妥布霉素滴眼液含量测定

妥布霉素滴眼液含量测定 摘 要 目的:研究妥布霉素滴眼液的含量测定方法，比较各种方法的优点。 方法:(一)建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测法(HPLC-ELSD)测定妥布霉素滴眼液的含量。 (二)采用双波长紫外分光光度法测定妥布霉素的含量。 (三)以邻苯二甲醛(PHT)为显色剂的比色法测定妥布霉素滴眼剂的含量。 (四)比较三种方法。 结果:HPLC-ELSD方法专属性强，准确可靠，适用于妥布霉素滴眼液产品质量控制。 双波长紫外分光光度法准确简便，重现性好，可用于制剂的质量控制。 比色法具有快速、简便、准确、重现性好等优点，适合于产品中间体的质量控制和医院制剂的快速。 关键词 妥布霉素 含量测定 HPLC-ELSD 含量测定 比色法 I ABSTRACT Objective: Research the content determination of tobramycin eye drops and compare the methods. Methods: (1) To establish an HPLC - ELSD method for the content determination of tobramycin eye drops. (2) To establish the double wavelength ultravioletspectrophotometry method for the content determination of tobramycin eye drops. (3) To establish the colorimetric method use PHT as the chromogenic reagent for the content determination of tobramycin eye drops. (4) Compare various methods. Results: The HPLC-ELSD is simple accurate and reliable. It is suitable for the routine quality control of tobramycin eye drops preparations. The double wavelength ultravioletspectrophotometry method is simple, accurate, reliable, reproducible, and could be used for the routine quality control of the preparation. The colorimetric method is rapid, simple, accurate, reproducible, rapid analysis and quality control of the preparation and the hospital are suitable for intermediate Key words tobramycin content determination HPLC –ELSD content determination colorimetric method II 目 录 第1章 文献综 述 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 1. 1妥 布霉素的发现以及应用 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 1. 2妥布霉素含量测定方法以及优缺 点 „„„„„„„„„„„„„„„„2 1. 3本课题研究的内容及意 义 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2 第2章 高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测 法 „„„„„„„„„„„„3 2. 1仪器与试 药 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3 2.1.1原料与仪 器 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3 2.1.2色谱条 件 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3 2. 2实验方法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 2.2.1强力破坏试 验 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 2.2.2系统适应性试 验 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 2.2.3线性关系试 验 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 2.2.4灵敏度试 验 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 2.2.5稳定性试 验 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 2.2.6回收率试 验 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 2.2.7重复性试 验 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 2.2.8样品测 定 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 2. 3结果与对比 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„8 第3章 双波长紫外分光光度 法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 3. 1仪器与试药 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 3.1.1原料与仪 器 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 3.1.2处 方 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 3. 2试验方 法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 3.2.1测定波长的选 择 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 3.2.2线性关系及标准曲线的绘 制 „„„„„„„„„„„„„„„„„9 3.2.3回收率试 验 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„10 3.2.4含量测 定 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„10 3. 3试验结果 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„10 第4章 比色 法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„11 4. 1仪器与试药 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„11 4. 2实验方法与结 果 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„11 I 4.2.1邻苯二甲醛(PHT)试液的配制 [18] „„„„„„„„„„„„„„11 4.2.2妥布霉素衍生物吸收光 谱 „„„„„„„„„„„„„„„„11 4.2.3妥布霉素衍生物稳定 性 „„„„„„„„„„„„„„„„„11 4.2.4重现 性 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„11 4.2.5标准曲线的绘 制 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„12 4.2.6样品含量测 定 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„12 4.2.7回收率试 验 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„12 4.2.8比色法与微生物法的比 较 „„„„„„„„„„„„„„„„13 4. 3试验结果 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„14 第5章 结 论 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„15 5. 1准确性 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„15 5. 2通用性 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„15 参考文 献 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„16 致 谢 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„18 II 第1章 文献综述 妥布霉素属氨基糖苷类抗生素。抗菌谱与庆大霉素近似，对大肠埃希菌、产气杆菌、克雷白杆菌、奇异变形杆菌、某些吲哚阳性变形杆菌、铜绿假单胞菌、某些奈瑟菌、某些无色素沙雷杆菌和志贺菌等革兰阴性菌有抗菌作用;本品对铜绿假单胞菌的抗菌作用较庆大霉素强3,5倍，对庆大霉素中度敏感的铜绿假单胞菌对本品高度敏感。革兰阳性菌中，金黄色葡萄球菌(包括产内酰胺酶株)对本品敏感;链球菌(包括化脓性链球菌、肺炎球菌、粪链球菌等)均对本品耐药。厌氧菌(拟杆菌属)、结核杆菌、立克次体、病毒和真菌亦对本品耐药。本品的作用机制是与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成。 1. 1妥布霉素的发现以及应用 妥布霉素(tobramycin)是1967年由链霉菌得到的抗生素，亦可从kanamycin B脱氧制备，临床制剂为其硫酸盐。 妥布霉素适用于绿脓杆菌、变形杆菌(吲哚阳性和阴性)、大肠杆菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属及葡萄球菌(包括耐青霉素G与耐甲氧西林菌株)所致的新生儿脓毒症、败血症、中枢神经系统感染(包括脑膜炎)、泌尿生殖系统感染、肺部感染、胆道感染、腹腔感染(及腹膜炎)、骨骼感染、皮肤、软组织感染(包括烧伤)、急性与慢性中耳炎、鼻窦炎等。该品用于绿脓杆菌脑膜炎或脑室炎时可同时鞘内注射给药;用于支气管及肺部感染时可同时气溶吸入该品作为辅助治疗。妥布霉素对多数D组链球菌感染无效。用于结膜炎、角膜炎等眼部细菌感染，特别是对庆大霉素耐药的革兰阴性秆菌感染，如严重的绿脓杆菌感染有效。 妥布霉素由肌注后吸收迅速而完全。局部冲洗或局部应用后亦可经身体面吸收一定量。吸收后主要分布于细胞外液;其中5,15%再分布到组织中，在肾皮质细胞中积蓄，该品可穿过胎盘。分布容积为0、26L/kg。尿液中药物浓度高，肌注1mg/kg后尿中浓度可达75,100μg/ml。滑膜液内可达有效浓度，在支气管分泌液、脑脊液、胆汁、粪便、乳汁、房水中浓度低。肌注1mg/kg后血药浓度可达4μg/ml;静滴上述剂量1小时，其血药浓度与肌注相似。T1/2为1、9,2、2小时，蛋白结合率很低。该品在体内不代谢，经肾小球滤过排出。24小时内排出 1 给药量的85,93%。该品可经血液透析或腹膜透析清除。 1. 2妥布霉素含量测定方法以及优缺点 妥布霉素tobramycin是从黑暗链霉菌Streptomyces tenebrarius发酵液中提取得到的具有广谱抗菌活性的氨基糖苷类抗生素，其含量测定方法主要有微生物效价测定法[1-3]、旋光法[3]、UV衍生化法[3]、高效液相色谱- 间接光度检测法 [3]HPLC-IPD[4]、HPLC衍生化法[5-7]、HPLC电化学检测器法[8]及TLC ，但常用的微生 物效价测定法测定误差较大，衍生化法影响因素较多，而电化学检测法使用不易，较难普及。近年来国内外有文献报道采用蒸发光散射检测技术ELSD分析氨基糖苷类抗生素 [9-13]，中国药典2005年版也已收载该检测技术和部分相关品种;以HPLC-ELSD测定妥布霉素及其制剂的方法也陆续见诸报道。 1. 3本课题研究的内容及意义 含量测定是指原料药可用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。 制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，必要时，与另一个已建立准确度的方法比较结果。一般制剂的含量测定的回收率是向辅料中加入处方量80,、100%、120%已知含量的主药，按含量测定的方法测定。溶出度测定方法的回收率按处方量50,、80,、100,加入主药进行测定。 妥布霉素对听神经和肾脏有一定毒性，可引起肾损害，对肾脏的毒性较庆大霉素为少见，仅约1%的病人有肾功能武失常的征候，如管型尿、少尿、蛋白尿或血清肌酐浓度升高等。肾功能不全者可引起胃肠道反应:恶心，呕吐，食欲不振，腹胀，腹泻、可有肝损害，转氨酶升高、血小板减低、白细胞减低、粒细胞减低、皮疹、静脉炎等。血象改变、剂量大时 可有神经毒性、二重感染、中毒性精神病均可发生。 因此药品内含量检测直接关系到给药剂量，必须严格要求药品含量以确保给药剂量在可接受范围之内。 2 第2章 高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测法 2. 1仪器与试药 2.1.1原料与仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，Dikma SEDEX 75型ELSD检测器美国安捷伦科技有限公司; 水为重蒸水; 三氟乙酸、甲醇均为色谱纯; 妥布霉素标准品批号:0340-200002 ，标示含量880 umg-1由中国药品生物制品检定所提供; 妥布霉素原料药1批批号:020501; 硫酸妥布霉素原料药1批批号:021003; 妥布霉素B组分杂质对照品无批号均由浙江海正药业股份有限公司提供; 妥布霉素滴眼液样品5批。分别为: 宁波唯森制药有限公司批号:20050301、20050302、20050303; 杭州易舒特药业有限公司批号:20041201; 眼力健杭州制药有限公司批号:2H0249; 上市或长期留样至今样品，规格均为5 mL?15 mg。 2.1.2色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax SB - C184.6 mm×250 mm，5 um; 柱温:35 ?; 流动相:0.2 mol?L-1三氟乙酸溶液-甲醇92?8; 流速:0.8 mL?min-1; ELSD漂移管温度:45 ?; 雾化气体压力:3.5 bar; 灵敏度信号增益GAIN值:5; 进样体积:10 uL。 3 2. 2实验方法 2.2.1强力破坏试验 取妥布霉素原料药5份，各约58 mg，分别置4个50 mL量瓶中，前3份分别加入1 mol?L-1冰醋酸溶液1 mL、l mol?L-1氨溶液l mL与3 过氧化氢溶液1 mL，第4份置120 ?恒温箱中放置，第5份不作任何破坏。各放置3 h后，分别加流动相溶解并稀释至刻度。按“2”项下的色谱条件，取上述各溶液的混合液10uL进样测试，记录色谱图。结果各受试样品中经极端条件破坏后产生的几种较大未知物峰与妥布霉素主组分峰均能良好分离。见图2-1: 图2-1 强力破坏试验的HPLC-ELSD图(1.0ml?min-1，GAIN=6) 1-未知物;2-未知物;3-妥布霉素 2.2.2系统适应性试验 取妥布霉素原料药和妥布霉素B杂质对照品各适量，用流动相溶解并 稀释制成每1 mL中含妥布霉素1 mg和妥布霉素B约0.05 mg混合溶液，取10 uL进样测试，记录色谱图，结果妥布霉素主组分和妥布霉素B 组分两峰之间的分离度达 4 6.54，表明本法建立的色谱条件可以达到系统适用性试验要求。见图2-2: 图2-2 系统适用性试验的HPLC-ELSD图(1.0ml?min-1，GAIN=6) 1-妥布霉素B分组;2-妥布霉素 2.2.3线性关系试验 取妥布霉素标准品，分别精密称取适量，加流动相溶解并稀释制成55.546，111.091，277.728，555.456，777.568，1 012.000，1 230.592，1 396.736ug?mL-1浓度的系列溶液，分别进样10 uL，记录色谱图。以妥布霉素主组分峰面积的常用对数为纵坐标，进样浓度ug?mL-1的常用对数为横坐标，以最小二乘法进行线性回归，得回归方程为:Y 1.29569 X 7.61388，r0.999 7。结果表明，妥布霉素浓度在55.55,1396.74 ug?mL-1内线性良好。 5 2.2.4灵敏度试验 取“3.3”项下较低浓度的梯度测试溶液1份，用流动相逐级稀释，精密量取10 uL进样测试，结果测得本法的检测限按信噪比3?1计算时为0.15 ug?mL–1，定量限按信噪比10?1计算时为0.45ug?mL-1。 2.2.5稳定性试验 取妥布霉素滴眼液样品1批批号:2H0249，加流动相稀释制成每1 mL 中含妥布霉素1 mg的溶液，于24 h内分别在1，2，4，8，12，16，24 h进样测试。结果妥布霉素主组分峰面积与硫酸根的峰面积的RSD分别为1.4和2.2，表明样品在24 h内稳定。 2.2.6回收率试验 为考察滴眼液辅料对含量测定方法准确性的影响，按处方制备不含主药的空白基质用于加样回收率测定。分别以标示规格15 mg的80、100及120精密称取妥布霉素标准品适量，按处方规定加入常量的空白基质，涡旋混匀，即制成模拟的妥布霉素滴眼液，依法测定，按随行标准曲线法计算妥布霉素的加样回收率。结果3组×3份试样的回收率依次为100.7、97.5、99.2、98.7、98.2、99.5、97.9、99.1及100.1，平均回收率为98.99 RSD1.05，n9，表明本法具有较好的准确性。 2.2.7重复性试验 取妥布霉素滴眼液样品一批批号:20050301，加流动相定量稀释制成每1 mL中含妥布霉素1 mg的溶液，共平行制备9份，依法测定，按随行标准曲线法计算样品中妥布霉素的含量。结果该批样品中妥布霉素的平均含量为103.5，RSD为0.77，表明本法具有良好的重复性 2.2.8样品测定 取妥布霉素滴眼液5个批次样品，分别加流动相定量稀释制成每1 mL中含妥布霉素1 mg的溶液，依法测定妥布霉素的含量;同时取上述各批样品，照妥 6 布霉素滴眼液现行国家标准制订的微生物效价检定法测定主药妥布霉素的含量。结果见表2-1与图2-3: 表2-1 妥布霉素滴眼液HPLC-ELSD法与微生物检定法含量测定结果的比较(=3) 图2-3 妥布霉素标准品溶液(A)和供试品溶液(B)的HPLC-ELSD图 (0.8ml?min-1，GAIN=6) 7 2. 3结果与对比 在对妥布霉素原料药所进行的前期研究18中，ELSD随行标准曲线法的含量测定结果与中国药典的微生物效价法测定结果基本一致，不过本试验以HPLC-ELSD测得的妥布霉素滴眼液中妥布霉素的含量与效价法测定结果相比均偏低。分析原因应是效价法的测定结果是该药物主成分与其次组分及相关物质抑菌活性的总和，而HPLC-ELSD实现了药物主成分与其他并存组分或杂质的分离，测得的结果是主成分含量的真实体现，比效价法更能反应样品的实际情况，因而是更为科学、专属的检测方法。 我国药典和国际药典标准中一般采用微生物法或衍生化法测定妥布霉素的含量，方法往往步骤繁杂，工作量大，耗时长，影响因素也较多。采用ELSD法检测具有简便、快速，样品无须处理及衍生化的优势，可以控制误差来源，提高分析精度，测定结果准确，方法经进一步改进和验证后并可同时进行样品的有关物质分析，有利于控制产品质量，提高药品生产水平。 8 第3章 双波长紫外分光光度法 3. 1仪器与试药 3.1.1原料与仪器 754紫外分光光度计(上海分析仪器厂); PHS-3C PH计 (上海雷磁仪器厂); 妥布霉素(批号20030507，福州抗生总厂提供) 丙酮、醋 酸、硼酸、磷酸、氢氧化钠、乙酰丙酮、甲醛均为分析纯。 3.1.2处方 妥布霉素1.5g、苯扎溴铵0.5ml，共制成 500ml。 3. 2试验方法 3.2.1测定波长的选择 取妥布霉素适量, 用0.2mol/醋酸、硼酸、磷酸、NaOH调pH2.5?0.05与等体积妥布霉素溶液混合后pH应为2 .6的缓冲溶液，另取乙酰丙酮 0.8ml,36%甲醛液1.7ml,加配制好的缓冲溶液30ml,搅匀为衍生化试剂，再取妥布霉10ug/ml与衍生化试剂等体积于具塞试管 中，在沸水中加热25min，冷至室温，于300,500nm波长范围内扫描，出现最大吸收为322nm。溶剂在此波长无吸收，故选择356nm波长分别为妥布霉素的测定波长。 3.2.2线性关系及标准曲线的绘制 取妥布霉素精密称定,用水稀释成(ug/ml)5、10、15、 20、25、30、35在356nm波长处测定吸收值其回归方程为: A=0.0154C+0.3075 r=0.9999，n=7 妥布霉素每毫升溶液含5,35ug内浓度与吸收值呈线性关系。 9 3.2.3回收率试验 模拟试样取五份样品，在356nm处测其吸收值代入回归方程，计算浓度，求得百分率。结果见表3-1: 表3-1 妥布霉素回收率试验结果(n=5) 3.2.4含量测定 取样品稀释至每毫升含妥布霉素30ug,衍生化后，在356nm 处测定吸收值，代入回归方程计算含量 3. 3试验结果 妥布霉素在5,35ug/ml范围内浓度与吸收值呈线性关系，平均回收率为99.93%，RSD为0.3210%。含量测定方法准确简便，重现性好，妥布霉素测其吸收值4小时内无变化，适用于工业化生产，可用于制剂的质量控制。 10 第4章 比色法 4. 1仪器与试药 UV—1601紫外可见分光光度计(日本);妥布霉素标准品(中国药品生物制品检定所，效价862u/mg，批号3408901);妥布霉素原料药(广东新北江制药股份有限公司);妥布霉素滴眼剂(中山医科大学眼科中心制剂室，5ml:15000u);邻苯二甲醛(德国)。 4. 2实验方法与结果 4.2.1邻苯二甲醛(PHT)试液的配制[14] 称取邻苯二甲醛100mg溶于适量pH值为10.5的硼酸盐缓冲液中，加1ml巯基乙醇，再加硼酸盐缓冲液至100ml，用饱和氢氧化钠溶液调至pH 值为10(5。 4.2.2妥布霉素衍生物吸收光谱 称取妥布霉素适量，以水为溶剂配成100μg/ml的标准溶液，精密吸取标准溶液1(5ml于10ml量瓶中，加异丙醇3ml，PHT试剂2ml，以异丙醇稀释至刻度，于60?水浴加热15min，以相应试剂作空白，在200,400nm波长范围内扫描，绘制吸收光谱，结果在333nm波长处有最大吸收峰。 4.2.3妥布霉素衍生物稳定性 以本品15μg,ml反应液在333nm波长处立即测定，与在室温放置0(5h、1h、1(5h、2h分别测得吸收度比较，结果几乎无变化。 4.2.4重现性 取妥布霉素15μg/ml的反应液5份，分别在333nm波长处进行测定，吸收度平均值为0.7754，标准差为0(0042，重现性良好。 11 4.2.5标准曲线的绘制 精密称取妥布霉素标准品适量，以水为溶剂配成100μg/ml的标准溶液，分别精密吸取标准溶液0.5ml、1(0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml置10ml量瓶中，分别加异丙醇3ml，PHT试剂2ml，用异丙醇稀释至刻度，以相应试剂作空白，于60?水浴加热15min，冷却至室温，在333nm波长处依次测定吸收度，将数据进行回归处理得回归方程为A=0.04918C+0.0394(C:μg/ml)，r=0.9997，妥布霉素衍生物线性范围1,30μg/ml。 4.2.6样品含量测定 精密吸取妥布霉素滴眼剂2ml，置100ml量瓶中，以水稀释至刻度。从上述溶液中精密吸取2ml于10ml量瓶中，加异丙醇3ml，PHT试剂2ml，用异丙醇稀释至刻度，以相应试剂作空白，于60?水浴加热15min，冷却至室温，在333nm波长处测定吸收度，利用回归方程计算百分含量。 4.2.7回收率试验 按妥布霉素滴眼剂处方制备模拟制剂，照样品测定项下操作，依法测得回收率，结果如表4-1: 12 表4-1 回收率试验 注:平均回收率为99.31%，RSD为1.08, 4.2.8比色法与微生物法的比较 分别用比色法和微生物法测定3批妥布霉滴眼剂的含量，结果如表4-2: 表4-2 微生物法与比色法测定结果比较(n=3) 13 4. 3试验结果 妥布霉素滴眼剂处方中各辅料经实验验证，对结果没有影响。实验结果表明，两法测定妥布霉素含量的结果，经统计学处理，无显著性差异(P >0.05)。 14 第5章 结论 5. 1准确性 三种方法都能准确测量妥布霉素滴眼液中妥布霉素的含量。 5. 2通用性 妥布霉素为较新的氨基糖苷类广谱抗生素，具有抗菌谱广，耐药性小， 毒性低，临床疗效好的特点。美国药典,15,和我国卫生部颁标准均采用 微生物检定法。相比较而言，HPLC-ELSD方法专属性强，准确可靠，适用 于妥布霉素滴眼液产品质量控制。双波长紫外分光光度法准确简便，重现 性好，可用于制剂的质量控制。比色法具有快速、简便、准确、重现性好 等优点，适合于产品中间体的质量控制和医院制剂的快速分析。 15 参考文献 [1] Ch.P 2005 Vol II. 中国药典2005年版. 二部 S. 2005: 270. 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[14]袁雯玮，李俊杰.高效液相法测定妥布霉素.药物分析杂志.1989，6: 343,345 [15] USP ? ? ?，1989:1281 17 致 谢 大学四年的学习已经接近尾声，这么段难忘的学习经历带给我的不仅是知识的积累，更是教会了我很多方法以及。回首这段载满欢声笑语的路程，真心的对每一个帮助过我、鼓励过我的人说一声:谢谢～ 在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请再次接受我最诚挚的谢意! 本论文的所有研究工作从论文的选题、实现条件到论文的写作等阶段都是在李顺福老师的悉心指导下完成的。从刚进校园的时候，我们可敬可爱的李顺福老师就给我留下了勤恳、敬业、和蔼、渊博的印象～而在后来的学习中，李老师更是以严谨的教学态度、科学的教学方法带领我们领略知识的海洋。这篇论文从开题、资料查找、修改到最后定稿，都倾注了老师的无尽心血。我很自豪有这样一位老师，她值得我感激和尊敬～ 感谢我的室友，是他们在我左右为难之事给我建议，更是对论文的文献采集、框架设计、结构布局提供了无私的帮助～四年时间积攒下的友谊，已经发酵成为醇香的帮助，感谢他们为我的付出～ 感谢我的父母，没有他们辛勤的付出也就没有我的今天，在这一刻，将最崇高的敬意献给你们～ 本文参考了大量的文献资料，在此，向各学术界的前辈们致敬～ 最后，再次向李老师，所有给予帮助的老师和同学表示深深的祝福，祝愿他们在今后工作顺利生活顺心～ 18