人IL-21基因联合γ射线照射对食管癌EC109细胞抑制作用研究(可编辑)

人IL-21基因联合γ射线照射对食管癌EC109细胞抑制作用研究(可编辑) 人IL-21基因联合γ射线照射对食管癌EC109细胞抑 制作用研究 天津医科大学 硕士学位论文 人IL--21基因联合γ射线照射对食管癌EC109细胞抑制作用的研 究 姓名:张鸿艳 申请学位级别:硕士 专业:临床医学;肿瘤学;放射治疗 指导教师:曹永珍 2012-05天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的 恶性肿瘤是危害当代人类健康的严重疾病之一,肿瘤治疗包括传统的 手术、放疗、化疗以及近年来兴起的基因治疗等。食管癌是全球第九大恶性疾 病,在全球许多地区流行,特别是在发展中国家。中国是食管癌的高发地区,放 射治疗是目前食管癌主要的、有效的、安全的手段之一。肿瘤的基因治疗是用 一定的方法把外来的基因转入肿瘤细胞中,使其在肿瘤部位表达高浓 度产物或在体外相关细胞内重组后再导入体细胞中表达,抑制肿瘤恶性表型, 选择性杀伤肿瘤细胞,对周围正常组织无明显毒副作用,达到控制肿瘤细胞生 长的目的。放疗和基因治疗两者之间存在着相互增强的作用。其机理是射线照 射后增加基因转染的效率和或促进基因的表达,另外基因转染后可增加肿瘤 细胞对射线照射的敏感性。 白细胞介素.是等【年发现的 家族细胞因子成员, 主要由活化的细胞产生。.与.、?和.高度同源。 .】等研究者克隆了白介素.及其受体.的。人 . 的编码多肽前体,其信号肽,成熟蛋白,推算 其分子量 。本实验目的是通过含有.基因的重组腺病毒载体.一 转染体外培养的人食管癌细胞株,观察.基因的抑瘤效应,然后联合 射线照射,研究两者的协同抑瘤作用,为食管癌的进一步基因治疗研究提供 了理论基础和实验依据。 方法 本实验将已构建好的重组腺病毒..基因于体外转染食管癌细胞 株 射线照射,.的病毒滴度为.× /, ,然后进行 重组腺病毒..的病毒滴度为× /,感染率值为。实 验分组设计为空白对照组、?组和.。基因组、单独照射组和 ?.基因联合照射组以下简称联合治疗组。用法和流式细胞术观 察.基因联合放疗对细胞生长及细胞周期、凋亡的影响。通过及 鉴定?.在转染食管癌细胞中的表达情况。 争士甲 三口天津医科大学硕士学位论文 、食管癌细胞生长曲线:空白对照组、.组和..基因 组 细胞数量随培养时间延长呈增加趋势。转染后第天开始,单独 照射 组和联合治疗组细胞生长明显缓慢,与?.基因组和.组比较差异 有统计学意义.,.;联合治疗组与单独照射组和.组比 较差异有统计学意义.,.。在转染后第天,.一基因组 的细胞生长开始明显比空白对照组和.组慢.,.,空白 对照组与.组相比差异无统计学意义.,其中联合治疗组细胞生 长最为缓慢。 .食管癌细胞周期和凋亡的情况:流式细胞术检测结果显示,与 .组和空白对照组相比,..组、单独照射组及联合治疗组细 胞停留在期的细胞增加,凋亡率增加。其中以联合治疗组期细胞 所占比 例最高,达到.%,凋亡率.%。 .食管癌细胞内.基因表达的变化:..转染细胞 后提取,经扩增出预计的.基因片段,以为 软件进行灰度,空白对照组、?基 对照。经 因组、联合治疗组的.基因相对表达量分别为.、.、.。? 组细胞中.基因表达量比空白对照组高,联合治疗组一基因表达 量最多,分别是..组和空白对照组的.倍和.倍。 .食管癌细胞内.基因蛋白表达的变化:?.转染 细胞后提取总蛋白, 检测发现一基因蛋白的特异性条带出现 在标准相对分子量左右,以内参.为对照,出现在左右。 对蛋白印迹带进行分析:空白对照组、?? 利用灰度分析软件 组、单独照射组及..联合治疗组.的相对表达量为.、.、. 和.。个组均表达.基因蛋白,.一联合治疗组.表达量最高, ..组表达明显比空白对照组高。 结论 .重组腺病毒..能抑制食管癌细胞的生长,通过与? 对照比较,表明对肿瘤细胞的抑制作用来自转导的.基因,而不是腺病毒载 体本身。 ...组、单独照射组及联合治疗组对细胞生长均有抑制作用,天津医科大学硕士学位论文 联合治疗组具有协同作用,其抑制效应最强。..组、单独照射组及联合 治疗组阻滞食管癌细胞周期于期,使细胞对射线更敏感,促进细胞 凋亡,联合治疗组凋亡率最高,有效地抑制肿瘤细胞的生长。 .经及 检测发现,空白对照组、..组、联 合治疗组中的.基因及蛋白表达量不同,重组腺病毒..有效地转染 进入细胞,并且在细胞中稳定表达,联合治疗组的一基因及蛋白表达量最高, 结果说明单独.基因对食管癌细胞的生长具有一定的抑制作用,而 联合治疗组抑瘤效应最明显,有效地抑制肿瘤细胞的生长,为今后用于临床恶 性肿瘤的治疗提供了一个新的治疗方案。 ;基因治疗 关键词:一基因;食管癌;放射;; ,, . . , .,廿 , 曲 ,, .. 盯 , . . .? , , ..一 一, 【】 ..一 叫 . . ,? ... 腑, . ,天津医科大学硕士学位论文, . “ /... /,.,,一 ?. ,一 ., .. : .一? , . ... .. ?.. . . :?,? , ?.., . .%. 曲, .%, .一: , , , .. 黟, ,?一 , .,.,.. ?,? 天津医科大学硕士学位论文 .. , .一 . 一, : ,, .:, , ,一 ...,.,. 一,? .. . 一, , ., ?一 ...,,?一 , , ., , .. 曲, . .,? ,? ,,一 , .. , . , .. , 天津医科大学硕士学位论文 ,.: ,, , , 天津医科大学硕士学位论文 符号说明 缩略词 英文名称 中文名称 聚合酶链反应腺病毒二甲基亚砜 溴化乙锭 乙二铵四乙酸 光密度磷酸盐缓冲液三羟甲基氨基甲烷 胎牛血清 / 溶液 ’ ’’ 缓冲液 磷脂结合蛋白异硫氰酸荧光素 碘化丙啶 焦炭酸二乙酯 互补 十二烷基磺酸钠 天津医科大学硕士学位论文 月舌 研究成果及现状 恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病,传统的化疗、放疗及手术 治疗仍然是 目前的主要治疗手段。放射治疗是通过辐射诱导肿瘤细胞原发损伤或者细 胞凋亡,从而导致肿瘤细胞的死亡。近年来,随着现代放疗设备和精确放射 治疗技术的进展,使更多肿瘤病人需要接受放射治疗。 肿瘤的基因治疗是用一定的方法把外来的基因转入肿瘤细胞中, 使其在肿瘤部位表达高浓度产物或在体关细胞内重组后再导入体细胞中表 达,抑制肿瘤恶性表型,选择性杀伤肿瘤细胞,对周围正常组织无明显毒副作用, 达到控制肿瘤细胞生长的目的。基因治疗的历史虽然没有放射治疗的悠久,但在 许多体外实验中却取得可喜的成果。但肿瘤的发生是多因素、多环节、多阶段的 复杂过程,肿瘤治疗涉及面广、难度大,且基因治疗尚无突破性进展,所以距临 床应用还有相当的距离。 在肿瘤的基因治疗中,以细胞因子基因为代表的免疫基因治疗应用得最为广 泛而成熟。将含细胞因子基因的表达载体注入肿瘤组织内,使其在肿瘤局部稳定、 有效的高表达,可以降低肿瘤细胞的致瘤性、增强免疫原性、增 强荷瘤机体的特 异性和非特异性免疫应答,从而发挥其抗肿瘤活性【】。目前,国内外有许多实验 室致力于细胞因子在肿瘤治疗方面的研究和应用,取得了许多重要的成果。 白细胞介素.是等】年发现的 家族细胞因子成 员,主要由活化的细胞产生。.与.、一和.高度同源,并 链,是 且和.、.、.、.、.公用同一个信号传导亚单位 家族中的新成员。等【】发现,细胞参与.诱导的抗肿瘤应答。 等【】用高动力学为基础的基因转移技术研究.对鼠的纤维肉瘤和 黑色素瘤抑瘤作用,发现细胞也参与.介导的抑瘤作用,并进一步证 实和细胞通过穿孔素介导的细胞毒作用排斥肿瘤。曲等【】用重 组鼠.免疫转移黑色素瘤模型,发现一引发高选择性的免疫应答。 而 等【】人的研究表明,一介导的抗肿瘤应答具有特异性。【 等发现,将一和.基因转导到人胰腺癌细胞能产生自然杀伤细胞依赖性 和非依赖性抗肿瘤效应。国内有研究报道【】,将人.基因转染卵巢癌细胞 后对细胞的生长也有明显的抑制作用。.蛋白质也已被报道有一 定的抗肿瘤 的作用。因此.可能做为一种抗肿瘤治疗方法。 近年来肿瘤基因治疗已成为新的研究热点,而基因治疗技术也正日益渗入到 放射治疗中。因此,美国肿瘤放射治疗学家年提出“基因放天津医科大学硕士学位论文 射疗法”【.一词。如何有机地将基因治疗及放射治疗结合 起来,已成为是当前肿瘤治疗的研究热点,也是今后肿瘤治疗的发展方向。当前 基因放射治疗法比较有前途的有放疗联合细胞因子基因治疗、放射调控转移基因 体内表达、放射诱导基因治疗、促进分子化疗自杀基因治疗。这种复合治疗 的主要原理是:?辐射能提高基因转染及基因整合的效率。】等采用腺病毒 感染射线照射后的小鼠肺癌细胞,可造成细胞内基因编码产物 成剂量依赖性扩增,扩增效率可达倍,有效控制了肿瘤细胞生长。?外源基 因转染可增加肿瘤细胞的辐射敏感性。等【 】用携带基因的重组腺病 毒感染卵巢癌细胞系和人癌组织原代细胞后,使其对电离辐射的敏感 性明显提高,短时间大量细胞死亡。张珊文等【】发现,重组腺病毒与放疗 联合应用可提高鼻咽癌对放疗的敏感性。?基因治疗和放射治疗分别作用在细胞 周期的不同时相。基因治疗要求在细胞周期的期实现,而细胞在/期对射 线最敏感,两个作用点比单一时间点更具有杀伤力。总之,利用放疗既可以有效 地控制肿瘤的生长,降低肿瘤负荷,又可以促进基因载体的高效肿瘤靶向转移, 为基因治疗疗效的发挥创造有利条件,而基因的导入又可增强放疗疗效,放射治 疗与基因治疗联合应用有相互促进的作用 基因治疗中表达载体的选择也是很重要的一个环节。表达载体有质粒载体 和病毒载体 两大类。目前常用病毒载体主要有以下 几类:腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒及疱疹病毒。其中腺病毒具有较好的稳 定性,能感染分裂和不分裂细胞,易于增殖和纯化,病毒滴度高,且病毒 一般存在于细胞染色体外,整合突变致癌或遗传毒性小,因而成为近年来基因治 疗中应用最广泛的病毒载体【】。自年首次应用于临床实验以来,迄今为止 。本研究中采用的是 大约有个基因治疗临床试验方案采用腺病毒做载体【 复制缺陷型的腺病毒表达载体。 研究目的、方法 在消化道肿瘤中,食管癌的预后较差。中国是食管癌的高发区,在临床上所 见到的食管癌患者多属中晚期,在确定诊断后,未经治疗者平均生存期为四个月。 手术是食管癌的首选治疗方法,但能根治性手术治疗的病人仅占全部病人的/。 放射治疗是目前食管癌主要的、有效的、安全的手段之一。因此本研究利用构建 好的重组腺病毒表达载体..于体外转染食管癌细胞株,观察其抑 瘤效应。再用比色法和流式细胞术观察基因联合线照射后细胞的 生长曲线、细胞周期及细胞凋亡的变化,研究两者的协同抑瘤作用,为今后临床 恶性肿瘤的放射治疗和基因治疗的联合应用提供实验依据。 天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 人 细胞抑制作 一基因联合,射线照射对子食管癌 用的研究 材料与方法 实验材料: .腺病毒载体和细胞株 构建好的含人.基因重组腺病毒表达载体..及对照腺病毒 腺病毒载体为中国医学科学院放射医学研究所构建保存【。 .试剂盒 提取试剂盒为公司产品 .细胞凋亡试剂盒为公司产品 蛋白试剂盒北京赛驰生物科技有限公司 .引物 上海捷瑞生物工程有限公司合成目的基因引物: 上游引物:’一一’ 下游弓物:’一一’ .主要试剂 试剂名称 生产公司 低熔点琼脂糖 美国.公司 公司 乙醇 天津大学科威公司 氯仿 华北地区特种化学试剂开发中心 异丙醇 天津大学科威公司 甲醛 湖北大学化工厂 甲酰胺 北京索莱宝科技有限公司 北京索莱宝科技有限公司北京赛百盛生物技术有限公司北京赛 百盛生物技术有限公司 北京赛百盛生物技术有限公司材料与方法 天津医科大学硕士学位论文 上海浩宏生物科技有限公司 .蛋白裂解液 杭州四季青生物工程材料有限公司 胎牛血清 溴化乙锭 其它各种试剂均为进口或国产分析试剂 .主要试剂、缓冲液的配置 .. / 用配置/的储存液。用.一次性过滤器过滤除菌,并把 的储存液分装到无菌锥形管中。。储存可以达个月。 .. %乙醇 在消毒过的玻璃瓶中加入乙醇,再加入双蒸水。 .. 染液配制 .,加蒸馏水至,避光保存。 ,枸橼酸钠.,. .. .% 加入蒸馏水中,于恒温振荡器中过夜混匀,于.× 高压灭菌?放置。 .. 缓冲液 . . 然后加入的去离子水,充分搅拌溶解。加入.的醋酸,充分混 匀。加去离子水定容至,室温保存。 .. %丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺和 双丙烯酰胺?溶于总体 积为的水中。加热至。溶解之,定容至。过滤后置于棕色瓶中? 保存。 .. %过硫酸铵 过硫酸铵溶于去离子水中,磁力搅拌器混匀,贮存于.。,可使 用周左右。 .. %十二烷基硫酸钠 溶于去离子水中,用磁力搅拌器直至完全溶解,用水定容至 ,储存于室温。 ...×分离胶缓冲液 天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 碱,用浓调值至.,充分溶解后 去离子水中溶解 定容至,?贮存。 .. ×浓缩胶缓冲液 去离子水中溶解.碱,用浓调值至.,充分溶解 后定容至,?贮存。 .. ×电泳缓冲液 溶于经水处理的/,之后用氢氧化 . 钠调至.之后再加./,加处理水定容至,过滤 除菌,避光室温保存。 .. ×一甘氨酸电极缓冲液 称取. 碱,甘氨酸,加蒸馏水,加入,充分溶解 后,调.后用蒸馏水定容至,置室温保存。 .. × . . 去离子水定容至,室温保存。 .. 缓冲液含.%的缓冲液 % . “ 混匀后即可使用,最好现用现配。 .. %冰乙醇 在消毒过的玻璃瓶中加入乙醇,再加入。置于.?保存。 .. .%的琼脂糖凝胶 称取.琼脂糖,于微波炉加热至融化,冷却至。左右,再 加入/的.,轻轻摇匀,铺胶。 .. .完全培养基 使用. 液时按需要比例加入小牛血清本实验浓度为%以及双 抗青链霉素。?保存。 ..细胞冻存液的配置 份,份小牛血清,份完全培养基,于一?中保存。 .. 转移缓冲液 甲醇,., 甘氨酸,.,加双蒸水定容至 天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 ,于室温下保存。 .细胞培养耗材 细胞培养瓶、孔培养板、孔培养板、移液管、酶标板、冻存管, 细胞 冻存盒等均购白天津厚普生物技术有限公司 .主要仪器设备 设备名称 生产厂家 加拿大公司 丫射线照射源 电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司 .型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司 倒置显微镜 上海离心机研究所 台式低温离心机 太仓市实验设备厂 台式恒温摇床 山东新华医疗器械厂 高压灭菌器 美国公司 扩增仪 美国公司 超低温冰柜。 日本立洋公司 微量加样器 磁力搅拌器 上海司乐仪器厂 恒温水浴箱 上海凯乐电子设备厂 培养箱 日本 冷冻高速离心机 , 超速离心机 常温台式离心机 北京医用离心机厂 美国公司 高、低压电泳仪 美国公司 一凝胶图像处理系统 美国 流式细胞仪 电泳槽 大连竞迈生物科技有限公司 重庆试验设备厂 台式干燥箱 美国公司 酶标仪天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 往复式脱色摇床 大连竟迈生物科技有限公司 塑料薄膜封口机 温州市兴业机械设备有限公司 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 低温冰箱?和.? 海尔公司 快速混匀器 姜堰市新康医疗器械有限公司 实验方法 .食管癌细胞培养、 复苏、传代及冻存 ..操作前准备:无菌操作 ?无菌室的灭菌: .定期打扫无菌室,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然 后用 %新洁儿灭擦拭; .培养箱灭菌,先用%新洁儿灭擦拭,然后用%酒精擦拭,再用紫 外线照射; .实验前灭菌,打开紫外灯、空气净化器系统各.; .实验后灭菌,用%酒精擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 ?实验人员的无菌准备: .肥皂洗手; .穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋: .用%酒精棉球擦净双手。 ?无菌操作的演示: .凡是带入超净工作台内的酒精、、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 %酒精擦拭瓶子的外表面; .靠近酒精灯火焰操作; .器皿使用前必须过火灭菌; .继续使用的器皿如瓶盖、滴管要放在高处,使用时仍要过火; .各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确、不能乱碰,如吸管不能碰到 废液缸; .吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。 ..完全培养基成分所用试剂均无菌,要求无菌操作 培养基天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 %、牛血清、双抗青链霉素 ..细胞的复苏 细胞复苏的原则一快速融化:必须将冻存在.。液氮中的细胞快速融化至 。,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再 结晶,对细胞造成损害。具体步骤如下: ?准备一个的烧杯,内装//杯。的温水; ?从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动,使冻存管 中的冻存 物在内融化; ?打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中; ?离心,弃上清液; ?加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中,放入。,饱和 湿度的二氧化碳孵箱中培养过夜二氧化碳分压为.; ?待细胞贴壁后置换培养基; ?视细胞生长情况及需要进行后续操作。 ..贴壁细胞的消化、传代培养 ?弃除瓶内的旧培养液; ?向培养瓶中加入液,轻轻摇动培养瓶,使其流遍所有细胞表面, 然后倒掉,重复.次; ?向培养瓶中加入.%的胰酶含.%,轻轻晃动培养瓶使 胰酶均匀覆盖所有细胞表面,倒置显微镜下观察,细胞变圆,胞质回缩,细胞 间距增大时,可用手拍打瓶侧壁与底壁,会发现细胞很快悬浮不弃消化液, 加入含%牛血清的培养基终止消化; ?用弯头吸管吹打细胞,吹打过程要按顺序进行,从培养瓶底部以一边开 始到另一边结束,确保所有底部都要吹打;轻柔吹打使细胞从培养瓶上脱落, 在显微镜下观察细胞形态,以大部分细胞呈单个游离细胞为最佳; ?吸取适量的细胞悬液转移至新的培养瓶中,并补加含%的培养基; ?用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入?,%、饱和湿度 下静置培养。一般传代后开始贴附在瓶壁上。 注意事项: ?严格的无菌操作; ?适度消化:消化的时一间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩, 连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。 ..细胞计数方法 ?用水清洗盖玻片以及血细胞计数板,然后将其在无水乙醇中浸一下,取 出,吹干酒精后,将盖玻片覆盖在计数板上,使之覆盖住两个计数池; ?用移液枪吸取已经充分混匀的细胞悬液从血细胞计数板的一端注入 细胞计数池内,细胞悬液需均匀填满于细胞计数池内,切勿溢出; ?另取细胞悬液从另一端注入另外一个计数池内; ?将血细胞计数板置于显微镜下,以物镜观察,一记录计数板个大格 的细胞数,位于细胞计数池边线上的细胞只计左侧和上方细胞,右侧和下方细 胞不计算在内; ?若两个细胞计数池所计数的细胞数目差异大于两者平均值的%,须重 新计数; ?原始细胞悬液中细胞密度的公式计算如下: 细胞数/毫升悬液大格细胞总数/××稀释倍数 注意事项: ?进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于个/,如果细胞数目 很少要进行离心再悬浮于少量培养液中; ?要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性; ?取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其是多次取样计数时更要注意每 次取样都要均匀,以求计数准确; ?数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞 计算。如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线; ?操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要 重新计数。 ..细胞的冻存 ?选取处于对数生长期的细胞,在收集细胞前换一次培养液。按常规 方法消化细胞,将细胞悬液收集到离心管中; ?把细胞制成细胞悬液,计数,使细胞达到×/左右浓度; ?离心,弃上清液。沉淀中加入冻存液,混合均匀后转移至 /左右; 冻存管中,每管约.,细胞冻存数应为 天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 ?将冻存管口封严; ?贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。冻存管外栓一金属重物和一细绳; ?按下列顺序降温:室温一?一冰箱冷冻室一低温冰箱 。 一气态氮一液氮,保存时间大约年时间。或者使用细胞冻 存盒,将冻存管放入冻存盒内,直接放入。冰箱中,之后再将冻存盒取 出,细胞冻存管放入一?冰箱中保存,保存时间大约.个月。 注意事项: ?细胞的培养传代以及冻存都要在无菌操作台内进行; ?冻存细胞时要缓慢冷冻。尽可能均匀地减少细胞内水分,减少细胞内冰 晶的形成是减少细胞损伤的关键。目前冻存液中多采用二甲基亚枫作保护剂, 它在深低温冷冻后对细胞无明显毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可 以使冰点下降,提高胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分 渗出细胞外,在胞外形成冰晶,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形 成所造成的细胞损伤; ?冻存时操作要小心,以免液氮冻伤; ?冻存盒中的冻存液异丙醇每使用.次就得更换。 ..病毒稀释 病毒滴度/的值乘取的病毒液体积再除以你要转染的细 胞数。本实验研究值为。 .抑瘤实验 ..人肿瘤细胞的培养传代及冻存 方法同细胞的培养传代及冻存。 ..实验分组 分组设计为:空白对照组、.对照组、..基因组、单独照射组 和联合治疗组。 照射条件为: 射线照射源进行照射 联合治疗组:转染人.基因腺病毒,之后将肿瘤细胞进行 射线照射 .. 比色法测定食管癌细胞生长曲线 测量生长曲线的方法有计数法和四唑盐方法,本实验中采用的是 方法。比色法的主要原理是:四唑盐是一种能接受氢原子的染料,简 天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 称。活细胞的线粒体中的玻珀脱氢酶能使外源性的还原为难溶性的蓝 紫色结晶物并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜溶解细胞中的紫 色结晶物,用酶联免疫检测仪在波长处测定其光吸收值,可间接反映细 胞数量。在一定细胞数范围内,结晶物形成的量与细胞数成正比。 ?取对数生长期的肿瘤细胞,胰酶消化并细胞计数,用孔板以每孔 .个肿瘤细胞、体积放入板中,每一组设个复孔取平均值, ?培养过夜; ?转染:转染当天把腺病毒按要求稀释到合适浓度,值为,. 对照组不含.基因的对照腺病毒病毒滴度为./.. 含.基因的重组腺病毒联合治疗组..转染后进行照射。 用新鲜培养基稀释病毒,不要涡旋; ?继续培养,。孵育过夜; ?分别于培养、、、、后采用法测值,绘制生长曲 线,计算生长抑制率 .每孔加入液,。孵育后终止,弃去上清液,每孔加入 震荡 ; .用的波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值; .以时间为横轴,以其吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线图; .计算细胞生长的抑制率:抑制率一实验组值/对照组 值×% 采用.软件包进行统计分析,显著性检验采用单因素方差分析, .表示差异有统计学意义。 注意事项: ?选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,孔培养板的一个孔内 贴壁细 胞长满时约有个细胞。但由于不同细胞贴壁后所占面积差异很大, 因此,在 进行实验前,对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同 接种细胞 数条件下的生长曲线,然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证 培养终止时不致细胞过满,保证结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系; ?避免血清干扰。用含%胎牛血清培养液培养细胞时,高浓度的血清物 质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会降低试验敏感性。因此, 一般选小于%胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后,尽量吸净培养孔内残天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 余培养液; ?设空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔,最后 比色时,以空白孔调零。 ..流式细胞术检测食管癌细胞周期 ?取对数生长期食管癌细胞,胰酶消化计数,按个细胞/孔 接种于孔板,每组设个复孔,用培基标定体积至,。培养过夜; ?转染:转染当天把腺病毒按要求稀释到合适浓度,值为,. 对照组不含一基因的对照腺病毒病毒滴度为./.. 含.基因的重组腺病毒联合治疗组..转染后进行照射。 用新鲜培养基稀释病毒,不要涡旋; ?继续培养,?孵育过夜; ?培养后收集所有悬浮及贴壁细胞于不同的管中,标记; ?细胞周期测定: .每组各取两孔肿瘤细胞。离心,弃去上清; .加入冷液,轻震使细胞悬浮。。离心,弃去上 清; .重复步骤两次; .%冰乙醇固定?,?保存; .检测前用冷液洗涤次后加入碘化丙啶,轻轻混匀。 ?避光反应.; .测定前将细胞悬液用目尼龙膜过滤,以单细胞悬液为好过滤时 注意 手法以免细胞液流失; .将细胞悬液加入流式细胞仪的样品室,以激发波长检测。 注意事项:单细胞悬液,用配成细胞密度×/。 ..流式细胞术检测食管癌细胞凋亡 正常细胞膜磷脂的分布是不对称的,膜内表面含有带负电的磷脂 如膜磷 脂酰丝氨酸,,而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。在 细胞凋亡的早期位于细胞膜脂质双层内侧的膜磷脂酰丝氨酸可 迁移到细胞外层 表面。抗凝剂是分子量为.的依赖的磷脂结合蛋白,可 特异的结合磷脂酰丝氨酸残基,并且与具有很高的亲合力,因此 可作为探针识别细胞膜表面是否有,从而识别凋亡细胞。坏死细胞也可以在 天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 细胞膜表面出现,但二者有本质的区别:凋亡的初始阶段细胞膜是完好的, 而细胞坏死在初始阶段其细胞膜的完整性就被破坏了,因此建立了一种 与双染同时区分凋亡和坏死细胞的方法,凋亡细胞由于其细胞膜保持完好 故对染料有拒染性而不会有红色荧光产生正常细胞与此类似,而坏死细胞由 于其细胞膜的损伤可被着染而产生红色荧光。在流式细胞术双参数散点图上 和双阴性代表正常细胞; 阳性阴性代表凋亡早期细胞; 凋亡晚期或坏死细胞则显示 和双阳性。 ?取对数生长期食管癌细胞,胰酶消化计数,按×个细胞/孔 接种于孔板,每组设个复孔,用培基标定体积至,?培养过夜; ?转染:转染当天把腺病毒按要求稀释到合适浓度,值为,. 对照组不含.基因的对照腺病毒病毒滴度为.× /.. 含.基因的重组腺病毒病毒滴度为/联合治疗组.. 转染后进行照射。用新鲜培养基稀释病毒,不要涡旋; ?继续培养,?孵育过夜; ?培养后收集所有悬浮及贴壁细胞于不同的管中,标记。 按.细胞凋亡试剂盒测定: .一共个组,分别为、、、、 、.组、.. 组、 单独照射组、联合治疗组每组各取另一孔肿瘤细 胞,?离心,弃去上清:前组取对数生长期食管癌细胞, 胰酶消化计数,每组取个细胞: .加入冷液,轻震使细胞悬浮。?离心,弃去上清; .组加入%甲醛液,于冰上孵育。于其它各组每 ,重悬将细胞液转移至相应的管内 孔分别加入× .组中不加任何试剂,组加,组加 .,、.、..组、单独照射组、联合治疗组分 别加入.,组孵育半?离心,去 .; 掉上清液,加入 .混匀,避光冰上反应 ,然后用特殊滤膜过滤成单细胞悬液,上流 式 细胞仪检测细胞凋亡率。 注意事项:天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 ?由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程,因此我们建议您最好在着色后 立即进行分析; ?操作过程中应该带上橡胶或一次性手套,避免接触皮肤; ?对可能产生污染的器皿/试剂进行清洗并做灭菌处理,最好的方法是在 .?高压灭菌; ?如果您需要固定细胞,请在固定前先将细胞与 进行孵育, 并用 结合液洗掉未结合的 。因为固定产生的细胞碎片 可以和 结合,对结果产生干扰; ?如果细胞样品中含有血小板,如血液样品,请使用含有的缓冲剂 结合,从而干扰 并离心洗去血小板。因为血小板含有,能与 实验结果; ?旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底, 避免开盖时液体洒落; ?细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞; ? 是光敏物质,在操作时请注意避光; 和 ?成功的检测凋亡受以下几种因素的影响,如细胞类型、细胞膜 上的密 度、发生凋亡时翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、 诱导凋亡的 时间等,把这些影响因素进行优化对实验成功与否至关重要。 ..食管癌细胞内.基因表达的变化 ...接种细胞 个细胞接种于培 于转染前一天取对数生长期食管癌细胞,按× 养瓶内,设空白对照组、..含.基因的重组腺病毒、联合治疗组 ..转染后进行照射。 ...转染 转染当天把腺病毒按要求稀释到合适浓度,值为,..含 .基因的重组腺病毒病毒滴度为/..联合治疗组 .一转染后进行照射。用新鲜培养基稀释病毒,不要涡旋; 继续培养,?孵育过夜。 ...按照提取试剂盒公司操作方法提取总 ....消化细胞 ?弃除瓶内的旧培养液; 天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 ?向培养瓶中加入液,轻轻摇动培养瓶,使其流遍所有细胞表面, 然后倒掉,重复.次; ?向培养瓶中加入.%的胰酶含.%,轻轻晃动培养瓶使 胰酶均匀覆盖所有细胞表面,倒置显微镜下观察,细胞变圆,胞质回缩,细胞 间距增大时,可用手拍打瓶侧壁与底壁,会发现细胞很快悬浮不弃消化液, 加入含%牛血清的培养基终止消化; ?用弯头吸管吹打细胞,吹打过程要按顺序进行,从培养瓶底部以一边开 始到另一边结束,确保所有底部都要吹打;轻柔吹打使细胞从培养瓶上脱落, 在显微镜下观察细胞形态,以大部分细胞呈单个游离细胞为最佳; ?加入新鲜的培养基终止消化,将细胞转移至离心管内,离心, 弃去上清液至,混匀; ?将细胞液从离心管内移至处理的.管内,于。离心 ,弃去上清液。 ....提取总 ?配液:裂解液每裂解液中加入.巯基乙醇 %乙醇每 无水乙醇加入水稀释液:每一份 加入份的无水乙醇 ?将上述提取的细胞悬液加入配好的裂解液,在快速混匀器中混匀 直至未看见细胞絮状物或沉淀物; ?于。离心,取上清液至另一干净管内; ?按裂解液:%乙醇:加入%乙醇,混匀; . ?将管内液加入试剂盒提供的有收集管的柱子中,。 离 心,弃去滤过液,将柱子重新插入收集管内;重复上述步骤,直至 样品液加 兰’ ;;?取 加入柱子内,。 离心,弃去滤过液和 收集管; ?将柱子插入新的收集管内,加入 稀释液,。 离心,弃去滤过液。之后再用 稀释液洗一次: ?不加任何液体将柱子于。 离心,弃去收集管; ?将柱子插入回收管内,加入无酶水; ?于室温下孵育,将柱子于。 离心,使从膜上洗天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 脱至回收管内。 注意事项: ?整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作; ?所有的玻璃器皿均应使用前于。的高温下干烤或更长时间; ?塑料器皿可用.%水冲洗,晾干; ?设置操作专用实验室,所有器械等均应专用; ?提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要, 要不然会 有蛋白质污染。影响比值。 ... 的定量 用紫外分光光度法在和两个波长下读数,可根据在和 的读数的比值/估计核酸的纯度,纯品的/ 为.,如果样品中污染蛋白质或酚,其比值将明显低于此值。 取一定量的液,稀释至适宜浓度,测/比值,计算总 且 里 ?紫外分光光度计充分预热,比色杯使用前用浓盐酸:甲醇:浸 泡, 然后用水彻底冲洗; ?充分混匀原液,离心,先加水,再吸原液,混 匀,离心; ?吸水于比色杯中,混匀,扫基线。弃去水,吸 稀释液于比色杯中,混匀; ?在和两个波长下读数,算出/,得出浓 度。 浓度稀释倍数×单位/ 含量浓度×溶解体积单位 ... 非变性电泳 ,加热熔化; ?取.琼脂糖凝胶粉,加入的 ?使凝胶液冷却至?,加入溶液; ?将温热的琼脂糖倒入放有梳子的胶模中,冰箱放置,凝胶充分 凝固 后,拔去梳子; ,液面漫过胶面。 ?把胶模放入电泳槽中,并在电泳槽中倒入 盖上电泳槽,接通电源,预电泳; 天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 ?样品和上样缓冲液混匀,上样,电泳; ?凝胶图像处理下系统观察电泳结果。 注意事项:电泳槽可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再 浸泡在%。 水,然后用.%水冲洗,晾干。 ...按试剂盒的操作方法逆转录和扩增目的基因 ....逆转录和扩增目的基因 ?配液按的体系配液:每个管内加入.,加入原液, 加入.的目的基因的上游引物,加入.的目的基因的下游引物,加 双蒸 水定容至。有涡旋混匀,并依次进行下述步骤;。 ?预热扩增仪; ?将管放入仪中,合成。,个循环,变性。, 个循环,扩增。变性秒,?退火秒,。延伸,总共 个循环,延伸?,个循环。降温至?。合成好的液储存于一 ?。 ...琼脂糖电泳鉴定目的基因 ,加热熔化; ?取.琼脂糖凝胶粉,加入的 ?使凝胶液冷却至?,加入溶液; ?将温热的琼脂糖倒入放有梳子的胶模中,冰箱放置,凝胶充分 凝固 后,拔去梳子; ?把胶模放入电泳槽中,并在电泳槽中倒入,液面漫过胶面。 盖上电泳槽,接通电源,预电泳; ?目的基因的样品和上样缓冲液混匀,上样,电泳; ?凝胶图像处理下系统观察电泳结果。 ...内参基因的扩增 ?配液按的体系配液:每个管内加入.,加入原液, 加入的内参基因的上游引物,加入的内参基因的下游引物,加双 蒸水定 容至。有涡旋混匀,并依次进行下述步骤; ?预热扩增仪; ?将管放入仪中,合成?,变性?, 个循环,扩增?变性秒, ?延伸,总共个循环,降温至 ?。合成好的液储存于.?。天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 ...琼脂糖凝胶电泳鉴定内参基因 ?取.琼脂糖凝胶粉,加入的,加热熔化; ?使凝胶液冷却至。,加入溶液; ?将温热的琼脂糖倒入放有梳子的胶模中,冰箱放置,凝胶充分 凝固 后,拔去梳子; ?把胶模放入电泳槽中,并在电泳槽中倒入,液面漫过胶面。盖 上电泳槽,接通电源,预电泳: ?内参基因的样品和上样缓冲液混匀,上样,电泳; ?凝胶图像处理下系统观察电泳结果; 软件进行灰度分析。 ?用 ..食管癌细胞中.基因蛋白表达变化 ...接种细胞 于转染前一天取对数生长期食管癌细胞,按个细胞接种于培 养瓶内,设空白对照组,..含.基因的重组腺病毒联合治疗组 ?.转染后进行照射。 ...转染 转染当天把腺病毒按要求稀释到合适浓度,值为,..含. 基因的重组腺病毒病毒滴度为×/..联合放疗组.. 转染后进行照射。用新鲜培养基稀释病毒,不要涡旋:继续培养, ?孵育过夜。 ...消化细胞及提取蛋白 ?弃除瓶内的培养液; ?向培养瓶中加入液,轻轻摇动培养瓶,使其流遍所有细胞表面, 然后倒掉,重复.次; ?向培养瓶中加入.%的胰酶含.%,轻轻晃动培养瓶使 胰酶均匀覆盖所有细胞表面,倒置显微镜下观察,细胞变圆,胞质回缩,细胞 间距增大时,可用手拍打瓶侧壁与底壁,会发现细胞很快悬浮不弃消化液, 加入含%牛血清的培养基终止消化; ?用弯头吸管吹打细胞,吹打过程要按顺序进行,从培养瓶底部以一边开 始到另一边结束,确保所有底部都要吹打:轻柔吹打使细胞从培养瓶上脱落,在 显微镜下观察细胞形态,以大部分细胞呈单个游离细胞为最佳; 天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 ?加入新鲜的培养基终止消化,将细胞转移至离心管内,离心, 弃去上清液; ?加入液至离心管内,重悬,离心,弃去上清液; ?重复第步骤一次; ?加入.蛋白裂解液,于冰上混匀,将裂解好的细胞液转 移至管内,于。离心,取上清液,将提取好的蛋白分装并进 行标记,储存于.?。 ...按照标准蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度 ?配液:工作液:份溶液和份溶液; ?取出一孔板加标准蛋白及待测蛋白,于每孔分别加入、、、 、、、标准蛋白,于每孑入待测蛋白,设个复制孔; ?加双蒸水把每孔补足至 ; ?向待测样品孔和标准蛋白孔加入工作液,混匀; ?放入孵箱温育后,冷却至室温; ?于酶标仪波长下测定吸光度: ?制作标准曲线,从标准曲线中求出样品浓度。 ... ....配胶及电泳 ?根据不同的分子量配制不同浓度的分离胶 胶浓度与分子量关系如下实验室常用的分离胶浓度为?%: 丙烯酰胺浓度% 线性分离范围如 ~ ~ . ~ . ~ ?配制%的分离胶 . . %丙烯酰胺 ×分离胶 . % 】% 】 天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 ’’ 混匀后,加入制胶板内,不要混入气泡,加双蒸水封胶; ?待分离胶与水分层之后,将水吸干; ?配浓缩胶 . . %丙烯酰胺 . ×浓缩胶 % % 混匀后,加入制胶板中,不要混入气泡,并放置梳子,待其凝固; ?准备蛋白样品 ,混匀后,于仪中。变性; 份蛋白样品和份 ?拔除梳子,进行上样; ?浓缩胶进行电泳,分离胶电泳 ?电泳后,切胶,留下需要分析的凝胶。放入转移中浸泡。 ....转膜 ?将张硝酸纤维素膜和张滤纸剪成与胶同样大小。将切好的硝酸纤维 素膜置于无水甲醇中浸泡,滤纸在转移缓冲液中浸泡,滤纸之间不能有气 泡: ?从阴极至阳极,从下自上依次放置层滤纸,凝胶,硝酸纤维素膜及 层滤纸。每放一层都应注意排除气泡。膜两边的滤纸不能相互接触,否则引起 短路; ?将铺好的三明治放入转移槽中,要使夹得黑面对槽的黑面,夹得白面对 槽的红面。接通电源,恒流/,转移; ?关闭电源,拆卸转移装置,逐一掀去各层。将凝胶转移至盛有考马斯亮 蓝染液的托盘中,进行染色,可检查蛋白质转移是否完全。要观察上蛋白的情 况可将膜在丽春红中染色.,然后蒸馏水冲洗; ?将硝酸纤维素膜放置平皿中,加入适量封闭液,室温于往复式脱色摇床 上摇动封闭。用液于摇床上洗次,每次。 ....孵育抗体天津医科大学硕士学位论文 材料与方法 ?将膜放入塑料袋内,加入用封闭液稀释好的一抗:于度往复 式脱色摇床上摇动封闭过夜,用液于摇床上洗次,每次; ?将膜放入塑料袋内,加入用封闭液稀释好的二抗:于室温往复 式脱色摇床上摇动封闭,用液于摇床上洗次,每次。 ....曝光 ?将和两种显色剂在管内等体积混匀,之后,将膜蛋白朝下 与此混合液充分接触,后,将膜转移至一保鲜膜上,去尽残液,包好,放 入.光片夹中; ?在暗室中,将×显影液和定影液分别倒入塑料盘中,在红灯下取出.光 片,用切纸刀剪裁适当大小,打开.光片夹,把.光片放在膜上,一旦放上, 便不能移动,关上.光片夹,取出.光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明 显条带后,即可终止显影,显影时间一般为,显影结束后,马上把.光 片浸入定影液中,定影时间一般为.,以胶片透明为止,用自来水冲去残 留的定影液后,室温下晾干; 软件进行灰度分析。 ?将胶片进行扫描,用 注意事项: ?丙烯酰胺具有很强的神经毒性,并可通过皮肤吸收,其作用具有积累性, 配制时应戴手套、口罩等。聚丙烯酰胺无毒,但也用谨慎操作,因为有可能含 有少量的未聚合成份; ?电泳之前要最好进行预电泳,加样之前,样品应先离心; ?从凝胶板上切下一角作为加样标记; ?曝光时间可短至几秒也可以长至数小时。 结果 天津医科大学硕士学位论文 矽士甲 当日卜联合照射对食管癌 细胞生长的影响 从生长曲线看出,空白对照组、.组和?.基因组细胞 数量随培养时间延长呈增加趋势。转染后第天开始,单独照射组 和联合治疗 组细胞生长明显缓慢,与?.基因组和.组比较差异有统计学意义 .,.;联合治疗组与单独照射组和?组比较差异有统计 学意义.,.。在转染后第天,?一基因组的细胞生长开 始明显比空白对照组和.组慢.,.,空白对照组与? 组相比差异无统计学意义.,其中联合治疗组细胞生长最为缓慢, 见图 . ? ; ? ? 空白对照组 ?组 吸 值 .一基因组 ?,? 芍 , 霉 一单独照射组 【:二兰二联合治疗组 ??. 第天 天 第天 第天 第天 转染后时问 图 .一作用于细胞的生长抑制曲线 ? 一联合照射对食管癌细胞生长抑制率的比较 .一基因组、单独照射组和联合治疗组对细胞生长均有抑制作 用,单独照射组的抑制率显著高于..基因组,联合治疗组的抑制 效应最 强,达到%。联合治疗组与..基因组比较差异有统计学意义., 见表。结果提示,?.基因对细胞的生长具有抑制作用,而?一 基因与放射治疗联合应用具有协同效应,能更有效地抑制肿瘤细 胞的生长。空白 对照组及?组做为阴性及阳性对照,说明此抑制作用来自一基因 的 表达,而不是腺病毒本身。天津医科大学硕士学位论文 结果 空白对照组 .?. .组 .?. ?. ..基因组 .?. ?. 单独照射组 .?. ?. 联合治疗组 .?. ?. ? 一联合照射对食管癌 细胞周期及凋亡率的影响 从流式细胞仪分析结果可见,与空白对照组和.组相比,?. 基因组、单独照射组和联合治疗组细胞停留在期的细胞增加,联 合 治疗组期细胞所占比例最高,达到.%,凋亡率.%,期细胞最少 为.%,见表。结果表明,.一联合照射使细胞主要阻滞在 期,促进细胞发生凋亡。 表 ..转染后细胞的细胞周期 食管癌细胞内 基因表达的变化 ..转染细胞后提取,经扩增出预计的.基 因片段,见图.空白对照组、..基因组、联合治疗组的. 基因相对表达量分别为.、.、.。..组细胞中.基因 表达量比空白对照组高,联合治疗组.基因表达量最多,分别是.. 组和空白对照组的.倍和.倍。结果表明..有效转染了细胞, 联合治疗又诱导了.基因表达的增加,.基因与放射治疗联合应用 具有 协同效应。天津医科大学硕士学位论文 结果 图 :空白对照组 :空白对照组内参:..组:.. 基因组内参:联合治疗组:联合治疗组内参 食管癌细胞内 基因蛋白表达的变化 基因蛋白的特异性条带出现在标准相 检测发现. 对分子量 左右,所有标本的内参一都显示清晰的条带,出现在 对蛋白印迹带进行分析:空白对照组、 左右。利用灰度分析软件 .组、单独照射组及联合治疗组.的相对表达量为.、.、. 和.,见图,。个组均表达.基因蛋白,联合治疗组.表达量 最高,..组表达明显比空白对照组及单独照射组高。结果表明,.. 有效转染了细胞,联合治疗又诱导了.基因蛋白表达量的增加,. 基因治疗与放射治疗联合应用具有协同效应。从左至右分别为空 白对照组、 .一组、单独照射组、联合治疗组。 ? 图为.在食管癌细胞中的表达情况 .基因蛋白 图为.在食管癌细胞中的表达情况天津医科大学硕士学位论文 讨论 讨论 .食管癌的基因放疗 食管癌是常见的消化道恶性肿瘤,预后较差。我国是食管癌的高发区,据 估计世界上一半以上的食管癌患者是中国人。在临床上所见到的食管癌患者多 属中晚期,在确定诊断后,未经治疗者平均生存期为四个月。手术是食管癌的 首选治疗方法,但能根治性手术治疗的病人仅占全部病人的/。放射治疗是目 前中晚期食管癌首选的治疗方法。尽管手术技巧、放疗设备和技术不断改进,但 多年来食管癌的治疗效果并无根本提高,总年生存率约为.%。因此食管癌 的综合治疗为当今治疗的一个重要策略。食管癌的发生、发展涉及多种抑癌基 因、、、和原癌基因周期素、、.、., 目前还不能在分子水平上对食管癌做出充分的解释,但我们可以考虑用基因治 疗处理食管癌。就目前的研究现状,肿瘤的基因治疗存在有效性和安全性等问 题,尚不能代替现有常规治疗手段,但研究已表明其可以用来提高放、化疗的 敏感性,减少肿瘤的复发和转移等。近年来肿瘤基因治疗已成为新的研究热点, 而基因治疗技术也正日益渗入到放射治疗中。如何有机地将基因治疗及放射治 疗结合起来,已成为是当前肿瘤治疗的研究热点,也是今后肿瘤治疗的发展方 向。 当前基因放射治疗法比较有前途的有放疗联合细胞因子基因治疗、放射调 控转移基因体内表达、放射诱导基因治疗、促进分子化疗自杀基因治疗。基 因治疗的实施包括以下三个方面:选择有治疗意义的目的基因;建立有效地向靶 细胞转移目的基因的载体系统;使目的基因在靶细胞中高效表达以及对此表达 的调控,发挥生物学效应,达到治疗目的。基于以上理论基础,我们进行实验 设计,将已构建好的重组腺病毒..基因于体外转染食管癌细胞, 转染后进行射线照射,观察一基因联合放疗对食管癌的抑瘤作用, 同时为食管癌的基因放疗提供实验基础和理论依据。 .目的基因的选择 肿瘤的发生是多因素、多环节、多阶段的复杂过程,与肿瘤的发 生有关的 基因很多。基因治疗在许多体外实验中取得可喜的成果。在肿瘤 的基因治疗中, 以细胞因子基因为代表的免疫基因治疗应用得最为广泛