为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!

线粒体凋亡途径参与TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡

2017-09-27 14页 doc 36KB 17阅读

用户头像

is_751406

暂无简介

举报
线粒体凋亡途径参与TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡线粒体凋亡途径参与TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡 线粒体凋亡途径参与TRAIL诱导胃腺癌细 胞凋亡 安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2007Dec;42(6)?599? 线粒体凋亡途径参与TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡 吴萍,陈思,程文晋,江蓓蕾,张旭东,张林杰 摘要目的研究TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡的途径.方 法PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡;广谱caspase抑制剂 (z-VAD—fmk),caspase-8抑制剂(z-IETD-fmk)和caspase-9抑 制剂(z-...
线粒体凋亡途径参与TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡
线粒体凋亡途径参与TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡 线粒体凋亡途径参与TRAIL诱导胃腺癌细 胞凋亡 安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2007Dec;42(6)?599? 线粒体凋亡途径参与TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡 吴萍,陈思,程文晋,江蓓蕾,张旭东,张林杰 摘要目的研究TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡的途径.方 法PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡;广谱caspase抑制剂 (z-VAD—fmk),caspase-8抑制剂(z-IETD-fmk)和caspase-9抑 制剂(z-LEHD—fmk)分别与TRAIL共同作用后PI染色,流式 细胞仪检测细胞凋亡率的变化;Westernblot检测caspase-3 的活化及PARP的裂解;JC-1染色,流式细胞仪分析线粒体 膜电位的变化.结果TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡具有剂 量和时间依赖性,BGC-823较SGC-7901对TRAIL诱导的凋 亡更敏感,TRAIL(100g/L)作用24h细胞凋亡率分别是 59.9%,24.3%;3种caspase抑制剂都能很大程度上阻止 TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡;caspase-3,PARP在TRAIL作用 早期即活化,裂解,且BGC~23比SGC-7901发生得更快;线 粒体膜电位随TRAIL处理时间延长而不断下降.结论 TRAIL能诱导胃腺癌细胞凋亡,且这种凋亡依赖于caspases; 除死亡受体途径外,线粒体途径也参与了凋亡信号通路. 主题词胃肿瘤;细胞凋亡;线粒体 自由词TRAIL 中图分类号R735.2;R329.2 文献标识码A文章编号1000—1492(2007)06—0599—05 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF—relat— edapoptosis—inducingligand,TRAIL/Apo2L)是肿瘤 坏死因子超家族成员,与TNF—ot,FasL一样,能快速 地诱导多种细胞凋亡….体外和体内实验都证实 TRAIL能诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常组织(除肝 脏外)无毒性,且肿瘤细胞p53基因的状态与其对 TRAIL的敏感性无关.这无疑使得TRAIL成为一 种非常有前景的抗癌制剂,因为在半数以上的人类 肿瘤中p53基因都发生突变.但研究发现仍有 相当多的肿瘤细胞,尤其是一些高度恶性的肿瘤,对 TRAIL诱导的凋亡不敏感,甚至有些开始敏感的细 胞,在受反复多次刺激后又会变得不敏感(获得性 耐受),这无疑是其应用于肿瘤治疗的重大障碍J. 2007—11—26接收 基金项目:国家自然科学基金(编号:30572118),安徽省自然科学基 金(编号:070413077) 作者单位:安徽医科大学免疫学教研室,合肥23~32 作者简介:吴萍,女,硕士研究生,助教; 张林杰,男,博士,教授,硕士生导师,责任作者,E—mail: zli33@ahmu.edu.ca 目前有关TRAIL诱导多种肿瘤细胞凋亡的研究已 取得很大进展,然而国内外关于胃腺癌细胞对 TRAIL的敏感性,TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡的胞 内信号通路的研究很少,现以BGC一823和SGC-7901 细胞为模型探讨TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡的途 径. 1材料与方法 1.1细胞培养胃腺癌细胞系BGC一823与SGC一 7901购自中科院上海细胞库,在含10%小牛血清 (杭州四季青公司)的DMEM高糖培养液(Gibco公 司),37oC,5%CO,饱和湿度条件下培养. 1.2主要试剂与仪器重组人TRAIL为澳大利亚 纽卡索医院张旭东教授友情提供,用DMSO配成 2.35g/L贮存液,一8O?保存,使用前用DMEM稀 释成所需浓度;碘化丙啶(PI)购自Sigma公司;广谱 caspase抑制剂(z—VAD—fmk),caspase一8抑制剂(z— IETD—fmk),caspase-9抑制剂(z—LEHD—fmk)均为 Calbiochem公司产品,都用DMSO配成10mmoL/L 贮存液,一20~C保存,使用终浓度为20~moL/L;JC一1 为Invitrogen公司产品,用DMSO配成2.5g/L贮存 液,4?避光保存,使用浓度为10mg/L;鼠抗人 caspase-3,PARP单克隆抗体购自SantaCruz公司; 羊抗小鼠IgG—HRP购自武汉博士德公司;硝酸纤维 素膜为AmershamBiosciences公司产品;显色试剂盒 为Pierce公司产品;流式细胞仪为BectonDickinson 公司FACSCalibur. 1.3PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡率按1x l0个/孔接种细胞于24孔板上,24h后细胞贴壁 处于对数生长期,给予不同浓度的TRAIL诱导凋 亡,3种caspase抑制剂在TRAIL之前1h加入.处 理结束后,收集上清至管中,用预冷的PBS洗1遍, 也收集至相应管中,离心,弃上清,然后每孔加750 lPI溶液(50mg/LPI,0.1%枸橼酸钠,0.1%Triton X-100)于37?避光作用l0—20min,待孔内贴壁细 胞完全消化后收集至对应流式管中,4?避光过夜, 次日上流式细胞仪检测. 1.4Westernblot检测caspase-3的活化及PARP 的裂解细胞总蛋白的提取和Westernblot检测方 安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2007Dec;42(6) 法参照文献[4].收集TRAIL作用的细胞,预冷的 PBS洗2次,加入细胞裂解液在冰上孵育1h,低温 高速离心后取上清,此为细胞总蛋白.蛋白浓度的 检测采用Lowry法.20—30g的蛋白经10%一 15%SDS—PAGE电泳,转移至硝酸纤维素膜上,用 5%脱脂奶粉/TBST封闭2h,加鼠抗人caspase-3 (1:1ooo),PARP(1:1ooo)单克隆抗体孵育2h, TBST洗3次,每次15min,再加HRP标记的羊抗小 鼠IgG(1:10ooo)孵育2h,TBST洗3次,TBS洗1 次,每次15min.用ECL系统进行检测,曝光,显 影,定影. 1.5JC-1染色,流式细胞仪分析线粒体膜电位的 变化按1×10个/孔接种细胞于24孔板上,24h 后细胞贴壁处于对数生长期,给予100g/LTRAIL 处理不同时间,收集各孔中细胞,用温热的PBS洗2 次,加入JC一1,置于37?培养箱中避光孵育15min, 然后每管重悬于300ixlPBS中,立即上流式细胞仪 检测. 1.6统计学处理采用SPSS11.5统计软件,所有 数据均以4-s表示,组间比较采用t检验进行分析. 2结果 2.1TRAIL能诱导胃腺癌细胞BGC.{B23与SGC- 79ol凋亡用一系列浓度的TRAIL:0,25,50,100, 200,500,1000g/L处理BGC-jB23与SGC-7901细 胞24h,收集细胞进行PI染色,流式细胞仪分析 DNA周期,在G./G.期前面出现亚二倍体峰(sub— G.),该峰即为凋亡峰.图1A提示细胞凋亡率随着 TRAIL浓度加大而不断增加,高浓度时凋亡率达到 一 个相对的平台期,且BGC-823比SGC-7901更敏 感,处理后很快就出现凋亡.图1B所示是用100 g/LTRAIL处理细胞后不同时点的凋亡率,TRAIL 作用24h时BGC-823与SGC-7901的凋亡率分别是 59.9%,24.3%.由此可见TRAIL诱导的胃腺癌细 胞凋亡具有剂量和时间依赖性,且两株细胞对 TRAIL的敏感性不同,SGC-7901对TRAIL诱导的凋 亡相对抵抗. 2.2TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡是caspases依赖 性的细胞凋亡为了解caspases在TRAIL诱导胃腺 癌细胞凋亡中的作用,用z—VAD—fmk(20ixmol/L), z—IETD—fmk(20ixmol/L),z—LEHD—fmk(20ixmol/L) 分别在加TRAIL前1h加入进行预处理,然后 TRAIL(100g/L)再作用24h,检测细胞凋亡率的 变化.如图2A所示,无论是z—VAD—fmk,还是Z一 ^ {卜 U loo 9O 8O 70 60 书{卜5O U4o 3O 2O lO O O255Oloo2oo5ool000 TRAIL~度(pg/L1 A 图1TRAIL诱导胃腺癌细胞BGc毒23/sGc.79ol凋亡具有剂量 和时间依赖性A:不同剂量TRAIL处理BGC_823/sGc-790l细胞 24h的凋亡率变化;B:100r~,/LTRAIL处理BGc_823/sGc-790l细 胞不同时间的凋亡率变化 IETD—fmk,Z—LEHD?fmk,当与TRAIL联用时,都能很 大程度上抑制TRAIL诱导的胃腺癌细胞凋亡,这种 现象在BGC一823这株相对敏感细胞株上尤为明显. Westernblot检测TRAIL处理前后caspase-3的 活化及PARP的裂解发现,TRAIL能快速地诱导 caspase-3活化,随着作用时间延长,caspase-3的表 达逐渐减少.敏感细胞株BGC-823中pro—caspase-3 的显着减少出现在3h,而在相对不敏感细胞株 SGC-7901中6h才能观察到这一现象.caspase-3 的底物——PARP在BGC一823中从TRAIL处理早 期就有裂解片段的产生,I2,24h绝大部发生裂解, 在发生时间上又早于SGC-7901细胞.这进一步证 明了TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡依赖于caspases 的参与,且敏感细胞株比相对不敏感细胞株的 caspases活化要早,凋亡发生得更快. 2.3TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡除了经过死亡受 体途径.还激活线粒体凋亡途径应用caspase一8,9 特异性抑制剂都能显着地抑制TRAIL诱导的胃腺 癌细胞凋亡,这死亡受体途径和线粒体途径都 参与了胃腺癌细胞凋亡(图2A).线粒体凋亡途径 是由于线粒体膜电位改变所致.Jc—l是对膜有通 安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2007Dec;42(6)?601? 与同株细胞处理0h比较:一P<0.01 透性的亲脂性阳离子荧光染料,正常细胞JC.1以单 体形式存在于胞质中,同时可在线粒体内聚集成多 聚体,发出红色荧光;而细胞凋亡后线粒体失去了积 聚染料的能力,只能在胞质中以单体形式存在,发出 绿色荧光J.图3及表1显示,TRAIL作用后,两株 细胞的线粒体膜电位都逐渐下降,尤其是TRAIL处 理12h后明显下降,表现为右下象限的细胞占细胞 总数的比例增加,这进一步印证了线粒体途径也参 与了TRAIL诱导的胃腺癌细胞凋亡.但线粒体膜 电位下降的程度与细胞凋亡率并非呈正相关,对 TRAIL很敏感的BGC-823细胞其下降程度并不比 相对耐受的SGC-7901细胞更明显.这可能与线粒 体在整个凋亡过程中的参与程度有关. 3讨论 BGC.823 TRAIL诱导凋亡是通过与靶细胞膜上的死亡受 体DR4或DR5结合后,形成配体.受体三聚体复合 物,诱导受体胞浆段的死亡结构域(DD)与Fas相关 的的死亡结构域蛋白(FADD)羧基端的DD结合. ^ 邑 模} 熙 pro??easpase??3 Pf 13一actin B 图2TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡依赖于easpasesA:caspases抑制剂对TRAIL诱导 胃腺癌细胞凋亡的影响;B:Westernblot检测TRAIL (100/L)处理前后caspase-3的活化及PARP的裂解,B—actin为内参 ^ 蛆] 蛙 ? U 6hl2h 蕈 王 一?, 17.261 JC—l单体(绿色荧光) 图3TRAIL活化胃腺癌细胞的线粒体凋亡途径Jc—l染色,流式细胞仪分析 TRAIL(100/L)处理前后不同时间点线粒体膜电位的变 化,每组实验重复3次,图中选取有代表性的结果 安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2007Dec;42(6) FADD再以其氨基端的死亡效应结构域(DED)与 procaspase一8结合,形成DR4/DR5一FADD—procaspase一 8死亡诱导信号复合物,促使其中的procaspase一8自 身催化成有活性的caspase一8.在某些细胞(即所谓 的I类细胞)中,caspase一8的活化足以直接激活下 游的效应caspases引起细胞凋亡.而在另一些细胞 (?类细胞),caspase一8的活化很有限,活化的 caspase一8促进Bcl-2家族蛋白Bid断裂成截短的 tBid移位至线粒体,与Bax和(或)Bak相互作用,引 起线粒体损伤,导致CytoC和Smac/DIABLO释放. CytoC释放入胞浆,与Apaf-1,pmcaspase-9形成凋 亡体,使得procaspase-9自身催化形成有活性的 caspase-9,进而活化效应caspase-3,-7.而Smac/DI— ABLO能拮抗凋亡抑制蛋白如XIAP,Survivin对效 应caspases的抑制作用.最后活化的caspase-3对 胞浆中的procaspase-8再进行加工,由此凋亡传导 通路通过线粒体得以放大J. 本研究发现TRAIL能诱导BGC一823和SGC一 7901细胞发生凋亡,并具有剂量和时间依赖性,且 这种凋亡依赖于caspases参与.然而两株细胞对 TRAIL的敏感性不同,BGC一823细胞对TRAIL较敏 感,凋亡发生很快且进展迅速,而SGC-7901细胞对 TRAIL相对抵抗.值得注意的是,这两株细胞均为 p53基因突变型,而用TRAIL处理另一种p53野生 型的胃腺癌细胞——AGs,发现其也发生凋亡(结果 未显示),这说明不管胃腺癌细胞p53基因是否发 生突变,TRAIL都能有效地诱导凋亡,这无疑是 TRAIL相比其他化疗药物的一个优势. 一 直以来凋亡信号通路分为由细胞表面死亡受 体介导的外源性途径和线粒体介导的内源性途径. 外源性途径的起始caspases是caspase-8,一10,而在 内源性途径中是caspase-9,-2.实际上大多数细胞 凋亡都要依赖于线粒体途径,该途径受Bcl-2家族 的促凋亡和抗凋亡蛋白的调控J.实验中用z— IETD—fmk,z—LEHD—fmk分别处理细胞,发现两种特 异性的抑制剂都能很大程度上抑制TRAIL诱导的 胃腺癌细胞凋亡,这说明除了caspase一8活化外, caspase-9也参与了凋亡通路,即caspase一8通过tBid 连接凋亡信号从TRAIL—DR4/DR5到线粒体.线粒 体膜电位的变化通常发生在凋亡早期,它的下降更 加证实了线粒体的损害,这充分提示两株胃腺癌细 胞均为?类细胞,线粒体途径参与了TRAIL诱导的 胃腺癌细胞凋亡. 本研究对TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡途径做 了初步探索,证实了内,外源性途径并非完全独立, 而是存在交叉对话,凋亡信号通过线粒体途径得以 不断放大.然而线粒体在死亡受体介导的细胞凋亡 中的确切作用如何还有待进一步探索,如检测Bcl-2 家族蛋白的表达,CytoC和Smac/DIABLO从线粒体 向胞浆的移位,建立过表达Bcl-2的细胞株等. 参考文献 [1]KimberleyFC,ScreatonGR. 1igandanditsfivereceptors[J] 72. FollowingaTRAIL:updateona CellRes,2004,14(5):359一 [2]SelivanovaG,WimanKG.Reactivationofmutantp53:molecular mechanismsandtherapeuticpotential[J].Oncogene,2007,26 (15):2243—54. [3]ZhangL,FangB.MechanismsofresistancetoTRAIL?induced印? optosisincancer[J].CancerGeneTher,2005,12(3):228— 37. [4]SambrookJ,Ffit~hEF,ManiatisT.分子克隆实验指南[M]. 金冬雁,黎孟枫译.2版.北京:科学出版社,1992:888—98. [5]MhaidatNM,WangY,KiodaKA,eta1.Decetaxel—inducedap— optosisinmelanomacellsisdependentonactivationofeaspase-2 [J].MolCancerTher,2007,6(2):752-61. [6]CretneyE,ShankerA,YagitaH,eta1.TNF—relatedapoptosis—in— ducingligandasatherapeuticagentinautoimmunityandcancer [J].ImmunolCellBiol,2006,84(1):87—98. [7]HerseyP,ZhangXD.Overcomingresistanceofcancercellsto apoptosis[J].JCellPhysiol,2003,196(1):9—18. Themitochondrialapoptoticpathwayisinvolvedin TRAI1.-inducedapoptosisofgastricadenocarcinoma WuPing,ChenSi,ChengWenjin,etal (DeptofImmunology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032) AbstractObjectiveToexploretheapoptoticpathwayinducedbyTRAILingastricadenocarci nomacells.Meth- odsApoptoticcellsweredeterminedbythepropidiumiodidemethodusingflowcytometry.E ffectofcaspasein— hibitorsonTRAIL—inducedapoptosiswerecarriedoutbypretreatingthecellswithpan— caspaseinhibitor(zVAD— fmk),thecaspase一8inhibitor(z—IETD—fmk),orthecaspase-9inhibitor(z—LEHD— fmk)beforeaddingTRAIL.The 安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2007Dec;42(6)?603? 食管癌染色体畸变及其与临床病理参数相关性研究 张天宝,张钰,蔡岩,韩亚铃,徐昕,王明荣,贾雪梅 摘要目的应用荧光原位杂交技术检测食管鳞状细胞癌 染色体畸变情况,并分析其与临床病理参数相关性,探讨应 用探针组合辅助诊断食管鳞状细胞癌的可行性.方法用 染色体3…489,10,11,17,20号和Y着丝粒探针,与152例 食管鳞状细胞癌细胞间期核进行荧光原位杂交,分析染色体 畸变情况及其与临床病理参数的关系,统计染色体畸变组合 检测食管鳞状细胞癌的阳性率.结果3…489,10,11,17, 2O号和Y染色体畸变率分别为68.4%,46.7%,73.O%, 48.6%,55.3%,48.7%,54.6%,61.8%和55.5%.11,20号 染色体多体与分期显着相关(P=0.ol1,0.005),4,9,20号 染色体多体与分级显着相关(P=0.007,0.001,0.002),8, 11,17,20号染色体多体与淋巴结转移显着相关(P=0.000, 0.000,0.010,0.007).联合应用3,8,10,20号探针检测食 管鳞状细胞癌阳性率为57%,3,8,20号和Y探针组合在男 性患者的阳性率为69%.结论食管鳞状细胞癌染色体有 很高的畸变率,且与临床病理参数存在相关性,染色体着丝 粒探针组合为食管癌的辅助检测提供实验依据. 主题词染色体畸变;原位杂交,荧光;食管肿瘤/遗传学; 2007一l1—12接收 基金项目:国家重点基础研究发展规划(编号:2004CB518705),北京 市科技重大专项(编号:Do9o5oo1o4O331),长江学者 和创新团队发展计划基金(编号:IRT0416) 作者单位:安徽医科大学组织胚胎学教研室,合肥230032 中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验 室,北京100021 作者简介:张天宝,男,硕士研究生; 贾雪梅,女,教授,硕士生导师,责任作者,E—mail:jiaxueme @mail.hf.ah.ca: 王明荣,男,教授,博士生导师,责任作者,E?mail:wang? nu04@】26.corn 癌,鳞状细胞 中图分类号R735.1;R394.2 文献标识码A文章编号1000—1492(2007)06—0603—06 染色体畸变可以反映肿瘤在基因组水平的改 变,研究畸变染色体将有助于阐明肿瘤的发生机制. 染色体的不稳定性和基因组DNA的扩增,缺失,异 位,突变等病变以及原癌基因的激活和(或)抑癌基 因的失活是食管癌发生的基础.分析染色体畸变常 用的技术有显带分析,比较基因组杂交(CGH)和荧 光原位杂交(FISH)等.其中FISH技术不仅可以与 中期染色体杂交,还可以与新鲜组织或冻存组织标 本制备的间期核进行原位杂交;特别适合于实体瘤 染色体畸变分析和早期检测等.目前,国外研究主 要是CGH和位点特异性探针在食管癌染色体中的 应用,关于染色体着丝粒探针组合应用于食管癌的 研究较为少见,本实验应用FISH技术分析了.152例 食管鳞状细胞癌(ESCC)患者染色体畸变情况,分析 其与临床病理参数间的关系,并寻找最佳探针组合, 以期为辅助检测食管癌提供实验依据. 1材料与方法 1.1标本收集152例食管癌新鲜组织标本全部 来自2006,2007年中国医学科学院肿瘤医院胸外 科手术病例,男128例,女24例,年龄39,8l岁. 所有病例均经病理诊断为食管鳞状细胞癌. 1.2标本处理及制片术后切除的新鲜组织标本 充分剪碎,加入胶原酶和培养基,37o【=培养过夜;离 activationofcaspase一 3andPARPcleavagewereconductedbyWesternblotanalysis.Thechangesinmitochondfial membranepotentialweremeasuredbyuptakeofJC一 1usingflowcytometry.ResultsTRAILinducedapoptosisof gastricadenocarcinomacellsinadose—andtime—dependentmanner.ItappearedthatBGC一823wasmoresensitveto TRAIL— inducedapoptosisthanSGC-7901.Theratesofapoptoticcellswere59.9%and24.3%,respec tively,after treatmentwithTRAIL(100g/L)for24h.CaspaseinhibitorsblockedTRAIL?inducedapopto sisnearly. complete? ly.Caspase?3activationandPARPcleavageweredetectedearlyafterexposuretoTRAIL.Th emitochondrialmem? branepotentialdecreasedinresponsetoTRAIL.ConclusionInductionofapoptosisofgastric adenocarcinoma cellsbyTRAILiscaspase—dependent.TRAILinducesbothreceptor— mediatedandmitochondrialintrinsicpathways. MeSHstomachneoplasms;apoptosis;mitochondria FreewordTRAII.
/
本文档为【线粒体凋亡途径参与TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索