逆转录-聚合酶链反应法检测消瘤保肺丸对E-cad、α-catenin及β-catenin表达的影响

逆转录-聚合酶链反应法检测消瘤保肺丸对E-cad、α-catenin及β-catenin表达的影响 逆转录-聚合酶链反应法检测消瘤保肺丸对 E-cad、α-catenin及β-catenin表达的影响 【摘要】 目的研究消瘤保肺丸对人肺癌PG细胞中E-cad、α-catenin及β-catenin表达的影响。方法采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检 -cad、α-catenin及β-catenin表达的情况。随机分为四组，即消瘤测E 保肺丸高剂量组、消瘤保肺丸低剂量组、对照组及空白组，分析电泳凝胶的灰度值。结果消瘤保肺丸高剂量组对3种分子的表达与空白组差异显著，(P<0.01)。消瘤保肺丸低剂量组α-catenin、β-catenin表达与空白组差异显著，(P<0.05);E-cad表达与空白组无显著差异，(P>0.05)。在α-catenin的表达与空白组差异显著，(P<0.05)。结论消瘤保肺丸对人肺癌PG细胞的E-cad、α-catenin及β-catenin的表达有明显影响，消瘤保肺丸对肺癌有一定的抑制作用，该实验为今后分子水平的进一步研究提供了依据。 【关键词】 逆转录-聚合酶链反应;消瘤保肺丸;E-cad、α-catenin及β-catenin;人肺癌PG细胞 上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)是维持上皮细胞形态及同种细胞间粘附连接的主要粘附分子。α-连接素(α-catenin)是E-cadherin连接细胞骨架所必需的成分，E-cadherin借助于α-catenin连接在E-cadherin与β-catenin之间[1]。大量的实验证实E-cad/catenins复合物介导细胞同质粘附而具有抑制肿瘤侵袭、转移的作用[2]。消瘤保肺丸中成药制剂，在临床用于肺癌已有多年，本篇通过PCR等相关手段研究消瘤保肺丸对 E-cadherin、α-catenin及β-catenin表达水平的影响，以探究中药抗癌转移的作用机制。 1材料与仪器 1.1药物消瘤保肺丸，仪器由河南省中医院院内制剂室提供，批号:20070514;清肺化痰丸，昆明中药厂有限公司，国药准字Z53020763，批号:080119。 1.2动物及瘤株PG 细胞(即人高转移性巨细胞肺癌细胞株)，由北京广安门医院提供;日本大耳白兔8只，购于郑州大学动物实验中心，动物合格证号:8cxk(豫)2005-2002。 1.3试剂RPMI-1640培养基，美国Gibco公司，编号1313945;优级胎牛血清，天津TBD公司，编号Df-1055;PCR试剂盒，北京Promega 公司，编号m-7501;RT Fsk-100试剂盒，日本Toyoto公司，编号76660C3;Trizol Chem Reagent，美国Gibco公司，编号1373341;DEPC原液，Sanland-International Inc，0532B73;Goldview染色剂，北京赛百盛公司，编号Jun-04-2010。 1.4仪器二氧化碳培养箱HF90型，上海力新HEAL FORCE;图像分析系统，大连Jim-X Scientific，编号D140;PCR GeneAmp System，美国Applied Biosystems，编号2700;电泳仪，北京市六一仪器厂，编号DYY-6C。 2方法 2.1 动物分组与模型建立 2.1.1动物分组8只健康日本大耳白兔，随机分为消瘤保肺丸高剂 量药物组、低剂量药物组，清肺化痰丸对照组，空白组4组，每组2只，每组每天早晚各给药1次，10 ml/kg/次，其中高、低剂量组分别相当于人等效剂量的10，5倍，空白组给以等量生理盐水，连续给药3 d。 物模型建立空白组(每组每天早晚各灌胃生理盐水1次，10 2.1.2动 ml/kg/次);对照组(每组每天早晚各灌胃1次，清肺化痰丸1 g/kg);消瘤保肺丸高剂量组(每组每天早晚各灌胃1次，共消瘤保肺丸1.5 g/kg);消瘤保肺丸低剂量组(每组每天早晚各灌胃1次，共消瘤保肺丸3 g/kg)。 2.2药物制备实验用药剂量参考药物说明书。清肺化痰丸:实验时以纯净水配制成10%的浓度供试;消瘤保肺丸:实验时以纯净水配制成10%的浓度供试。 2.3细胞培养复苏PG冻存细胞，培养基选用含20% 优级胎牛血清的RPMI-1640培养基，隔日或每日换液1次，直至基本贴满下壁，细胞传代，每培养瓶中加2 ml 0.25% 胰蛋白酶液使细胞脱壁，加入8 ml培养基，反复吹打后分入5 ml至新培养瓶。观察细胞生长状态良好，分别加入各组含药培养基，放37? CO2培养箱培养48 h。 特异性引物(E-cad、α-catenin、β-catenin)，采用 2.4引物 “Premier Primer 5”软件，由北京赛百盛生物技术公司制作。 2.5RNA提取观察细胞基本贴满，PBS缓冲液冲洗3次，每次5ml;加入Trizol Reagent 1 ml (1 ml/15 m2)，轻摇使Trizol充分接触瓶壁。将Trizol Reagent处理的细胞液转移至0.1% DEPC处理过的1.5 ml EP管(已消毒)，室温静置5 min，加入氯仿0.2 ml，剧烈混匀15 s，室温静置2~3 min。低温离心机中，4?下12 000 r/min离心15 min，上清液中 即含有所需之RNA。取上清液至另一1.5 ml EP管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min，4?下12 000 r/min离心15 min。弃上清，加入75% 冷乙醇1 ml(即先加入750 μl 预冷无水乙醇，再加入250 μl ?下9 000 r/min离心15 RNA Free H2O)。颠倒混匀，清洗，悬浮沉淀。4 min，弃上清，室温晾干。将RNA溶于30 μl RNA Free H2O中。 2.6逆转录反应(ReverTra Ace-α-TM)取200μl EP管，依次加入RNase Free H2O 6 μl,5×RT Buffer 4 μl,dNTP Mixture 2 μl,RNase Inhibitor 1 μl,Oligo(dT)20 1 μl,RNA 5μl,ReverTra Ace 1 μl;所得总反应体系共20μl，混匀后瞬间离心10 s，置PCR 仪中30? 预热10 min，温度依次调至:42? 20 min,99? 5 min,4 ? 5 min;按此过程顺序为一个循环。置低温离心机中，瞬间离心。合成所得cDNA于-80?保存。 2.7聚合酶链式反应(PCR)取200μl EP管，依次加入cDNA 1 μl， ，Taq酶 1 μl，10×PCR Buffer 5μl，MgCl2 3 μl，序列dNTP 1 μl 特异性上游引物1 μl，序列特异性下游引物1 μl，β-actin上游引物(600bp)1μl，β-actin下游引物(600bp)1 μl，RNA Free H2O 35 μl。所得反应体系共50 μl，混匀后瞬间离心10s。根据引物的不同，退火温度不同，如下:E-cadherin 52?;β-catenin 50?;α-catenin 53?;置PCR仪中温度依次调至:94? 2 min(预变性)，94? 30s(变性)，50,53? 30 s(退火)，72? 2 min(延伸)，72? 6 min(总延伸)，4 ? ?。第2，3，4步按顺序三步为一个循环，共进行32个循环。扩增所得DNA于-80?保存。 2.8凝胶电泳取琼脂糖0.26 g放入一干净三角烧杯中，加入RNA Free H2O 11.7 ml、10×TBE缓冲液1.3ml，共13 ml，将三角烧杯置于微波炉中，中火加热，见有气泡出现随即停止加热，反复7,8次，待琼脂糖完全溶解且无气泡产生时，置常温下冷却至稍烫手。带一次性手套，加入EB染色剂2 μl，摇匀。迅速将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置30 min。取10×TBE缓冲液6 ml，配成60 ml溶液加入电泳槽中，将凝胶完全淹没于电泳槽液体中，凝胶的孔朝向电泳槽负极。取加样缓冲液(Loading Buffer)1 μl滴于干净塑料手套上，滴加PCR产物DNA 8 ml与1 μl Loading Buffer混匀，加入凝胶的孔中;加入PCR Marker 5ml于凝胶另一孔中。点样顺序为PCR Marker、消瘤保肺丸高剂量组、消瘤保肺丸低剂量组、清肺化痰丸组、空白对照组。接通电源调至电压90V，电流300 mA，30 min。将凝胶置于图像记录分析系统中观察电泳荧光情况，拍照记录，应用加拿大Glyko公司BandScan 5.0软件分析，计算目的条 actin条带的灰度值之比。见图1及表1。 A-消高组B-消低组带与β- C-清肺组D-空白组图1 粘附分子在PG细胞中各组电泳结果表1电泳凝胶的灰度值之比 2.9统计采用SPSS 13.0统计软件处理，方法选用One-Way ANOVA检验。 3结果 消瘤保肺丸高剂量组对3种分子的表达与空白组差异显著，P <0.01。消瘤保肺丸低剂量组α-catenin、β-catenin表达与空白组差异显著，P <0.05;E-cadherin表达与空白组无显著差异，P >0.05。清肺化痰丸组大多与空白组无显著差异，只在α-catenin的表达与空白组 差异显著，P <0.05。 4讨论 粘附是肿瘤转移过程中的一个关键环节。肿瘤细胞表面粘附分子与肿瘤的侵袭、转移密切相关，通过表面粘附分子与细胞外基质或细胞等的配体相结合，启动了细胞内各种信号通路，同时也改变了肿瘤细胞的一些特性。孙宏新等[3]研究发现益肺清化膏可有效地提高 E-cad 的表达，降低 CD44v6 的表达水平。 本实验结果表明消瘤保肺丸对粘附分子在人PG肺癌细胞中的表达有显著影响。对E-cadherin的影响比较明显，在空白组表达相对消瘤保肺丸高剂量组降低，说明E-cadherin的表达与消瘤保肺丸高剂量作用成负相关，而α-catenin、β-catenin则与消瘤保肺丸高剂量作用成正相关。通过与空白组比较消瘤保肺丸对各个分子表达的影响较大，以高剂量作用 清肺化痰丸组α-catenin的表达与空白组有显著差异，说明该更为明显; 药中与消瘤保肺丸的化痰类药物可能对肺癌细胞有一定作用。 中成药消瘤保肺丸的干预作用在细胞实验中有所体现，我们通过对细胞进行干预，在RT-PCR的各个步骤，形成具有中药干预效应的肺癌细胞DNA，其表达效果与正常不同。细胞生长和增殖过程包括转录、逆转录的过程，是合成DNA的重要方面，由此可知，消瘤保肺丸在抗肿瘤侵袭和转移的过程对DNA合成有一定影响。发挥中医药抗肺癌转移的优势，加强复方、验方的分子生物学水平研究，对指导今后临床的用药有重要意义。 【参考文献】 [1]Jou T, Stewart DB, Stappert J, et al.Gentic and bio-chemical dissection of protein linkages in the cadherin-catenin complex[J]. Proc Natl Acad Sei,1995,92(11):5067. [2]杨剑锋，廖粤军.E-cadherin/catenins与肿瘤发生、侵袭及转移 [J].南华大学学报?医学版，2002，30(4):392. [3]孙宏新，蒋士卿，朴炳奎.益肺清化膏含药血清对肺癌细胞株的抑 制作用 [J].中医研究，2005，18(10):12.