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第2章蛋白质氨基酸多肽蛋白质2.1蛋白质的元素组成C50~55%H6.9~7.7%O21~24%N15~17.6%S0.3~2.3%有些蛋白质还含有P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se等。各种蛋白质含氮量接近，平均为16%。2.2蛋白质的基本组成单位--氨基酸氨基酸的结构和分类氨基酸的解离性质氨基酸的化学性质2.2.1氨基酸的结构及其分类R不同，组成的氨基酸就不同组成蛋白质的常见氨基酸有20种，均为L-α-氨基酸L-α-氨基酸结构通式1、结构不带电形式两性离子形式2、氨基酸的分类20种氨基酸按侧链R的理化性质分为3类：侧链无极性侧链有极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸中性氨基酸-非极性（7个）亚氨基酸中性氨基酸-极性（8个）酸性氨基酸（2个）碱性氨基酸（3个）按侧链R基团的化学结构分：脂肪族氨基酸芳香族氨基酸杂环氨基酸人体必需氨基酸有八种：MetTrpLysValIleLeuPheThr“假设来借一两本书”脯氨酸为亚氨基酸2.2.2氨基酸的性质1、一般物理性质氨基酸都为白色晶体熔点很高，200℃以上分解氨基酸大多数都溶于水，并具有较高的介电常数以上性质说明：氨基酸具有某些盐的属性，与典型的羧酸或胺有明显不同。2氨基酸的解离性质及等电点实际上，氨基酸在晶体或水溶液中不是以中性分子，而是以两性离子的形式存在当pH<pI，氨基酸带正电荷，在电场向负极移动当pH>pI，氨基酸带负电荷，在电场向正极移动等电点的计算当溶液浓度为一定pH时，氨基酸分子中所含的-COO-和-NH3+数目相等，净电荷为0，这一pH即为氨基酸的等电点（pI）A、侧链不含解离基团的中性氨基酸B、酸性和碱性氨基酸的侧链分别含有可离解的羧基或氨基，有3个pK值，即pK1’，pK2’，和pKR’以天冬氨酸为例:酸性氨基酸碱性氨基酸计算丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸的pI值。(写出解离过程)氨基酸的解离常数P22表2-52.2.3氨基酸的化学性质α—氨基参与的反应α—羧基参与的反应α—氨基和羧基共同参与的反应侧链基团的性质1、α—氨基参与的反应α—氨基中的N是一个很好的亲核中心能够发生亲核加成或取代反应（1）氨基酸的甲醛滴定氨基酸的酸碱滴定的等当点pH过高（12～13）或过低（1～2），超出大多数酸碱滴定指示剂的显色范围。当形成二羟基衍生物后，pK降到7以下，滴定终点由12移到9附近，可用酚酞等作指示剂，可直接测定氨基酸的浓度。加成反应9.60(2)与HNO2反应氨基酸的氨基也和其他伯胺一样，在室温下与亚硝酸作用生成氮气产生的氮气一半来自氨基酸，另一半来自亚硝酸。在标准条件下，测定反应生成氮气的体积，即可计算出氨基酸的量——范斯来克法定量测定氨基酸一般羧酸的羧基不活泼，很难与氨基酸的氨基直接发生酰基化反应在羧酸与氨基酸的混合溶液中加入缩合剂（N,N’-二环己基碳二亚胺,DDC），可得到酰化产物(3)酰化反应酰卤或酸酐在弱碱性条件下可与氨基发生酰化反应，生成酰胺。N-苯甲酰甘氨酸经尿排出少量苯甲酸进入体内一般不会产生不良影响苯甲酸甘氨酸ATP经过匀浆的动物肝脏组织混合保温可以分离出N-苯甲酰甘氨酸亲电(4)烃基化反应与亲电性化合物，如卤代烃等，发生烃基化反应，生成烃基化产物。芥子气，二氯二乙硫醚毒理作用——氨基酸氨基发生烷基化反应，破坏蛋白质的正常功能(5)生成西佛碱的反应与醛酮发生加成-消除反应，生成西佛碱(Schiffbase)西佛碱是许多酶促反应的中间产物酶促反应的中间产物(6)脱氨基和转氨基反应在氨基酸氧化酶催化下,发生脱氨基反应转化为α-酮酸在转氨酶催化下，氨基酸的α-氨基可以转移到α-酮酸α-酮酸α—氨基参与的反应氨基酸的甲醛滴定与亚硝酸反应酰化反应烃基化反应—与亲电化合物反应生成西佛碱的反应—加成消除反应脱氨基及转氨基作用2.α—羧基参与的反应（1）成酯反应氨基酸在无水乙醇中通入干燥HCl或SOCl2（亚硫酰氯），然后回流得到氨基酸乙酯的盐酸盐，是制备甲酯和乙酯的常用方法。氨基酸的羧基与对硝基苯酚反应生成的酯，由于其酰基化的能力大大增加，成为“活性酯”活性酯是合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体对硝基苯酚（2）形成酰卤的反应酰基氨基酸与PCl3，PCl5或SOCl2（亚硫酰氯）反应得到相应的酰氯，是使氨基酸羧基活化的重要反应。（3）叠氮化反应氨基酸的甲酯或乙酯与无水肼反应得到氨基酸酰肼，再与亚硝酸反应得到叠氮化合物。羧基活化的常用方法氨基酸的叠氮衍生物常作为多肽合成活性中间体。氨基酸酰肼叠氮化合物多肽合成活性中间体氨基酸甲酯（4）脱羧反应在氨基酸脱羧酶作用下，脱羧生成相应的一级胺谷氨酸在谷氨酸脱羧酶作用下，脱羧生成γ-氨基丁酸脱羧产物有重要生理作用谷氨酸脱羧γ-氨基丁酸，一种重要的神经递质组氨酸脱羧组胺，使平滑肌痉挛，毛细血管扩张和通透性增加α—羧基参与的反应成盐反应—与碱反应成酯反应—与醇反应形成卤酰的反应—活化羧基叠氮化反应—与肼反应，活化羧基脱羧反应3.α—氨基和羧基共同参与的反应茚三酮反应成肽反应α—氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，氨基酸氧化脱氨生成酮酸，酮酸脱羧生成醛。茚三酮则被还原为还原茚三酮。还原茚三酮再与茚三酮和氨作用，生成蓝紫色物质①与茚三酮反应此反应是氨基酸的特异反应，用于氨基酸的定性或定量分析。产生的蓝紫色化合物可用比色法进行定性或定量测定测定反应中释放的CO2的量可计算氨基酸的量脯氨酸与茚三酮反应不释放氨，直接生成黄色化合物②成肽反应成肽反应是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。氨基酸之间形成肽键的反应，从热力学上看是一个不能自发进行的反应，通过活化羧基方法，可使成肽反应顺利进行4.侧链基团的化学性质巯基的性质羟基的性质咪唑基的性质甲硫基的性质芳香环的性质（1）巯基的性质A、具有弱酸性半胱氨酸侧链的巯基（-SH）具有弱酸性，在较高的pH条件下，巯基能够发生解离作用B、形成二硫键半胱氨酸侧链的巯基（-SH）易被氧化形成二硫键两分子半胱氨酸通过二硫键连接形成胱氨酸二硫键易被还原成巯基C、与过氧甲酸反应半胱氨酸的巯基在强氧化剂（如过氧甲酸）的作用下，可被氧化成磺基丙氨酸具有还原性胱氨酸的二硫键也可被过氧甲酸氧化，得到磺基丙氨酸可用于定量打开二硫键D、与重金属形成络合物半胱氨酸侧链的巯基（-SH）能与各种金属离子形成稳定程度不同的络合物含有巯基的蛋白酶发生此反应导致酶失活E、与卤代烃反应在弱碱性条件下能与卤代烃发生反应，生成稳定的烃基衍生物，可用于巯基的保护。苄氯碘乙酰胺苄氧酰氯F、与硝基苯甲酸二硫化合物（DTNB）反应其产物在420nm波长处有强烈吸收，可用比色法定量测定半胱氨酸的含量λmax=420nm具有弱酸性形成二硫键与强氧化剂作用（还原性）与各种金属离子形成络合物与卤代烃发生反应硝基苯甲酸二硫化合物（DTNB）反应（2）羟基的性质丝氨酸和苏氨酸中含有羟基A、丝氨酸中的羟基（pH≈15）在普通pH条件下，不发生解离但能与其它基团形成氢键B、丝氨酸和苏氨酸中的羟基能与酸形成酯在蛋白质分子中，丝氨酸与磷酸结合，如酪蛋白中含大量丝氨酸磷酸酯C、丝氨酸是大多数蛋白水解酶活性中心的组分多种酰基化剂能与酶活性中心的丝氨酸羟基作用，导致酶的失活组氨酸含有咪唑基组氨酸在中性条件下，具有如下解离平衡：（3）咪唑基的性质咪唑环的一侧的去质子化与另一侧的质子化同步进行，在酶的催化过程中具有重要作用。组氨酸中的咪唑基能发生多种化学反应1、某些酶的组氨酸残基可与ATP发生磷酸化反应，形成磷酸组氨酸，从而使酶活化。组氨酸中的咪唑基发生烷基化反应2、水解酶活性中心的组氨酸与烷基化试剂作用，生成烷基咪唑基衍生物，引起酶活性的降低或丧失。烷基咪唑基衍生物甲硫氨酸侧链上的甲硫基是强的亲核中心易与卤代烷等发生亲核取代形成烷基化产物（4）甲硫基的性质这种烷基化产物用巯基试剂处理，可除去烷基或原有的甲基。当甲硫氨酸与用14C标记的碘甲烷反应，再用巯基试剂处理时，能够得到50%含同位素标记的甲硫氨酸（5）芳香环的性质苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸分子含有芳香环A、是一个共轭π电子体系，易与缺电子体系或其它共轭π电子体系形成电子转移络合物B、这三种氨基酸在紫外区有特征吸收峰。蛋白质的紫外吸收（280nm）性质主要来自上述三种氨基酸的贡献。C、氨基酸的芳香环上也能发生亲电取代反应如酪氨酸分子含有酚羟基，它的3位和5位易发生亲电取代反应，如碘化、硝化和重氮化反应等。酚基与对氨基苯磺酸的重氮盐反应桔黄色化合物Pauly反应2.3多肽多肽多肽的性质天然存在的重要多肽2.3.1多肽(polypeptide)肽键（酰胺键）氨基酸残基(reside):主链、侧链氨基末端(aminoterminal)或N末端羧基末端（carboxylterminal）或C末端2.3.2肽键平面肽单元（peptideunit）或肽键平面：1925年L.Pauling和R.B.Corey等用X射线衍射分析肽键的C—N键长时发现其键长为0.132nm,不同于C—N单键键长0.149nm,也不同于C=N双键键长0.127nm.介于二者之间,故其有一定程度的双键性能,C与N不能以C—N为轴心自由旋转。参与肽键的6个原子Cα1、C、O、N、H、Cα2被约束于一个平面上，称为肽键平面肽平面C与N不能以C—N为轴心自由旋转参与肽键的6个原子Cα1、C、O、N、H、Cα2被约束于一个平面上，称为肽键平面为形成二级结构的基础2.3.3多肽的性质多肽的两性解离多肽链的反应1.多肽的两性解离pH净电荷＜3.7+23.7～4.6+14.6～7.807.8～10.2-1＞10.2-2某种四肽:－COOHpK＝2.4，－NH3＋pK＝9.8，侧链－NH3＋pK＝10.6侧链－COOHpK＝4.2，试计算此种多肽的等电点（pI）是多少？pH<2.42.4<pH<4.24.2<pH<9.89.8<pH<10.6pH>10.6pI=（4.2+9.8）/2=7.0已知六肽Ala-Thr-Leu-Asp-Ala-Lys中Asp侧链的pKa=3.9，Lys侧链的pKa=10.54，N末端氨基的pKa=8.0，C末端羧基的pKa=3.5，计算该六肽的pI值，并判断pH=7.0时的净电荷。pI为Asp侧链的pKa=3.9和N末端氨基的pKa=8.0之和的一半，pI=（3.9+8.0）/2=5.95在pH=7.0时，该六肽带负电荷2.多肽链的反应（1）多肽链的水解酸水解碱水解酶水解酸水解6MHCl，105℃反应20小时。优点：完全水解；不易引起水解产物的消旋化缺点：色氨酸被破坏；含羟基的氨基酸被分解；天冬酰氨和谷氨酰氨的酰氨基被水解下来，生成相应的游离氨基酸和NH3碱水解5MNaOH完全水解色氨酸不被破坏部分水解产物消旋化酶水解不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化，部分水解（2）氨基酸的邻基反应如果多肽链中存在Asn和Gly相邻排列的情况，在弱碱性条件下发生脱氨基作用由于侧链酰氨基中的羰基C具有弱亲电性，与肽链主链上亲核的N距离5个原子，易形成五元环。此反应常会引起氨基酸顺序分析出现错误脱氨基（3）多肽链的消旋化L-Val的水溶液在135℃下保温10h，有1%被转化为D-Val。碱性条件加速这种转变通过烯醇化实现（4）颜色反应多肽的双缩脲反应双缩脲能与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物含有两个以上肽链的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，生成紫红色或蓝紫色络合物，用于多肽定量测定。多肽链的水解氨基酸的邻基反应多肽链的消旋化颜色反应多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位也有许多相对分子质量比较小的多肽以游离状态存在这类多肽通常具有特殊的生理功能，称活性肽2.3.4天然存在的重要多肽脑啡肽高等动物中枢神经系统产生的一类小活性肽如Met-脑啡肽和Leu-脑啡肽脑啡肽与大脑的吗啡受体有很强的亲和力，具有与吗啡类似的镇痛作用谷氨酰半胱氨酰甘氨酸（三肽）谷胱甘肽（Glutathione，γ-GSH）GSH具有重要的功能-抗氧化剂1、保持巯基（-SH）酶活性2、维持红细胞膜的完整性红细胞膜上含有一些巯基酶和含巯基的蛋白质，使Hb处于还原状态。3、解毒功能：与重金属离子、环氧化物（致癌物）结合排出体外激素类多肽：激素的重要组成部分，由生物体内多种腺体和组织分泌产生，具有调控作用抗生素类多肽：由细菌分泌产生，具有良好的抗菌性能，有时含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Orn）某些蕈产生的剧毒毒素也是肽类物质如α-鹅膏蕈碱是环八肽α-鹅膏蕈碱能与真核生物的RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ牢固结合而抑制酶的活性，因而使RNA的合成不能进行，但不影响原核生物的RNA合成多肽肽平面多肽的性质天然存在的重要多肽