逆转录病毒编 类免疫反应,达到延长移植物生存的目的。 码的转染供肝时,于转染后的,和天于肝脏和血中均检测到 。另外应用病毒载体编码的转染,在胰岛移植时也取得 理想的效果。移植物局部表达的蛋白具有竞争性抑制. 共刺激通路的作用。?另外反义基因技术也被用于器官移植时封闭免疫因子 ..。可直接设计合成相关基因的反义寡核苷酸片段或克隆反义基因片段导入 细胞表达反义起作用。等表明体外用反义细胞问粘附分子 ..寡核苷酸转染大鼠移植心脏,可以减轻慢排反应。 细胞共刺激通路在器官移植排斥反应过程中起到重要的作用。其中 ./共刺激通路为实验性器官移植中进行干预获得免疫酎受的主要的共 刺激通路?。应用蛋白或抗单克隆抗体阻断./共刺激通山东大学博上学位论 文 路能够诱导细胞的克隆无能状态,其后果是表现为特异性的细胞免疫耐型 驯。的研究表明阻断.共刺激通路可以降低移植器官的血管损害。 因此?共刺激分子通路是器官移植排斥反应基因治疗非常理想的靶点 之一。但应用蛋白或抗单克隆抗体阻断./共刺激通路的方 法需要不断给于抗体。应用基因工程的方法,运用反义基因技术在基因水平 高选 择性地抑制目的基因,可有效抑制目的基因的表达,这已经在动物肿瘤治疗,移植 等领域的治疗中得到了成功运用。研究针对共刺激通路?/中共刺激分子 .的反义基因技术,将可能为器官移植抑制排斥反应诱导免疫耐受的临床治疗 开拓一条新的路径。可以向移植器官转入特定的反义目的基因,使移植器官细胞 表达转基因产物,而获得局限于移植物的区域性免疫抑制及炎症抑制。从而减缓 排异反应和缺血再灌注损伤,并避免了应用免疫抑制剂所带来的毒副作用。 在本实验中,我们构建了大鼠一的反义基因真核表达载体,为明确上述 问奠定基础。本实验所采用的反义载体为真核表达载体,具有高效, 稳定转染哺乳动物细胞的能力,它具有以下几方面特点:?从结构上看,该质粒 具有很强的复制能力,可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞浆遗传给新生的子细 胞,这是保证目的基因稳定表达的因素之一;?具有多克隆位点,便于目的基因 的插入;?该载体具有氨苄抗性基因,可以采用氨苄青霉素来筛选已成功转染了 该载体的靶细胞。?含有高效的功能强大的启动子,可以使目的基因在增 殖的细胞中稳定表达;这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表 达。该实验以..为模板,采用扩增得到目的片段,长度 为,然后将其克隆到真核表达载体.中,经测序证实为目的片段, 然后该实验采用 和 双酶切得到目的片段,然后将其直接反向克隆到 和 和 酶切位点中。经和 反义表达载体的 酶切得到的目的片段长度与理论计算值相符。同时测序证明,插入的目的 片段碱基序列与报道的完全一致,且反方向插入载体。我们成功的构 建了.的反义真核质粒表达载体。通过构建的一反义真核表达载体,可以 将目的基因整合到宿主细胞的染色体中长期表达,从基因水平封闭其亚型的表达, 不需要重复给药,更加确切。在本研究后面的大鼠肝脏移植实验中证实,针对共 刺激分子.目的基因的反义基因具有较强地抑制内源性.表达的作用。 反义基因能用于器官移植的另一有利条件在于,供体器官植入前,有足够的 山东大学博士学位论文 时间在体外用高浓度、大体积、大剂量的反义基因载体处理移植器官,即在低温 下?、短时间数小时内进行孵育可避免热缺血损伤,又可使转基因载体 与靶细胞充分接触,之后可洗脱多余载体以减少其毒性,免疫原性及受体全 身 性的转染和表达。如此体外转染可以不影响其他组织器官,而获得高度特异 性的 器官转染。 本实验利用反义核酸技术,根据碱基互补原理,合成一段与靶互补的 和 酶切位点之间,构建 核苷酸,反向插入真核表达载体的 真核表达载体一几乎不会引起宿主的免疫反应,通过其包 含的反义共刺激分子片段,以期达到抑制共刺激分子基因表达。本实验成功 构建 的载体一方面可作为深入研究共刺激分子./通路功能的手段和工具。另 一方面在于从多方面探讨反义基因对./通路的抑制作用,全面评价 ./通路作为基因治疗的靶向基因的价值,为今后进一步的阻断共刺激分 子通路诱导器官移植免疫耐受的理论研究和临床应用奠定一定的基础。 展望: 反义基因治疗具有明显的优势:反义药物是与靶序列互补配对的片段,因 此具有较高的特异性;片段较短,合成方便、经济;多种体外及体内实验 证实反义药物可有效阻断或调节靶基因的表达;作用于局部,对全身影响较 小,极少产生严重的毒副反应。 近年来虽然反义技术飞速发展,但是仍然存在着一些不足之处:排斥反 应的机制仍然未彻底搞清楚;对与疾病直接相关的靶基因了解不够,特别是 绝大多数多基因疾病的致病基因尚待阐明,这将取决于人类基因组计划、功 能基 因组学的发展和完善;机体对载体有免疫反应;基因导人效率、基因表达 的时间与程度的可调控性都是需要进一步解决的重要问题;目的基因灌注后 的孵育时间和温度及灌注采用的途径门静脉、腔静脉或胆管尚待明确,局部 用 药时间与剂量有待在临床实践中不断摸索与总结。 随着移植分子病理生理学研究和基因工程技术的发展,这些问题的研究将会 进一步深入,相信反义药物在移植排斥反应治疗的应用前景也会更加广阔。 结论: 成功构建了大鼠.反义真核表达载体,为研究器官移植时阻断 ?/共刺激通路抑制排斥反应的发生奠定了基础。山东大学博士学位论文 附 录 图;扩增一?基因片段电泳图 警辫嗡姆灿搀些黜缈衅嵝避 出:血:龇.地址:出血:。】岫盘心:土,幽越拦溢血出:江垃 盐盥吐拙。』龇』出弛世。』瑚啦遗舡也姐二出墨羔.止立盐。出血盆 姓盐地&:避盐趣虹剑虹羔虹::&:城盐出必越舡吐酬蚓虹出 出?地??』型纽量氇必。必础.:近也删选 缸:趔。 图:对酶切筛选阳性的重组子.?进行自动测序山东大学博士学位论文 一? 了 图:重组表达载体小忱‰即的限制性酶切及扩增鉴定 .空载体;.重组载体;.?和双酶切:.产物 龆女鏖柑 。鼍攀篓斟誉:胃 黜嚣黼:, 立越畦:坳二地鼬《&龇础挫扯舭螂础池龇也衄捌必址 蛳渊拙坳《岫幽姆峰出四龇血出.衄盐地出 二:五基.【溢五溢试二五五菡孟盛 出越越,瑚』蚍出盆拙:幽迎蚣羔二巡越:』蚓?垃弛逝逝,鱼捌:? 蚴矧擞瓤触她邋幽必滥燃拙蛾 圈:测序引物、对反义重组质粒?的测序结果山东大学博上学位论文 参考文献 . .,. ;:?. .. ,?;:?. . , , . , . ;:?. .只 ,: .. ;:.. . . , ,, ;:?. . , , ., , ,/ .;:?. . , , , . . ;:?. . , , , ? . . ;:?. . , . , , / . .. ;: . ,. 。几, ,, , . ;:?. . . , , ,. 山东大学博士学位论文 . ; : . .。, ,? ;:?. . . , , .: .;:?. . , , , .? /? . ;:. ., , , . . . ;: . , . , . ; :. . . , . . ;:. . ., . ,. ;:. , 。. . ;:?. . . . , , 。 乒埴 . ; :. . ... . ? . . ;; 置山东大学博士学位论文 . ? , , , .一 . ;:?. .鼬 . , , ,? ;:?. . . , , , . . ; :. . , , ,: .. ;:?. . , , , . ?;: . . . ?, . ;:?. . . , , , ?; :.. . . , ,’ 只 ? . ;: .. . : . :, . : : , , ,;:. .【】 山东大学博上学位论文 论文二 转反义.基因治疗延长大鼠肝移植物存活时间的研究 专业 普通外科 导师 徐克森教授牛军教授 研究生 米日堂 中文摘要 【研究背景】 肝脏移植是治疗终末期肝病的最佳方法乃至唯一的选择。决定肝脏移植成败 的 关键问题之一是受体对移植器官的排斥反应,受体对移植器官的排异反应根 源于 淋巴细胞的激活和增生。近年研究发现,细胞的激活依赖于抗原递呈细胞 ,提呈的双重信号:由抗原本身所介导的第一信号和共刺激分子 介导的第二信掣?。第一信号是指呈递的抗原肽一主要 组织相容性复合物 ,,与特殊的细胞受体不 相结合,将信号传递给细胞,第一信号即被激活;第二信号是 共刺激信号,即来自上的家族分子与其在细胞上的受体家族分子 相结合产生的协同刺激信号。共刺激分子具有启动、维持以及调节活化级连 反应的 作用,决定了细胞是活化增殖,还是抑制或者转变为无反应状态,甚至凋亡 到。任何一种信号的缺乏都不能达到引起淋巴细胞的分化、增生以至 排斥移植器官的免疫应答反应。淋巴细胞所介导的排斥反应需要识别特异的 抗原 和细胞粘附分子介导的共刺激信号。在器官移植中对供体器官的抗原是难以 控制 和调节的,阻断共刺激信号已经被证实为有效的抑制排异反应的方法. 所有的样分子和它们的受体都是型跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族。 家族各成员之间有%.%氨基酸序列是相同的。.和?是 研究的最广泛的细胞协同刺激分子,二者分别结合的受体包括、。、 、.程序性死亡分子和、细胞弱化因子。所有这些协同信号分 子不仅提供促进细胞生长、分化和产生细胞因子的正向信号和,同山东大学 博上学位论文 时还能通过提供负向信号来限制、终止和/或减弱细胞应答、.和 。改变这些协同分子的表达可以调控免疫反应的强度和方向。目前常用的涉 及/共刺激通路的转基因研究方法为,用编码的病毒载体 行体外灌注移植物。 在大鼠心脏移植时应用编码 的腺病毒载体转染供体,能够达到降低心肌细胞坏死脱落,减少心肌间质炎 细胞的浸润,降低排斥反应的发生,延长移植物的存活达术后.天。 研究证实,在大鼠肾脏移植时,应用腺病毒载体编码的转染供体时,单核 细胞浸润减少,能够抑制混合淋巴细胞反应和和类免疫反应,达到延长移 植物生存的目的。 【应用逆转录病毒编码的转染供肝时,于转染 后的,和天于肝脏和血中均检测到。另外应用病毒载体编码的 转染,在胰岛移植时也取得理想的效果‘??.?。移植物局部表达的 蛋白具有竞争性抑制一共刺激通路的作用。 细胞共刺激通路在器官移植的排斥反应过程中起到重要的作用。其中 ./共刺激通路为实验性器官移植中进行干预获得免疫耐受的主要的共刺激 通路引。应用蛋白或抗单克隆抗体阻断./共刺激通路能 够诱导细胞的克隆无能状态,其后果是表现为特异性的细胞免疫耐受‘。 的研究表明阻断.共刺激通路可以降低移植器官的血管损害。因 此./共刺激分子通路是器官移植排斥反应基因治疗非常理想的靶点之一。 本实验利用反义.于体外冷保存期问转染供肝,对介导大鼠原位肝移植 急性排斥反应起关键作用的第二信号进行阻断,应用 和荧光免疫组织化 学技术分别检测.蛋白的表达情况,观察反义.对供体肝细胞共刺激分子 .表达的抑制作用。并应用免疫组织化学方法分别检测、 细胞的浸润 情况,从而进一步探讨反义.在肝移植排斥反应中所起的作用。就所查的文 献, 国内尚未检索到关于反义.应用与肝脏移植急性排斥反应进程关系研究的论 文 或报道。 【目的】:建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型,观察应用反义.在大 鼠肝移植术后对共刺激分子.和/ 细胞的影响及其抗排斥反应的作用, 探讨反义.疗法在对抗急性排斥反应中的作用。 【方法】:山东大学博士学位论文 .雄性近交系大鼠只,购自哈尔滨医科大学实验动物中心,体重 .;雄性近交系大鼠只,购自北京维通利华实验动物有限 公司.体重:?反义真核表达质粒为自己构建。 .采用“二袖套管法,建立?大鼠配对组合的急性排斥反 应模型,动物术前禁食不禁水。凡术后存活以上者纳入本研 究,并按随机表法分为组。组:对照组:. 模型, 供肝冷保存期间门静脉注射生理盐水,冷保存一个小时,共分为移植术 后,,,,组及生存情况观察组组,每组只大鼠;组: 模型,供肝 ?/组:. 冷保存期间门静脉注射?一 /只大鼠,同样分为组。然后 组动物分别于移植术后,,,,处死收集肝脏标本。 .一般情况观察观察组受体鼠术后的精神状态、运动、食欲、耳廓和皮肤 黄染程度,以及小便颜色。 .半定量:提取组织标本总蛋白,以肌动蛋白.为内参. 检测.蛋白的表达。 .肝移植急性排斥反应的组织病理学诊断,按系统将急性排斥的程度进 行评分,确定排斥活动性指数 ,。 .免疫组化:应用免疫组织化学法免疫荧光,检测肝脏组织中. 蛋白表达情况,检测、 细胞的浸润情况,分析、 细 胞的浸润与肝移植急性排斥反应的关系。 .观察试验组和对照组大鼠的长期生存情况,并进行.生存分析。 【结果】: .对照组动物于术后制起开始出现体重减轻,皮肤、耳廓黄染逐渐加深, 行动迟缓,尿色深黄, 以后精神明显萎靡,消瘦,毛发蓬乱、脱落; 在术后内出现死亡,尸检发现,肝脏脾脏肿胀严重,腹腔内腹水 不明显,套管及胆道支撑管无脱落、扭曲,无腹腔内出血等手术操作失 , 误致死因素。反义.组动物术后内亦表现为精神较差,体重减轻, 但尿色清亮,无明显皮肤、耳廓黄染;以后精神食欲逐渐恢复正常, 体重逐渐增加。 .各组间观察,可见.蛋白随术后时间的延长表达逐渐增强。组.东大学博士学 位论文 各时间点表达均较组相应时间点降低尸.。 细胞浸润逐渐增加,组各时 .各组问观察,随时间的延长、 间点、 细胞浸润均较组相应时间点减少.。 .随时间的延长逐渐增加,组各时间点均较组相应时间点降 低尸..。与、 细胞浸润明显相关.。 .实验组大鼠的平均生存期为.. ,对照组大鼠的平均生存期为 .. ,实验组大鼠的生存期较对照组明显延长.。 【结论】: ../共刺激通路成为抑制肝移植急性排斥反应的新靶点。 .肝窦内皮细胞作为抗原递呈细胞其共刺激分子一的表达明显上调;具有 诱导、 细胞向大鼠肝脏浸润的作用。 .应用反义.可以降低移植肝组织中?的表达,降低了肝窦内皮细胞 对、 细胞的诱导作用,有效抑制急性排异反应。 .反义基因技术局部应用能够影响靶基因的表达,抑制其功能。反义基因技 术将成为肝脏移植控制排斥反应研究的新方向。 【关键词】:反义基因:共刺激分子;排斥反应;肝脏移植;大鼠山东大学博士 学位论文?. ? ? : :.: ? :.,, . , .? . ?.。 , , , , .【 . . .【 . %一% . .? 、、、.. . 东大学博上学位论文 ,一、? . ?, ? ?. . .。. 。 ., . .?.’ . .,.一 . . .【 . ?.?/. , . .?. / . .. :/ ?? . 山东大学博士学位论文 : .. .一. .?.. . . . : . . 一 . ,,,. . . . . .. . 一 剖?. . .: .一,. .../ . . / .... 。 . %【东大学博士学位论文 . . / .. . , .?. ... : .?/. . / , . . ?一 / . . . : . . . .