枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

枯草芽孢杆菌高效达系统的构建 ,,第 卷 第 期西北农林科技大学学报 自 然 科 学 版 ,:,,,, ，:,,, ,,,,年 月,, ，:,,,:,,,:,,,,,:,，,,,:,，:，,,,,,,,,,,,,,,，,,,，,,,,,,,，,, , ,,,,,网 络 出 版 时 间 ,:,, ,:,,,:,:，，,,,,,,:,,,:,,,:,,,,,,,,::, ,,,,,,,网 络 出 版 地 址 ,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,:,,,:,,,,,,,,::,,,,,, , , 枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建 ,,,,，，，毕 台 飞胡 雄 斌宋巍杨 明 明 ,,榆 林 学 院 生 命 科 学 学 院 ，陕 西 榆 林 ,西北农林科技大 学 动物科技学院 ，陕 西 杨 凌 , ,,,:::, ,,,,:: ,,【】,,，，摘 要 目 的 优化枯草芽孢杆菌 启动子和表达宿主 构建其高效的表达系统 为 重 组 枯 ,,,,,,,,,,,,,,,, 。【】，草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础 方 法 以 半乳糖苷酶编码基因为报告基因 以诱导型的枯草芽孢杆 菌 麦 芽 ,β糖 操纵元启动子为调控元件 、大 肠 杆 菌 枯草芽孢杆菌穿 梭质粒为载体骨架 ，构建枯草芽孢杆菌高效表达载体 ， ,,,,,,,将 其 电 转 化 到 菌株后进行诱导表达试验 和葡萄糖抑制试验 。 利用同源重组的方法 ，用 枯 草 芽 孢 杆 ,,,,,,,,,,,,,,, 菌 组 成 型 启 动 子 替 换 了 野 生 型 菌 株 麦 芽 糖 操纵元的上游调控序列 ，得到优化重组表达宿主菌 ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ，将 转 入 后 ，对 优 化 的 表 达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验 。 分 ,,,,,,,,,,,:,，,,,,,,,,,,,,,,,,:,， , ，别 用 扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素 合成前期途径的谷氨 酰合成酶编码基因 构 建 其 表 ,:, ,,,,，, ,,,,,, 达 载 体 ，并 将 其 转 化 中进行诱导表达检测 。 【结 果 】成功构建了枯 草 芽 孢 杆 菌 高 效 表 达 载 体 ,,,,,,,,,,,:,， ，，,并 实 现 了 半乳糖苷酶的高效表达 其表达量占总可溶性蛋白的 质 量 分 数 的 麦 芽 糖 诱 导 ,,,,,,,,,,,,,,,ββ ,。 ，半 乳糖苷酶活达到成功获得了优化重组表达宿主菌 其 可 使半乳糖苷酶活性有大幅,,,,,，,,,,,,,,,,,:,，,β ，,，。 【】度提 高 在 质 量 分 数 麦 芽 糖 诱 导 半乳糖苷酶活达到 葡 萄糖的抑制作用明显减弱 结 论 通 ,,,,,,,,,,，β ，，。过 对 启 动子和表达宿主的优化 获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统 为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具 ,, ,,,关 键 词 枯 草 芽 孢 杆 菌 表 达 系 统 同 源 重 组 半 乳 糖 苷 酶 ,β,, ,,, 中 图 分 类 号 文 献 标 识 码 ,, ,, 文 章 编 号 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,::,,:, ,,,,:,,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,，，，,,,,,,,,，, ,,:,,,,,:，, ,,,,,，, ,,,,,,,,,,,, ,，，，，,，,::,,,,:，,,,,,,,,,,,,,,::,,,,,,,,,,,,,,，,,,,::::,,,,,::,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ，，，,，:，,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,:::,,,,,,, ,【】，,,,,,,,,:,,,,,,,,,:，,,，,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ，,，，,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,::,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，:,:,,，,,,,,, ,,,,,, 【】,，，,,,,:,,:,,,,，,，,,:,,,，,,,,,,,,:,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,，:,:,,， ,,,,, ，,,,，,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:，,,，,,,,:,,,:,:,,,，,,,,,,,，，,,,,:,,,,,:，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 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【】，,,,,:,,,,,:，,,,，,,，,,,,:，,,,,,,:,,,,,,,,,,,:,，,:,，,,,,,,，，,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,，，,,,,:,,,,,:，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,，,,,,,,,,,, β,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,:,,,,,,,,，，,,,,:,,,:,,,:,,,,,,,,, β ,,,,,,:,,,,,,,,,:,,,,,:，,,, :,,:,,,,:,,,,,，:,,,,,,,,，:,,,,,:,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,， ,,,,,β ,,，,,,,，,,,,,,,:, ,, ,,,,:,,:,,,,,,,,,,,:,,,,:,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,，,,,，:,,,,,,,,,, ,,，:,:,,,,,,:,,,,,,,,,,,，:,,,,,,，,,,,,,,,,,，,,,,，,,,,:,,,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,β 【】，，,，,,,,:,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,::,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,，，,,,,:,,,,,,,,,,,,,, ，,,, ,,,,,,,:,,,,,,,，:,,,,,,:,,,,,,,,::,,:，,,,,,,,,,,,,，,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，，,,,,:,,,,,,,:,:,::,,，,,:,,,,,,,:,,,,,,:,,,,,,,,,,, ,β ,,。枯 草 芽 孢 杆 菌 是 在 工 业 发 酵动物营养与饲料科研 平 台实验 室 保 存 ,,,,,,,,,,,,,,,, 、和微 生物 分子遗传 学领域具有重要价值的 革 兰 氏 阳 限 制 性 内 切 酶 连 接 酶生 化 试 剂 ,,,,, ,,,，, ,,,,,，，性 菌目 前 利 用 能 独 立 复 制 的 质 粒对该菌进行遗 和 基 因 组提取试剂盒购自 公 司 ,，:,,,,,,，, ,, ，、、,,传 改 造 是 构 建 枯 草 芽 孢 杆 菌 基 因 工 程 菌 的 重 要 聚 合 酶 蛋 白 质 分 子 质 量 标 准 购 ,，,,,,,:,,, ，、自 公 司 回 收 试 剂 盒 质 粒 小 量 提 取 试 剂方 ,,,,，, 。， ，,式 然 而 因 质 粒稳定性差和表达调控元 件 启 动 子盒 购 自 公 司 地高辛标记试剂盒 :,，,, ,,, ，，,的 强 度 低 等 限 制 因 素 导 致 现 有 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 遗 ,，,， ,,,,,,,,,,,,,,,,:,，,,:,,,:,,,,, ,,,,,,,。 ，传 操 作 系 统 并 不 完 善枯草 芽孢杆菌麦芽糖操 半 乳 吡 喃 购 自 公 司 分 析 纯 邻 硝 基 苯,,:,,,,,,β 糖 ,,纵 元 件 启 动 子 调 控 麦 芽 糖 操 纵 元 件 基 因 ,,,,,,, ,，,、,，苷邻 硝 基 苯 酚 :，,,,,,，,,,,:，,,,,,,,,、,编 码 磷 酸葡 萄 糖 苷 酶 编 码 调 节 蛋 ,,,,,,α,,,， ,，和 抗 生 素 购 自 公 司 亲 和 树 脂 ,,,,,,,,, ，,,白 ,,,,,,,，购 自 公 司 葡萄糖测定试剂盒 ，,，,,，:,,,， ,,,,。和 编 码 转 运 蛋 白 的 表 达 ,，,,,,:,，,:, ,,。购 自 上 海 名 典 生 物 有 限 公 司 ,:,,:,,:,，其 中 是 磷 酸 烯 酮 式 丙 酮 酸 糖 类 磷 酸 转 移 酶 引 物 及 寡 核 苷 酸 序 列 本 试 验 所 用 引 物 采 ,，,: ,,,,, ,,，，系 统的 组 分 参 与 麦 芽 糖 的 转 运 及 磷 酸 用 软 件 设 计 由 武 汉 中 和 生 物 科 技 有 限 ,,,,,,,:，，, ,，。 化 公 司 合 成 其编号和序列见表 测 序 引 物 为 和,,, ， 和磷 酸 麦 芽 糖 结 合 可 以 促 进启 动 子 的启 动 子 通 用 引 物 表 达 载 体 的 测 序 引 物 为 ,，,, ,,, ,, ,, ,,,。 转 录 而 葡 萄 糖 通 过 代 谢 产 物 阻 遏 位 点 能 反 ，:,,,，, ,,,:,,,馈 。抑 制 启 动 子启 动 子 是 一 个 诱 导 型 枯草芽孢杆菌的 培 养 ,,, ,, ,, ,, 枯 草 芽 孢 杆 菌 采 用 培 养 基 于 震 荡 培 的 ，, ,, ? ，，。可 控 启 动 子 其 诱 导 成 本 低 具 有 较 好 的 应 用 前 养 诱导表达试验中 的 枯草芽 孢 杆 菌 采用添 加 质 量 。 ,,景 本试 验选 择在枯草 芽孢杆菌中遗传稳定性 较 好 分 数 麦 芽 糖诱 导 物 的 培 养 基 于 震 荡 ,,，,,, ? ，的 载 体 以位 点 突 变 的 启 动 子 为 调 控 元 件 。,，, ,, 培 养 葡萄糖抑制试 验 中的枯 草 芽 孢 杆菌采 用 添 加 , 构 建 质 量 分 数 葡 萄 糖 的 培 养 基 于 震 荡 培 ,, ，, ,, ? 材 料 与 方 法 , ，表 达 载 体 通 过 同 源 重 组 改 造 枯 草 芽 孢 杆 菌 宿 主 。,养 重 组 枯 草 芽 孢 杆 菌 采 用 选 择 性 培 养 基 含 , ， 菌 材 料 ,,, ,,。氯 霉 素 的 培 养 基培 养 ,，，,,μ，缓 解 葡 萄 糖 对 目 标 基 因 表 达 的 抑 制 旨 在 获 得 枯 表 达 载 体 的 构 建菌 株 和 质 粒 试 验 所 用 菌 株 有 大 肠 杆 菌 ,,,,, ,,,,, ,,, , ，草 芽 孢 杆 菌 的 高 效 表 达 系 统 为 重 组 枯 草 芽 孢 杆 ,,,,克 隆 宿 主 和 菌枯 草 芽 孢 杆 菌 表 达 载 体 的 构 建 图 谱 见 ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ，,,:,,,，,α,,,，,菌株 的原 生 型 菌 株 质 粒 有 含 热 稳 定 性 半 ,，。 ，,,图 以 质 粒 为 模 板 用 引 物 ,,，,,, ,,,,,,,β,,, 。 研 究 与 应 用 奠 定 基 础 ,,,、,糖 苷 酶 基 因 含 启 动 ,,和 扩增片段长度为 ,,,,，,,, ,,,, 乳 ,,,,,,,,,:,,,,,,:, ,,:,,,,,子 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 麦 芽 糖 启 动 子 。 在 ,,,,,,,,,的 质 粒 和 含 抗 性 基 因 的 整 合 ,,,,,,,,, ,,, ,, 和 端 分 别 引 入 和 的 限 制 性 ,,,,′,′,,，,:,,，,? ? 体其 中 菌 株 及 质 粒 ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,载 , ，酶 切 位 点 后 克 隆 到 构 建 ,，,, ,,,,:，,，,,,, , ,和 由 美 国 俄 亥 俄 州 立 大 学 杆 菌 保 藏 中 心 ,， ,, 。，用 和 消 化 回 收 启 ,,,,,，,:,,，,,,,,?? ,,,，提 供 其 余 质 粒 和 菌种 均 由西北农林科技大,:,, ，,第 期毕 台 飞 等 枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建 ,,:, ，,,。，动 子 片 段 将 其 克 隆 到 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 穿 梭因回 收 目 的 基 因 片 段 经 和 ,,,，,:,,,, ,,?? 载 体 的 相 应 位 点 ，构 建 表 达 载 体 。双 酶 切 后 ，克 隆 于 表 达 载 体 的 下 ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, 用 引 物 游 ，构 建 基 因 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 表 达 载 体和 从 质 粒 中 扩 增 ,,,,,,:,,,， ,,:,,, ,,,,,,, 。的 嗜 热 脂 肪 芽 孢 杆 菌 热 稳 定 性 半 乳 糖 苷 酶 ,,,,,，,,,β 表 本试验所用引物及寡核苷酸序列 ,基 ,,,,,, ,，,,,，,,,,:,,:,,,,,:,,,,, , ,,名 称 限 制 性 内 切 酶 序 列 ,′,′ ? ，,,, ,,,,,,, ,,,,，,,,,:,,,,,, ,, ,,,,,:::,,:,,,,,,::,,,,: ? ,,,,,,,,,,, , ,,，,:, ,,,:,,,,,::,,::,::,,,,,,,,,,,,,: ? ，,:,,,,,,:,,,,,,,, ,,,,,,:,,,, ,,，,,,，,,,,,,:,,,,,:,,,,,,,,,,,,,::,: ,:,,,,, , ,,,,,，:,,,,, ::,,,,,:,:,,,,: ,,,,,,::,,,,::,,,，,, ? ?,,,,，:,:,, ,,,,:,:,::,,,: ,,,,,:::,,,,,,,,,,,,,,,,，,,? ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,:,: ,:,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,::,,,? ,,,,:,, ,,,,,,,,,,:,: ,,,,,:,:,,,,,,,,,,,,:,,:: ,,,? ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,:::,:,,:,,,,,,,,,,, ,,,,,,::,,,，? ,,:,, ,,,,,,?,，,:,,:,,:,,,,,,,,,,,, ,:,,,,,,:,,,::,? ,,,,,:,, ,,?,,,,，:,:,,,::,,,,,,, ,,,,,,::,,,,,,:,,? , ，,,,,，,,,, ,,,? ? ,,,,: ,,:,,:,,:,,,,,,,,,,,,,,,: , ,,:,, ,,,,,,,，,:,,? ,,,,,,:,,,,:::,,,,,,:,:,:, ,,,:,, ,,,,,:,, , ,,,，,:? ,,,,:,,:,,:,::,,:::,,, ,,,,,,,:,, ，:,, ,,,,? ,:,,,,,:,,,,,,,,,, ,,,:,,,,,,,:,, ? ,:,,:,,,:,:,:,: :,,,:,,:,,,,,,:,: , ,。注 序列中斜体部分为酶切位点 ,，:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,，,,,,:,,,,,,,,,，:,,,,,,:，:,,,,,,,,,:,,,,，:,,,,,,,,, 图 枯 草 芽 孢 杆 菌 半乳糖苷酶编码基因表达载体 的 构 建 图 ,,,,,, ,,β谱 ,,,, ::,,,，,,,,:,,，,,,,:,,，，,,,,:,,,,,:，,,,,,:,,,,,,,,,,, ,,, ,,重 组 菌 的 构 建中 麦 芽 糖 启 动 子 上 游 的 片 段 和 下 游,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,::,,, ,, , 。，的 片 段 回 收 和片 段 将 其 ,::,,,,,,,,, 采 用 文 献 ,,报 道 的 方 法 将 电 转 化 到,, ,,,,,,, , ，分 别 克 隆 到 中 得 到 ，菌 株 获 得 ,,,,:，,，,,,,, ,，,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,。采 用 选 择 性 培 养 基 培 养 重 组 菌 ,,,,,,,,,,,, 。和 ,，,,,,,,, ,,，，，，…，于 测 定 其 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,，以 的 基 因 组 为 模 板 用 ,,,,,,,,,,,,,,,,，, ，，值 绘 制 其 生 长 曲 线 并 用 显 ，引 物 和 扩 增 启 动 子 :,:,,,,:,,, ,,,,,,,,,,,,,,:,,,:, ,,, ,,, , ，。。将 其 克 隆 到 中 得 到 微 镜 观 察 其 菌 落 形 态 ,，,,,,,,:，,，,,,,, ,,,, ,,，表 达 的 检 测用 和 消 化 回 收 启 动 子,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,，,:,,，,,,,, ,,??,, ，片 段 克 隆 到 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 穿 梭 载 蛋 白 的 检 测 对 重 组 菌 ,,,,,,,, ,,,,,,， ,,,,, ,,, ,,，,,体进 行 诱 导 表 达 参 照 文 献 ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ，。 ，中 得 到 表 达 载 体 用 和,,，， 方 法 制 备 样 品 用 消 化垂 直 回 收克 隆 到,,,,,,,,,,,，,:, ,,:,,,,,,,,，:,,,, ,,, ? ,,,,，,,,,,,? ,,,? , ，。。中 构 建 的 表 达 载 体 电 泳 系 统 进 行 检 测 ,,,,,, ,,,:,，,, ,,,,,,， ,,, ，半 乳 糖 苷 酶 活 性 的 测 定 半 乳 糖 苷 以 的 基 因 组 为 模 板 用 ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,，, ββ 酶 活 ,,。引 物 和 扩 增 性 测 定 参 照 文 献 半 乳 糖 的 方 法 进 行 ,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,:, ,::,,,,,,,,, β 苷 ，的 表 达 盒 将 其 克 隆 到 ,,,,,, ,，,,,,,,:，,,, ,，酶 酶 活 定 义 为 下 每 催 化 生 成 ,,? ,,,:，,, ,，。中 得 到 :,，,,, ,,。的 酶 量 为 一 个 酶 活 单 位 ,:,:，,, ，,以 为 模 板 用 引 物 和蛋白的 非变性聚丙烯酰胺 凝 胶 电 泳 μ,,,,,, ,,,,,,,,, ， ,,,?,, , ,,,扩 增 的 壮 观 霉 素 抗 性 基 和 酶 谱 分 析参 考 文 献 ,,,,:,,,:, ,,,，,,,,,,,,,，,,:，,, ,,?,,,,, ,,，，，方 法 进 行 电 泳 后 将 凝 胶 用 因 将 其 克 隆 到 中 得 到,,，,,,,,,,,，, ,,,,，,,,,,,:， ,,,, ，,浸 泡 然 后 与 含 终 质 量 浓 度,,,,,，,,,,,,,,,,: 。,用 和 消 化 ,，,,,,,,,,，,,,,，,,,,,? ? ,,,,，的 装 入 杂 交 袋 水 浴 ，回 收基 因 ，克 隆 到 的 相 应 位 点 ，得 ,，,,,,,,，,,? ,,, ,,,,,,,,，,μ,,,, ,，,到后 利 用 凝 胶 成 像 系 统 成 ,,:,,,,,,,:,,,, 。，用 和 消 化 回 。,,,,,，,,,,，,,,,,像 ,,?,? ,,葡 萄 糖 抑 制 试 验 对 重 组 菌 ,,,,, ,,,,,,,,,, ，，收 将 其 克 隆 到 的 相 应 位 点 得 到 ,,，进 行 葡 萄 糖 抑 制 试 验 以 添 加 质 量,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,, , 。，分 数 麦 芽 糖 的 培 养 基 培 养 的 重 组 菌 用 和 消 化 回 收 ,,，,,,,,,,,,,,,,，,,,:,，,,,,? ? , ,,。，，为 对 照 采 用葡萄糖氧化酶法 表 达 盒 将 其 克 隆 到 中 构 建 整 合 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ，测 定 葡 萄 糖 含 量 具 体 操 作 参 照 葡 萄 糖 测 定 试 剂 ,,。载 体 图 :,，,,,, 盒 优 化 表 达 宿 主 的 构 建 ,,,,, ,,,,,,,,,,,:,， ，说 明 书 进 行 绘 制 产 酶 量 和 葡 萄 糖 含 量 随 时 间 的 ，利 用 线 性 化 整 合 载 体 电 转 化 ,,, :,，,,? , 。变 化 曲 线 ，，挑 选 有 壮 观 霉 素 抗 性 的 克 隆 得 ,,,,,,,,,,,,,,, 表 达 宿 主 的 构 建 及 表 达 效 ,,, ,,,,,,,,,,,:,， ，和 酶 切 检 测 和 检 测 ,,:, ,,,,,,:,,,,，,,,? ? ，到 重 组 子 提 取 其 基 因 组 进 行,,,,,,,,,, ,:,， 果 检 测 ,,检 测方法参考文献 和 地 高 辛 标,:,,,,，,,,:,,, , ,,在 的 表 达 调 控 试 验 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,记 试 剂 盒 说 明 书 进 行 。 用 引 物 和, ,,,,:,, ,?,,，，中麦芽糖对表 达 有 诱 导 作 用而 葡 萄糖对表达有抑 ，从 整 合 载 体 中 扩 增 包 括 壮 观 霉 ,,,,:,,:,，,,,, 。制作用发酵液 的 葡 萄 糖 含 量 与 产 酶 量 之 间 呈 现 彼 ，素 抗 性 基 因 和 启 动 子 的 片 段 作 为 探 针 ,,,,，, 。，消此长的趋势为了进一步提高表达效果将 ,,,,,用 ,。，地 高 辛 标 记 用 和消 化 基 因 组 ，,:,,,,,，,?? 基因 组 的 麦 芽 糖 操 纵 元 启动子用枯草芽 ,,,,,,,,,,。 进 行 检 测 从检测 正确的克隆子基 ,:,,,,，,,,:, , ，，孢杆菌组成型 启 动 子 替 换构 建优化表达宿主,,, ，因 组 中 扩 增 表 达 盒 送 上 海 华 大 基 因 有 限 公 ,,, 以解除葡萄糖 对 调 控 蛋 白 和 麦 芽 糖 转 运 蛋 白 的 反 馈司 。测 序 ，。 抑制进一步缓解葡萄糖对表达系统的抑制作用,,整 合 载 体 的 构 建优 化 表 达 宿 主 枯 草 芽 孢 杆 菌 ,,,,, ,,,,, :,，,, ,,,,,,,,,,,:,， ,,,,, ,, 。整 合 载 体 的 构 建 图 谱 见 图 提 取 表达效果的检测 将 表 达 载 体 电 转 化 到 重:,，,,,,,,,, ,,,,, ,,, ，，，的 基 因 组 以 其 为 模 板 用 组 引 组 宿 主 中 得 到 ,,,,,,,,,,,，,, ,,,,,,,,,,,:,， ,,,,,,,,,,,:,，,,,，，物 和 及 对 该 表 达 系 统 进 行 诱 导 表 达 试 验 并 进 ,,,,,，:,,,,,,，:,:,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, , ,，，,,和 分 别 扩 增 枯 草芽孢杆菌基因组 行 葡 萄 糖 抑 制 试 验 以 ,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,, ，,第 期毕 台 飞 等 枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建 ,,:, 。为 对 照 图 枯草芽孢杆菌整合载体 的 构 建 图 谱 ,:,，,, , ,,,, ::,,,，,,,,:,,，,,,,:,,,,,，,,,:,,,,,:，,,,,,:,,,,,,,,,,, ,,, 载体 和 的构建及表达和 转 化 ,,，,,,, ,,,,,,, ，,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,:,， ,,,,, ,,,,,,,, ，,,为进 一步检测 和展示表达系统对功能 基 因 的 表进 行 诱 导 表 达 以 为 ,,,,,,,,,,,:,， ,,,,,,,，达 效 果 本 研 究 分 别 构 建 大 肠 杆 菌 和 枯 草 芽 孢 杆 菌 ，，对 照 对 其 表 达 产 物 进 行 检 测 并 对 ,,,,,,， , 维 生 素 合 成 前 期 途 径 的 谷 氨 酰合 成 酶 编 ,诱导表 达发 酵 液 用紫外分光光度计 ,,,，, ,, ,,,,,, ，,,,, ，码 基 因的 表 达 载 体 并分 别将它们转化枯草 ，,在 波 长 处 进 ,,,, :，,,,:,:,:,,,,:,,,::,::,, ,: 。 芽 孢 杆 菌 进 行 表 达 提 取 大 肠 杆 菌 基 因 组 以 ，。行 扫 描 以确定目标产 物 的 表 达 ,，, ，,其 为 模 板 用 引 物 对 扩 ，,,,,，,,,,:,,,:, ,,,结 果 与 分 析 , 增 大 肠 杆 菌 维 生 素 合 成 前 期 途 径 的 谷 氨 酰,,,,, ,, 载 体 的 表 达 分 析 ,,,,,,,, ,,合 成 酶 编 码 基 因 提取枯草芽孢 杆 菌 基 ，, ，,,,, ,,，发酵曲线的测定 试 验 结 果 图 发 现,,,,, ,，,因 组 以 其 为 模 板 用 引 物 对 ,，,,,,,,,,,,,,, ,,在 扩 大 培 养 后 进 入 对,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,合 成 前 期 扩增枯草芽孢杆菌维生素 ,:,,,:, ,,, ，。，数生长期后 进 入 生 长 平 台 期和 的 ,,,,,,,,,。 途 径 的 谷 氨 酰合 成 酶 编 码 基 因 回 ,,，, ,,,,,,,,，，，镜检结果图显示时 菌群处于分裂期时 基 因 片 段 经 和收 和 ,,,,,,，,:, ，,,,, ,,,,,? ，，，。酶 切 后 分 别 克 隆 到 的 相 应 位 点 菌体开始变粗短时菌落出现了 较 多 的 芽 孢因 ,,,,,,,,, ,,,?, ，，，。。 此确定测定酶活性的取样时间为和得 到 表 达 载 体 和 将 ,,,,,,,, ,,，,,,, ,,,,,,,,,,, 图 ,,的 菌 落 形 态 ,,和 生 长 曲 线 ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,×,:: , ,,,,,,,, ,:，,:,:,,,,:,,,，,,,,:,×,::,,,，:,,,,,，,,:,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ，检 测 结 果 显 示 在 半 乳 糖 苷 酶 活 性 的 测 定 半 乳 糖 苷 分 析,,,,, ,,,,,,， ,:，, ,,，,, ,,,ββ 酶 活 ，，附 近 有 一 明 显 的 条 带 与 蛋 白 的 分 子 质 量 大性 测 定 结 果 显 示 添 加 质 量 分 数 麦 芽 糖 的 培 养 ,,, ,, , 小 一 致 ,图 ,，经 凝 胶 扫 描 分 析 显 示 ，的 表 达基在 整个 发酵过程 中的酶活性远高于未添 加 麦 芽 糖 ,,,,, ,，,,,， 的 培 养 基 在 时 酶 活 性 达 到 最 高 ,,, ,,, ,，。量 达 到 菌 体 总 可 溶 性 蛋 白 的 ,,,，,,,,,,,,,， 。 是 未 添 加 组 的 倍 添 加 质 量 分 数 葡 萄 糖 组 ，,,,, ,, 显 示 诱 导 的 蛋 白 ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, 的 酶 活 性 低 于 未 添 加 组 和 添 加 质 量 分 数 麦 芽 糖 ,,。提 取 物 有 明 显 的 条 带 图 分 析 显 ,,,,,,:，,, ,,, ，,,，，。示 表 达 的 蛋白具有生物活性 图 表 明 启 组 这 一 结 果 验 证 了 葡 萄 糖 对 启 动 子 的 抑 制 作 用 ,,,,:, 。动 子 、成 功 地 实 现 了的 表 达 检 测 和 ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,，，,,,,,,,,， ,,: ,,,,,,, ,,、,,,,图 半 乳 糖 苷 酶 的 和 酶 谱 分 析 结 ,,,,,,,,,，,，,,,,,,,,,，,:β果 ,,,,蛋白质分子质量标准 诱 导 的 蛋 白 提 取 物 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, , ,,,，,,,诱 导 的 蛋 白 提 取 物 诱 导 的 蛋 白 提 取 物 ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ，,,诱 导 的 蛋 白 提 取 物,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,，,,,,,,,, ,,,,,,， ,，,,,,,,,,， ,,,,,,:，,, :,,,,,,,:,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,, β ,,,, ,,,:,,,,,,，,,,,,,,，，,，,,,，:,,,,,，,，,,,:,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,，,,,,,,,:,:,,,,,,,，:,,,,,，,，,,,:,,,,,,,, ,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,，,,,,,,,:,:,,,,,,,,，:,,,,,，,，,,,:,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,，,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,,,,,,,, ，,,,,,,，:,,,,,，,，,,,:,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,，,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,, ，葡 萄 糖 抑 制 试 验 半 乳 糖 苷 酶 活 性 和 知 添 加 质 量 分 数 的 葡 萄 糖 试 验 组 在 和 ,,,,, ,,,,,,,,β 葡 。的酶活性明显低于添 加 质 量 分 数 麦 芽 糖 的 对 照萄 糖 含 量 随 时 间 的 变 化 曲 线 如 图 所 示 由 图 ,,,, 可 ，,第 期毕 台 飞 等 枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建 ,,:: ，，，组 分 别 是 对 照 组 的 和 说明添加葡萄糖 发 酵 液 中 葡 萄 糖 含 量 的 降 低 葡 萄 糖 添 加 组 酶 活 ,,, ,,, 性 ，对 启 动 子 有 抑 制 作 用 本 试 验 中 麦 芽 糖 启 动 子 的 。 显 著 增 加 ，,葡 萄 糖 抑 制 位 点 虽 有 突 变 但 抑 制 作 用 依 然 存 在 随 着 ,,,,,,图 在 添 加 葡 萄 糖 与 麦 芽 糖 培 养 基 中 半乳糖苷酶活性与葡萄糖含量的关 ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,β系 ,,,, ,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,:,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,β ,,，,,,,,, ,,,:,,,,,,,, ,,,:,,,,,,, ,,,,:,,,, ，。 优 化 表 达 系 统 的 构 建 及 诱 导 表 达 示 启动子整合到预期 的 位 点 从 ,,, ,,, ,,,,,,,,,, ，基因组 中 扩 增 表 达 盒测 序 结 优 化 表 达 宿 主 的 检 测 基 ,:,，,，, ,:, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,:,， ，，。,,果显示其读码框正确表明获得了重组的表达宿主 因 组 酶 切 和 检 测 结 果 图 显,，, ,:,,,,，,,,:,, , ,,,,图 基 因 组 的 酶 切 图 谱 和 检 测 结 果, ,,,,,,,,,,,:,， ,，, ,,:,,,,，,,,:,, , ,，, 和 双 酶 切 基 因 组 和 双 酶 切 基 因 组 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,， ,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,? ? ,? ? ,，,分 子 量 标 准 基 因 组 检 测 基 因 组 检 测 ,,,，, ,,,,,,,,,,,,,,:,，,，,,:,,,,，,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,:,,,,，,,,:,,, ,,,,,,,, ,,,,,,:, ,,,,,:,,,,，,,,:,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,:,，,,,, ,，,,,,,,,,,,,,,,,:,，,,，:,:,:,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，:,:,:,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,?? ,,,?? ,，,，,,,，, ,,，，,，,,,,:,,,,，,,,:,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,:,，,,,:,,,,，,,,:,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,，:,,,,,, ,,，检 测 结与 相 比 葡 萄 糖 对优 化 表 达 系 统 的 检 测 ,,,,, ,,,,,,， ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,，，,,果图 显 示 在优化的表达系 统 中 实 现半 乳 糖 苷 酶 活 性 的 ,,,,, ,,,,,,,,,,,:,， ,,,,,,,,β 抑 ，，。,,制作用大幅度下降 和 了 表 达 质 量 分 数 麦 芽 糖 的 诱 导 结 果 图 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,, ,, ，,,半 乳 糖 苷 表 明 的 ,,,,,,,,,,,:,， ,,,,,,,， β ,,，酶 活 性 高 于 其 在 ,,，的 半 乳 糖 苷 酶 活 性 分 别 为 和 ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,β 时 ，,，的 产 酶 量 最 高 达 到 较 ,,,,，,,,,,,,,,,,,,, ,, ,，,,而 的半 乳 糖 ,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,β 苷 ，,。酶 活 性 分 别 为 和 ,,。，,,,,,, ,,,,,， 提 高 了 葡 萄 糖 抑制试验结果表明 ,,,,,,:,, 图 ,,,, 半 乳 糖 苷 酶 的 及 其 活 性 分 析 ,,,,,,,,,,,,:,， ,,,,,,,,,,,，,,,,β,,,,,,, 蛋白质分子质量标准 诱 导 的 蛋 白 粗 提 物 ,,,,,,,,,,,,,,,,:,， ,,,,,,,, :, ,,诱 导 的 蛋 白 粗 提 物,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,，,,,，:,,,,,:,,,,,,,,:,,,,,,:,,,,,,,，:,,,,,,,,,,,,:,， ,,,,,,,,,,,, β ,,,, ,,,:,,,,,,，,,,,,,,，，,，,,,,:，,,,，:,,,,,，,，,,,:,,,,,,,,,,,,:,， ,,,,，,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,,, ,,,,:，,,,，:,,,,,，,，,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,, ,,，，合 成 途 径 和基因在枯草芽孢杆菌中的表达表 达 图 发 酵 液 呈 红 褐 色 为 ,,, ，,,,, ,,,,, ,,,,, 中 将 和 转 化 枯 草 芽 孢 ,,，,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,:。间 产 物 卟 林 类 物 质 所 致诱 导 表 达 发 酵 ,,,,, ,，，杆 菌 进 行 表 达 结 果 显 示 用 质 量 ,,,,,,,,,,,:,， ,,液 紫 外 分 光 光 度 计 波 长 扫 描 结 果 显 ,::,::,,:，分 数的 麦 芽 糖 诱 导种蛋白均获得可溶性 ,,,,,, ，,,。示 表 达 产 物 在 处 有 明 显 吸 收 峰 图 ,,:,, ,, 图 ,,,, 和 粗 蛋 白 的 及 诱导表达发酵液的扫描 分 析,，,,,, ,,,,, ,,,,,,，,,,,,, , , ,蛋白质分子质量标准 ,诱 导 的菌体粗蛋白提取物 ,诱 导 的菌体粗蛋白提取物 ,,,,，,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,诱 导 的粗蛋白提取物 对 照 ,,,,,,,,,,,,,:,，,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,，,,,,,,,:,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,:,,，:,,,,,,，,,,,,,,:,:,,,, , ,,,,,:,,,,,,，,,,,,,,，，,，,,:，,,,，:,,,,,，,，,,,:,，,,,,,,,,，,,,,,,,,,,，，,,,,:,:,,,,,,, ,,,,,:，,,,，:,,,,,，,，,,,:,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,，，,,,,:,:,,,,,,:，,,,，:,,,,,，,，,,,:,,,,,,,,,,,,:,，,:,,，:,,,,,,,,,,, ，,第 期毕 台 飞 等 枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建 ,,:, 生物素合成途径 和 维 生 素 前 期 途 径 的 多 个 蛋 白 ,,, 讨论 , 。 酶编码基因进行了高 效 表达 ，在 枯 草 芽 孢 杆菌基因工程 研 究 中 最 常 用 的 诱 。,,导 性 启 动 子 是和 是枯草芽孢杆菌 参 考 文 献 ,,, ，,,,, ,,, ,, ，，，,,，:,,,:,,,,,,,,,,,,，,,,,,,，:,,,,,,,，,,,:,,,,:,,,,,, 噬 菌 体 与 大 肠 杆 菌 乳 糖 操 纵 子 融 合 的 启 动 ,,:, ,,,，:,,,,:，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:，，,,,，,:，，:,,,,,,,,,,,,, ，,子 在诱 导 下 可 以 高 效 表 达 启 动 子 由 巨 ,,,, ，,,,,，，,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,:,,,,,,,,,,,,, ,,大 芽 孢 杆 菌 木 糖 基因的表达元件 ,,,,,,,，,,,,,, ，, ,，,,,，:,，,,,,,,,:,,,,:,,,,，,，,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,。构 建 而 成 由 自 己 编 码 的 阻 遏 蛋 白 严 格 ，,，,, ,,,,:,,,，,,,,,:，,,,,,,,,,,:，,,,，,,:,,,,,,,,,,,，,,,,, ,,, ,,，，,,,,,,:,,,,，:,,:,,,,,,,,,,,,:,,，，，, 控 制 表 达 与 启 动 子相 比 其 调 控 更 严 谨 诱 导 ,,,, ,, ，，,,,,,,,，,，,，,,,,:，,，,,,,,,,,,，,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,。效 率 更 高 这 个 启动子在枯草芽孢杆菌 中 应 用 很 ,,,，，,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,:，,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,, ，，、广 但 是 它 们 也 有 自 己 的 缺 点 其 诱 导 物 木 ,,,,,, ，，,，,,,,,,,,，,,,,,，,,,,,,,,,, ,,::,,,，,,,,:,,,,,,,,,, ，，糖 的 价 格 较 高 而 且有 毒 性 因此它们在实际 ,,,, ,,,,,:,:,,,,:,,,,，,,,,,,:，,,,,,,，:,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,, 。 ，应 用 中 有 很 大 的 局 限 性 在 本 试 验 中 笔 者 利 用 麦 ,,，,,:,,,,,:，,,:，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,，:,,,,，:,,:,,,,, 芽糖 启动 子构建表 达系统克服了这 个 启 动 子 的 局 ，,,,,::,,,,,,,,,,,,,, ,, ，,,,,,,,,，,,,,,,,,，:,,,,,,,,,,,,,:，,,:，,,,，:,,,,,:, :,,,。限 性 ,,,,,,,,,,,,,:，,,,,,,，:,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,，为 了 提 高 启 动 子 的 强 度 同 时 减小葡萄糖的抑 ，，,,,,,,::,,,,,,,,,,,,, ，制 作 用 本 研 究 对 中 麦芽糖启动子的葡萄 ,,,,, ,,, ，，，,,,:,,,,,,,:，:，,, ,,,,,,,: ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ，糖 抑 制 位 点 进 行 突 变 结 果 提 高 了 启 动 子 的 表 达 强 :,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,:， ，:,,,, ,,,，,,,:, ,,，:,,, ,, ,，。 度 但 是 葡 萄 糖 的 抑 制 现 象 依 然 存 在 这 是 由 枯 草 ,,,,:，,,,,:,,，:,,,,,，，,,,,:,:,,,,,,,,:，,,,,,,,,,,,,,,, ,, 。 芽孢 杆菌 麦芽糖操 纵元的调控特点决定的 因 为 虽 ,,，，,,,,,,,,,,,:,,,,，:,,:,,,,,,,,,:,,,,,? , ，，，,, ,,,,,:,: ，,,，,,,,, ,,,:,,:,,,,,,,,,,,,,,:,:, ,,, ,,,然 突 变 了 表 达 载 体 上 麦 芽 糖 启 动 子 本 身 的 位 ,,:,，，:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,:,,,,,,，,,,,,, ,，, ,,,,:，:,,,,:,，:,,,,,,,，,，,,,,,,,，:,, :,, ,,,,，,,,,, ，，点 解 除 了 葡 萄 糖 对 载 体 启 动 子 的 反 馈 抑 制 但 是 在 ,,，，,,,,,,,,,,，,:,,::,,,,,,,,:,,,,,, ，菌 体 的 调 控 系 统 中 麦 芽 糖 操 纵 元 启 动 子 对 作 为 正 ,, ，，，,,,:,,:,,,,，,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,, ,,,,调 控 组 分 的 磷酸麦 芽 糖和调节蛋 白仍然有调控作 ,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,，,,,，,,，,,，,,,,,,,,,,,,, ，用 葡 萄 糖 仍 然 可 以 通 过 对 麦 芽 糖 操 纵 元 启 动 子 的 ,,，，,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,:,,,:,,,,,,,,,,,, ，,,,,,, 抑 制 从 而 实 现 对 转 运 蛋 白 和 正 调 控 蛋 白 表 达 的 抑 ,, ，，,,,,,,，,,,,,,，,,,,,,,,，:,，,,,,:,,,,,:,,,,,,,,,,,,,α,, 。，制 此 外 在 麦 芽 糖 通 过 系 统 磷 酸 化 的 过 程 ,,, ,,,,,:,,,,,,,,,，,,,，,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,，中 葡 萄 糖 也 可 以 通 过 反 馈 抑 制 实 现 对 麦 芽 糖 操 纵 ,,，,,,,,,,,:，,,,,:,,，,,,,,:,,: ,,,,:,,，,，,,,,,,,,,,,:, 。元 的 调 控 ,,，，,,,,,,,,,,,，:,,:,,,,,,,:,,,,,,,,, ，本 试 验 通 过 替换麦芽糖操 纵 元 启 动 子 进 一 步 ,, ，，,:，,,,，:，,,,,, ,,,,,，,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,，。，,,,,,,,,,,,,:,,,,，,，,,,,:,,,，,,,, ,,:,,,,,,,,,,,，,,解 除 葡 萄 糖 的 抑 制 提 高 表 达 活 性 结 果 表 明 改 造 ,,,,, ，，,,,,,,,，:,,:,,,,,,,,,,:,,,,,, ，过 的 表 达 系 统 表 达 强 度 有 较 大 幅 度 的 提 高 而 且 对 ,, ，，，,,,,,,,，,，,,,,:,,,，,,,,,,,，,,,,,,,:,,,,,,,，,,,,，,, 。葡 萄 糖 抑 制 的 敏 感 性 降 低 用该表达系统 对 嗜 热 脂 ,,,,,,,:,:,,,,,,:,,,,，,,:,,,,,,,,,,,,, ,，,:,,,,,,,,, ,,,,,,,，肪 芽 孢 杆 菌 半 乳 糖 苷 酶 进 行 诱 导 表 达 结 果 表 ,β,,，，,,,,,, ,,，,,,,,,,,,,,,,,,:::,,,,,:,,,,:,, ，明 ,, ，，,,,:,,,,, ,，,,,,,，, ,,,,:,,:,, ,,,,:,,:,,:,，,,,,,, ,。，产 酶 量 达 到 而 笔 者 在 另 一 试 验 中 ,,,,,,,，,,,,,:,，,:,,，,,, ,:,,:,，,,,,,，,,, ,,,,,, :, ,,,,,，,,,,,, 用 大 肠杆 菌商用高效表 达 系 统 对进 ，,,,,,,, ,,,,，，,,,,,,,,，:,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ，，，,,,,,，,,，,,,,, ,,,,,,,,,:,:,,,，,:,,,,,,:,,,,,,,,,,,ü行 表 达 发 现 诱 导 后 酶 活 最 高 为 , ,,,, ,:, ,, ,,，，,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,，:,,:,,:::,,,,,,,:,,, ,,,，。 与 陈 卫 等的 报 道 一 致 表明与大肠杆菌 ,,，,, ，，，,,,:,,,,,，，:,,,,,,，,,,,,,,,,,::,,,,,,,，,,,,，,,:,,, ，商 用 表 达 系 统 相 比 本 试 验 构 建 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 ,,,,,，:,,:,,,,,,,,,,,,:,,，,,,,，:,,,,:,,,,,,,,,,,, ,表 ,,,,,,,,，,,,:,,，,，,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,，,,, ,,,,,,，,达 系 统 也 具 有 较 高 的 表 达 水 平 且 诱 导 物 本 身 是 ，，,,,,,,,::,,,,,,,,,,,, ,,下 转 第 页 ,,,，。发 酵 碳 源价 格 低 廉 在实际应用中具有优势 本研 究构建的 表达系统可作为目标基 因 在 枯 草 ,, ,,:,,,,,,,,:,,,,:,,，,,,,:,,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,，,,,,,,:,,,,,, ,,，，,, ，，，蒲 友 光 彭 巧 玲 王 志 方 等 乌龟线粒体全基因组序列 和 结 构 ,,,:,,,:,，,:,::,,,,,,:,,:,,，,,,,，, ,,,,,,,, ,,, , ,,,，，,,，，,,,，，分 析 动 物 学 报 ,,,,,,,::,, ，,,,，:,:,，,,,:, ,,::,:，,,,,,, ,,,,::,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ，,,,, ，，，,,:,,:,,，,,,,,:,,:,,,,,，,,,,,,,，,,，,,,,,,:，,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:，,,,,,,,:,:,,,,,:,,,,, ,:,,,, , ,,，，,,,,,,:,,,,,，,,,,,:,,,,,,,,,,,,::,,,,,,,,,,,, ,, ,,,:,,:,,，,,,,,:,,:,,,, :,,,,,, ,,，,,，,,,,,:,,,,，,,,,,, ,,，，,,,:,,,,,,，,,,,,, ,,,,,,,::,:,,, ,,,,,,,::,,,,,,,,,,, ,, 彭 作 刚 ，张 耀 光 ，何 舜 平 ，等 从 细 胞 色 素 基 因 序 列 变 异 分 析 ,,,,,,,,,,,:,,,,,, ,,，，,,,中 国 鲇 形 目 鱼 类 的 系 统 发 育 遗 传 学 报 ,,,::,,,, ,, ，，， 张 晓 梅 单 祥 年 施 燕 峰 等 小麂线粒体基因组全序列 的 测 定,,,,,,,,,,, ,,，，,,,与 分 析 遗 传 ,,,::,,,,,,,,,,,, ，，，,,,,,,,,,, ,，,,,,,,,,,,,:,,:,:,,,,,, ,,,, ,,,，，，,,,,, ,,,,,, ，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:，,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,，，,,,，:, ,,,:,,:,,，,,,,,:,,，:,,,,,,,,,,,,, :,:,,,,,,,,,,，,,,,,, ,,,:,,:,,，,,,,,:,, ,,，,，,,,,,,,, ,,，，,,,,,,,,,,,::,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,, ,,，，,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,::,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,，，,, 李林 梁 宏 伟 李 忠 ，等 瓦氏黄颡鱼线粒体全基因 组 序 列 ,,,,, ,,赵 凯 鱼 类 线 粒 体 及其在分子系统学中的 ,,,,，,,,,，,,,，，,,,分析及系统进化 遗 传 ,,,:,,,,,,,,,,,, ,,,,，，,,,,,,应 用 青 海 大 学 学 报 自 然 科 学 版 ,,,::,,,,,,,,, ,，，，，,，，,,,， ,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,, :,,,,,,,,,:，,,,,:,,:,,，,,,,，,,,,，,:,,,,,,,,,,,,,,,:, ,,,:,,,,,,,:,,,,,,,,:,,:,,，,,,,,:,,:,,,,,,:,,，,,,,,,,,,,,,, ,,, 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