两种不同玻璃化冷冻方案对小鼠卵母细胞纺锤体的影响

两种不同玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞纺锤体的影响 两种不同玻璃化冷冻方案对小鼠卵母细胞 纺锤体的影响 ? l076? 第l2卷第l2期 2006年l2月 中华男科学杂志 NationalJournalofAndrology V01.12No.12 Dec.2006 ? 论着? 两种不同玻璃化冷冻方案对小鼠卵母细胞纺锤体的影响 孙海翔,胡娅莉,陈林君,张宁媛,徐志鹏 (南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心,江苏南京210008) 摘要:目的:探讨两种不同的玻璃化冷冻方案对小鼠第二次减数分裂中期卵母细胞纺锤体的影响.方法:实 验分3组:方案A组,方案B组和对照组(新鲜卵母细胞).均以冷冻环为载体,方案A组用乙二醇(EG)作为冷冻 保护剂,方案B组用乙二醇联合二甲亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂,用直接投液氮高速制冷冷冻小鼠卵母细胞;解 冻后3h小鼠卵母细胞经固定并用间接免疫荧光法染色微管及染色体,观察纺锤体及染色体的形态.结果:两 种玻璃化冷冻方案中,卵母细胞解冻后的存活率差异无显着性(80.3%87.5%,P>0.05);经玻璃化冷冻方案A 冷冻的卵母细胞解冻后具有完整纺锤体结构的卵母细胞数显着低于对照组和方案B组(15.2%78.7%,15.2% 77.5%,P<0.05),后两者差异无显着性(78.7%77.5%,P>0.05);方案A组解冻后 具有正常染色体的卵母 细胞数显着低于对照组和方案B组(17.4%似76.6%,17.4%72.5%,P<0.05),后两 者差异无显着性(76.6% 72.5%,P>0.05);方案A组异常染色体数显着高于对照组和方案B组 (82.6%19.1%,82.6%s27.5%,P <0.05),后两者差异无显着性(19.1%27.5%,P>0.05).结论:改变玻璃化冷冻方 案有利于保持解冻后小 鼠卵母细胞纺锤体结构完整性. 关键词:卵母细胞;纺锤体;玻璃化冷冻;小鼠 中图分类号:文献标识码:A文章编号:1009—3591(2006)12—1076-05 InfluenceofTwoDifferentVitrificationCryopreservationMethodsonSpindlesofMouseOocytes SUNHai—xiang,HUYa—li,CHENLin—jun,ZHANGNing—yuan,XUZhi—peng ReproductiveMedicineCenter,DrumTowerHospitalAffiliatedtoNangUniversityMedicalCollege,Nang,Jian— gsu210008,China Correspondenceto:SUNHai—xiang,E—mail:stevensunz@163.com Abstract:Objective:ToinvestigatetheinfluenceoftwodifferentvitroficationcryopreservationmethodsonthespindlesofmouseMII oocytes.Methods:Threegroupswereincludedintheexperiment,GroupA,GroupBandthecontrol(freshoocytes).Mouseoocytes werevitrifiedbyusingcryoloop,withethyleneglycol(EG)inGroupAandwithEG+dimethylsulphoxide(DMSO)inGroupBas cryoprotectants,andthentheoocyteswereplaceddirectlyintoliquidnitrogen.Threehoursafterthefrozenoocyteswerethawedthey werefixed,andthemicrotubulinandchromosomewerestainedbyindirectimmunofluoreseentmethod.Results:Thesurvivalratesof theoocytesaftertreatedbythetwovitrificationcryopreservationmethodshadnodifference( 80.3%似87.5%,P>0.05).Therateof theintactspindlesinGroupAwasmuchlowerthanthatofthecontrolandGroupB(15.2%78.7%,15.2%/)s77.5%,P< 0.05).Buttherewasnodifferencebetweenthelattertwogroups(78.7%77.5%,P>0.05).Theoocyteswithnormalchromo— someinGroupAweremuchlessthaninthecontrolandGroupB(17.4%76.6%,17.4%掷 72.5%,P<0.05),withnodiffer— encebetweenthelattertwogroups(76.6%s72.5%,P>0.05);TheoocyteswithabnormalchromosomeweremoreinGroupAthan inthecontrolandGroupB(82.6%19.1%,82.6%27.5%,P<0.05),withnodifferencebetweenthelattertwogroups 收稿日期: 基金项目: 作者简介: 通讯作者: 2006-06-05;修回日期:2006-09—10 江苏省自然科学基金(BK2004095) 孙海翔(1966一),男,江苏海安县人,副主任医师,博士研究生,从事生殖医学专业. 孙海翔,E—mail:stevensunz@163.corn 第12期孙海翔等两种不同玻璃化冷冻方案对小鼠卵母细胞纺锤体的影响?1077? (19.1%27.5%.P>0.05).Conclusion:Thechangedvitrificationcryopreservationmethodhelpsconservetheintactspindle configurationofmouseoocytes.NatlJAndrol,2006,12(12):1076?1079,1083 Keywords:oocyte;spindle;vitrification;mouse 玻璃化冷冻是一种简单,高效,快速的卵母细胞 或胚胎冷冻方法J.在超低温条件下,玻璃化冷冻 保护液渗入到卵母细胞内部,使之处于玻璃化状态 而不形成冰晶,因此对卵母细胞的损伤较小.卵子 的微管系统对冷冻过程中的冷冻保护剂和温度非常 敏感,不同的玻璃化冷冻方案对卵母细胞的冷冻保 护差异很大.由于人类卵母细胞的研究受到取材和 伦理的限制,小鼠卵母细胞已作为被广泛应用的模 型,代替人类卵母细胞用于研究卵母细胞的纺锤体 结构. 本实验采用两种玻璃化冷冻方案,用免疫荧光 方法观察玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞纺锤体和染色 体的损伤情况,为其他哺乳动物和人卵母细胞的玻 璃化冷冻提供实验基础. 1材料与方法 1.1卵母细胞收集实验动物为4,5周龄雌性 ICR系小鼠,饲养于本院实验动物中心.选择发情 前期小鼠,于下午18:00点腹腔注射孕马血清促性 腺激素(PMSG10IU,宁波第二激素厂),48h后注射 人绒毛膜促性腺激素(hCG,宁波第二激素厂)10 Iu,进行超促排卵.注射hCG后13h断颈椎处死小 鼠,分离输卵管置于含有配子培养液(Gamete30. Vitrolife)的培养皿中,于解剖显微镜下撕开输卵管 膨大部,使卵丘.卵母细胞.颗粒细胞复合体流出,在 透明质酸酶(Synvitro)中消化数分钟,将裸卵于IVF. 30(Vitrolife)中洗3次后置于37cc,饱和湿度的, 5%CO孵箱中孵育1h.将卵随机分为对照组(新 鲜卵母细胞)与冷冻方案A,B组. 1.2冷冻环(Cryoloop)法玻璃化冷冻和解冻 1.2.1玻璃化冷冻方案A冷冻及解冻的基础液: 人输卵管液(HTF)+5%人血清白蛋白(HSA.体积 分数,Vitrolife).冷冻液1,2分别为8.1%乙二醇 (EG,体积分数,sigma)+基础液,31%EG(体积分 数)+1mol/L蔗糖(sigma)+基础液;解冻液1,2, 3,4分别为1,0.5,0.25,0.125mol/L蔗糖+基础液. 冷冻及解冻过程(均在室温即25cc条件下进 行):冷冻用基础液将卵母细胞洗3次,然后移至 冷冻液1中,静置3rain,最后移至冷冻液2中,静置 20s,迅速装入冷冻环(cryoloop)中直接浸入液氮中. 解冻将冷冻环从液氮中取出,迅速浸入解冻液1 中,静置2.5rain,然后依次将卵母细胞移至解冻液 2,3,4和基础液中,均静置2.5min;最后将卵母细胞 移至IVF.30中,于37oC,5%CO条件下继续培养, 以待实验时用. 1.2.2玻璃化冷冻方案B冷冻及解冻的基础液: HTF+5%HSA(体积分数);冷冻液1,2分别为 7.5%EG(体积分数)+7.5%二甲亚砜(DMSO,体积 分数,sigma)+0.5mol/L蔗糖+基础液,15%(体积 分数)EG+15%DMSO(体积分数)+1mol/L蔗糖+ 基础液;解冻液1,2分别为1,0.5mol/L蔗糖+基础 液. 冷冻及解冻过程(均在体温即37cc条件下进 行):冷冻用基础液将卵母细胞洗3次.然后移至 冷冻液1中,静置10min.最后移至冷冻液2中,静 置1min,迅速装入冷冻环中直接浸入液氮中.解 冻:将冷冻环从液氮中取出,迅速浸入解冻液l中, 静置1min,然后将卵母细胞移至解冻液2中,静置3 min,再移至基础液中,静置5rain,最后将卵母细胞 移至IVF一30中,于37oC,5%CO条件下继续培养, 以待实验时用. 1,3间接免疫荧光法观察卵母细胞的纺锤体. 卵母细胞经以下步骤处理:?卵母细胞先经1XPBS (IrvineScientific);?固定及透化液[2%甲醛(体积 分数)+0.1%TritonX.100(体积分数)+PBS], 37cc,30min;?PBS洗3次,15min/次;?封闭液 [PBS+2%BSA(质量分数)+2%正常羊血清(体积 分数)+2%脱脂奶粉(质量分数)+0.01%TritonX. 100+0.02%叠氮钠(质量分数)+0.1mol/L甘氨酸] 4clC过夜.?一抗o【一微管蛋白(o【一tubulin,Santa Cruz,1:500,用封闭液稀释),室温,1h;?封闭液洗 2次,15mirt/次,再用PBS(含3%BSA)洗3次, 5min/次;?二抗为羊抗鼠FITC[北京中山公司, 1:50,用PBS(含3%BSA)稀释],37cc,30min;? PBS(含3%BSA)洗3次,5mird次;?碘化丙啶(PI.Sig. ma公司,500L)染色,室温,10min;?用90%甘 油(甘油:PBS:9:1)封片,镜检. 1.4评价指标 1.4.1存活率卵母细胞解冻后,有完整透明带和 细胞膜,且胞质折光性好,定为形态存活. 1.4.2卵母细胞纺锤体和染色体评价指标正常 纺锤体呈中间隆起,两端渐尖的椭圆锥形结构,其余 78?tlI华科学忐 均为小常结构染包体氅带卉抒F列,+r部 l5统计学析以L:骑均再复j献所仃数抓 I1】si10统汁软件包分析以P(005为显苦性 差异『J<0uI如椴酱蓐畀 2结果 21两种玻璃化冷冻方曩对小鼠卵母细胞存活率 的髟响W种城璃化}々冻方粜IlI.t/iJ母细胞解冻 的俘率案A小莉高于疗禁13组世两者异投 【等l跏3%875*.P>005I她1 枉I埠后小鼠】母犯Ei々弃情_f%} h1i…,…?llr??…lIrill_H1?f% 22两种玻璃化冷冻万案时小鼠卵母细盹坊锤作 和染色体的榀伤两种吐墒化冷两雍纺忭 手?色从形忠上眦察刮以下几种损伤正常纺 f水结构(?:也作成团状.{=】=『没何形成典 的俪状(『2):染色悱肆常收心状没有纳锤c闭 341:敞k郇分色作乜怵的蜘钝件(I冬l5);尢纺 {体I'l:J包f(囝61^【斛曲县有正常蚰体 的母细啦数显着眠j."』!({组B(】5% 787*l52%,775《,P(005)后阿扦蓐 不显着【787呼7775%.I>005).A卅中斛硝, n止纺锤f的母细胞数丑并高于对烈【lB绸 {82^%72I%.I<n05:8265诺1( _u0I).片荠正显菩(2If5%.,> 005.表2)I到样.^组解冻后lf『Ili俺染包l盘的 卵母川包数』【_l低于刊矾卦【秆ll{组(I74 766*.17472s坼./(1】05).荐并 无显箨性c76^坼f725%./>005);^组中异 常拈笆休戡高r娜纽和It(舳6% I9}.826%275*,1<0(15)lll扦差并 尢菩肚cJqItv275啊./>【)175.表3) 3讨论 k?一n盎尝州印母刿胞世行冷罐,伍】JC结 苷件很大虽然耐1凡凳印母细胞玲冻l1卅究已 !【】f;}=这项技术?I然处J骑阶段坪冷球的 卵母…赶人什能存衍【_经柯研究发蛳戚熟印J 的纺钝体抟冻过程t会受到?1舰害融蠊 结果发现fl和I;I旧Ir的存洒半蔗异无疆并忭. i2崔 仉副纺锤阵的于挝协^组叫{几Jl{ll_此.小州 的冷冻案埘卯f损佰氍噬址的卟能仪 U卵丁仃活半}Jf』聊单削断 寅目?结{l^示两玻璃化{々赤方粜州印…胞 解拍,的仵衍半嚣j=_lI-(80?875%, P>【]05).造可能谜种玻璃冷冻^棠|,陈 m X ?… k 任 # 商m , 国m黻I三 阱一 ^ 豢3 ? 围^L杀色的社 rllnb…?_htHii 氧2,}冻对鼠tlH细胞钟锥作损情 I2l?1f?l1‰f??ll?qi…ylsml? 表夸璩小札母咆色佧牖情, TIlh3Fhl1''I,ir|_h1_.f…ll……Il?}'hr_?……… 熏,钒洲计呲似孙?川帅违仆.化兰]护纺虽州态屯?,怍靴懈眦 一一 第12期贺占举等枸橼酸爱地那非治疗勃起功能障碍的安全性和有效性研 究?1083? 利于药物吸收和分布,酶的结合能力也强.I期临 床试验结果显示,中国健康受试者服用枸橼酸爱地 那非片剂30,120mg是安全和能够耐受的.药代 结果为口服吸收较为迅速,约1h左右达到峰血药 浓度,消除半衰期约4h左右,连续服用3d,AUC 与AUC几乎相等,药物在体内没有蓄积.进食对 药代学参数没有影响.' 本研究应用IIEF中勃起功能评分,SEP2,3和 GAQ评估枸橼酸爱地那非治疗ED的有效性.结果 表明,枸橼酸爱地那非30mg和60mg两剂量组治 疗各种病因的ED,终点时勃起功能评分得分,插入 阴道和完成性生活比值的幅度明显大于安慰剂组, 统计学处理差异有极显着性(P<0.01).随着剂量 的增加,疗效也明显提高.次要疗效指标的统计学 分析结果也显示枸橼酸爱地那非各剂量组的临床疗 效明显优于安慰剂组,与主要疗效指标的分析结论 相符.用药4周后,枸橼酸爱地那非60mg,30mg 和安慰剂组勃起功能评分?26分的百分比分别为 40.96%,23.81%和7.22%,统计学处理差异有显着 性(P<0.05),提示口服枸橼酸爱地]Jlg~60mg是治 疗ED的最佳剂量. 枸橼酸爱地那非与其他PDE5抑制剂一样,在 治疗ED过程中会出现相似的不良事件,与药物相 关的主要不良事件有头晕,头痛,面部潮红和恶心. 只有2例患者在服用药物后发生视觉异常.全部不 良事件为轻至中度,呈一过性,无需处理,也不影响 药物疗效,随着用药时间延长而发生次数减少.不 良事件的发生率随剂量加大而增加.枸橼酸爱地那 非治疗组的实验室检查异常结果,心电图和视力检查 均无临床意义.没有患者因不良事件而退出试验. 参考文献 [1]BrockGB,McMahonCG,ChenKK,eta1.Efficacyandsafety oftadalafilforthetreatmentoferectiledysfunction:resultsofinte— gratedanalyses[J].JUrol,2002,168(4Pt1):1332—1336. 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L.V . it . rificatio . nofmouseginalv . esi- 果,为人及其他哺乳动物卵母细胞的玻璃化冷冻提matinandspindlenormalityandcumu1usintegrity[J].HumRe. 供实验依据.1 k0 999 v , , 1 s 4(2) c : . 4 k0E,.f.vitrit10n. 参考文献 t0skelet0n,andadditi0nandrem0val0fcryopmtectant[J].Ctureporcineoocyteseffectsoflip iddropletstemperature ry cy 0. :,,一 [1]朱孝燕,孙海燕,孙强,等.小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研[9]Hunt… erJE,Brn.F11BJ,.1.Th..ti.rep. …变:妻鬯譬专,:::,.fhd...ytf0ll.0ig...lig:id.o'f1.[2]刘红林, 范必勤,陈宜峰.小鼠卵母细胞的乙醇激活[J],南 teredm.fphol.gica1characteristics[].Cryo-Lett.1990,l1 []萼兰婆妻謦:,篓曼懋中堡茎[1O]is,vdE1tJ,SicbhblE,.z.Thin.及制冷速度对家兔卵 母细胞纺锤体的影响[J]? 北京大学学.f;l.wan'dultra-rapidfzing.nthe.rgan'ization.fthemei.tic 报(医学版),2004,36(6):566-570?spindleofthem.use.0cyte[J].HumReprod.1992,7(6): l4JLiuJL,s"gLY,TianXC,eta1.HYPertonicitymd.dproj.857- 864 tionsreflectcellpolarityinmousemetaphase?oocytes:involve. mentofnficrotubules,nficrofilaments,andchromosomes[J].Bi (商学军编发)