高危型人乳头瘤病毒感染与微小RNA-155在宫颈鳞癌组织及血清中的表达及意义

高危型人乳头瘤病毒感染与微小RNA-155在宫颈鳞癌组织及血清中的表达及意义 高危型人乳头瘤病毒感染与微小RNA-155在宫颈鳞癌组 织及血清中的表达及意义 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 高 危 型人 乳 头瘤 病毒 感 染与 微 小 RNA-155 在 宫颈 鳞癌 组 织 及 血 清中 的 表达 及意 义 中 文 摘 要 目 的 1 通过 检 测 子 宫 颈 鳞 癌患 者 高 危 型 人乳 头 瘤 病毒 的感染状态以及 宫 颈 鳞癌 组 织 中 微小 RNA-155 (miR-155 ) 的表达 , 从而 探讨 高危型 人乳头 病毒感 染与 miR-155 的表达 在 子 宫颈 鳞癌 发 生与发 展中的 作用及 关系。 2 检测 子宫 颈鳞癌 患者血 清中 miR-155 的表达,为 miR-155 作为子 宫 颈 鳞癌的标 志物提供 实验依 据。 方 法 1 选取 2011 年 12 月~2012 年 12 月在暨南大学附 属第一 医院妇 科因 子 宫 颈鳞癌入 院治疗的 患者 共 37 例作 为研究 组,其中 ? 期 12 例、? 期 11 例、 ? 期 14 例, 高分化 3 例、中分化 15 例、低分化 19 例。另 选择同 期因子 宫肌瘤 及 子宫腺肌 病行全子 宫切除 的患 者 20 例作为 对照组 。研究 组在 标 本获取 前均未 进 行放疗、 化疗以及 其它治 疗。 2 应用导流 杂交技术检测 全部研 究对象 的子 宫 颈脱落 细胞 中 人乳头 瘤病 毒 (HPV ) 感染状态 并分型 。HPV 感染 采用阳 性率表 示。 3 采用实时 荧光定量 PCR 法 测定 全 部研究 对象 的 子 宫颈 组织 ( 正常宫 颈 及宫颈癌 组织) 及 血清 中 miR-155 的表达 并 应用 相对 定 量 法分析 miR-155 的 表达 。 4 应用 SPSS13.0 统计 软件进 行处理 数据 。HPV 感染 的阳性 率采用 百分率 表示, 两 2 xs 组间比较 采 用检 验;miR-155 的 Ct 值用 均数? 标准差 ( ) 表示 , 经 方差 分析发 现 miR-155 的相对 表达量 不能满 足正态 分布和 方差齐 性条件 , 故 基因相 对表达量 以 M P25 ,P75 表 示,两组 之间的 宫颈组 织及血 清中 miR-155 的相 对表 达 量 采用 两 个独 立 样本 比 较的 Wilcoxon 秩 和 检验 进 行组 间 比较 。 三 组间 miR-155 的相对表 达量采 用两个 独立样 本比较的 Kruskal-Wallis H 秩 和 检验进行 I 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 组间比较 。 结 果 1 宫颈鳞癌 组 与 正 常宫颈 组中 人 乳头瘤 病毒 (HPV ) 感 染的阳 性率分 别 为 70.27% 和 5% , 两 组比 较 P0.05 。 全部 研究 对象共检 测 出 HPV 亚型 11 种 , 其中 HPV-16 型感染率 最高 (15.79% ) 。宫 颈鳞癌 组中仅 1 例低危型 HPV 感染 ,其 余 均为高 危型 HPV 感染,而 对 照组中 仅 1 例 HPV-52 型 感染 。HR-HPV 感 染的 阳性率分 别为 67.57% 和 5% ,P0.05 。 2 子宫颈 鳞 癌组织 中 miR-155 的相对总体表 达量为 0.52 (0.27-0.99), 而 对照组为 0.15 (0.07-0.21),两组比 较 P0.05 。 3 在宫颈鳞 癌 ?期中 miR-155 的相 对表达 量为 0.440.08-1.95 , ? 期的 相 对表达量 为 0.580.38-0.97 , ?期的 相对表 达量 为 0.210.06-0.56 , 三组比 较 P0.05 。 4 在高分化 宫颈鳞 癌 组 中 microR-155 的相对表 达量 为 0.250.06-0.44 , 而 在中分化 宫颈鳞癌 组 中的 相对表 达量 为 0.610.11-2.02 ) , 在低 分化宫 颈鳞癌 组中 的相对表 达量为 0.34 0.14-0.87 , 三组比 较 P0.05 。 5 在 HR-HPV 感 染的宫颈 癌组 织中 miR-155 的相对表 达量 为 0.44 (0.24-1.68 ) , 而 无 HR-HPV 感 染的宫颈 癌组织 miR-155 的 相对表达 量为 0.24 (0.06-0.50 ) , 两组 比较 P0.05 。 6 宫颈鳞癌 组 血清中 miR-155 的相对表达量为 45.79 (14.25-150.67 ) , 而 对照组血 清中 miR-155 的相 对表达 量为 3.29 (1.54-16.62), 两组比 较 P0.05 。 结 论 1 在 子 宫颈鳞癌 的发生与 发 展 过 程 中 , 存在有 高 危 型 人 乳 头 瘤 病毒 的感染 以及 miR-155 的表 达上调 。 高危型 人乳头 瘤病毒感 染可能 通过引 起 miR-155 的 表达上 调从而诱发子宫颈鳞 癌 的发生 。 2 miR-155 的表 达上调 可能为 子宫颈 鳞癌细 胞恶性 表现的 特征之 一, 可能 成为辅助 子宫颈 鳞 癌 的诊断或 制 定治疗 的 标志物 。 3 子宫颈鳞 癌患者 血清中 miR-155 的 表达 上调, 可能成为子 宫 颈鳞 癌 特 异性 的标 志物 ,对 子 宫颈 鳞癌 的 诊断以 及 治疗 后的追踪 随访 将取到 重要 作 用。 II 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞 癌组织 及血清中的表达及意 义关键词 子宫 颈鳞 状细胞 癌 ;微小 RNA-155 ;人乳 头 瘤病毒 ;实 时荧光 定量 PCR III 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈 鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 High risk- human papilloma virus infection and the expression of miR-155 in cervical squamous carcinoma tissue and serumAbstract AIM 1 Study the status of high risk- human papilloma virus infection and the expression of miR-155 in cervical squamous carcinoma patients. To discuss the role of high risk- human papilloma virus infection and miR-155 in the development of cervical squamous carcinoma2 Study the expression of miR-155 in serum. To provide the experimental evidence for serum miRNA -155 as a specific tumor marker of cervical squamous carcinomaMethods 1 Select 37 cases of patients with cervical squamous carcinoma from department of gynaecology of the first affiliated hospital of Jinan University from December 2011 to December 2012 as the study group.Select 20 cases of normal patients with utrine myoma or adenomyosis at the same time as the control group.All cases did not make any treatment before obtained the sample2 Use the diversion hybrid method to dectect HPV genotypes 3 Use fluorescence quantitative reverse transcription - polymerase chain reaction RT - qPCR to detect miR-155 expression in the cervical tissue and serum4 Use SPSS13.0 solfware to process the data Results1 The positive rate of HPV infection in the study group and control group are 70.27% and 5% respectively, P 0.05. HPV-16 infection rate is highest. There is only 1 case IV 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞 癌组织 及血清中的表达及意 义 of low-risk HPV in the study group, The others are high-risk type HPV infection. In control group,there is only one case of HPV infection. The positive rate of HPV infection in the study group and control group are 67.57% and 5% respectively, P 0.052 In cervical tissue,the relative expression of miR-155 in the study group is 0.52 0.27 -0.99, the relative expression of miR-155 in the control group control group is 0.15 0.07-0.21, P 0.05 3 The relative expression of miR-155 in cervical squamous carcinoma stage ?is 0.44 0.08 -1.95, in stage ? is 0.58 0.38 -0.97, is stage ? is 0.21 0.06 -0.56, P 0.05 4 The relative expression of miR-155 in high differentiated cervical squamous carcinoma tissue is 0.25 0.06- 0.44, in moderately differentiated cervical squamous carcinoma tissue is 0.61 0.11 -2.02, in low differentiated cervical squamous carcinoma tissue is 0.34 0.14- 0.87, P 0.05 5 The relative expression of miR - 155 expression in HR - HPV positive cervical squamous carcinoma tissue is 0.880.50-2.41, in HR - HPV negative cervical squamous carcinoma tissue is 0.090.07-0.31, P 0.056 In serum,the relative expression of miR - 155 expression in study group is 45.79 14.25 -150.67,in control group is 3.29 1.54 -16.62, P 0.05Conclusion 1 In the development cervical squamous carcinoma, there is a close relation between HR-HPV infection and over expression of miR - 155. HR-HPV infection may cause miR - 155 over-express ,and then lead to the development of cervical squanmous carcinoma 2 Over expression of miR - 155 is a feature of cervical squamous carcinoma.It is expected to be a marker for cervical cancer diagnosis and programming the treatment 3 Serum miR - 155 is expected to become specific tumor markers of cervical squamous carcinoma and has positive effect in cervical squamous carcinoma follow-up V 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞 癌组织 及血清中的表达及意 义 Key wordscervical squamous carcinoma ; miR?155; high risk- human papilloma virus (HR-HPV ); real-time fluorescent quantitative PCR VI 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞 癌组织 及血清中的表达及意 义 目录 中 文 摘 要. I Abstract.IV 第一部分 HR-HPV 感染与宫颈鳞癌 组织miR-155 表达1 1 前 言. 1 1.1 miRNA 与中心法则 1 1.2 miRNA 的产生及作用机 制 2 1.3 miR-155 与肿瘤4 1.4 人乳头瘤病毒 (HPV )与宫颈鳞 癌5 1.5 HPV 感染和miRNA 的表达与子宫颈鳞 癌 6 2 材 料 与 方 法8 2.1 研究对象. 8 2.2 实验材料. 8 2.3 技术路线图..12 2.4 实验方法.13 2.5 统计分析.17 3实 验 结 果19 3.1 HPV 感染..19 3.2 HPV 感染的型别..19 3.3 宫颈鳞癌组与 正常宫 颈组 中HR-HPV 感染的比较..22 3.4 实时荧光定 量PCR 法检测miR-155 的表达.23 4 讨论29 4.1 高危型人乳头 瘤病毒 感染与 子宫颈 鳞癌29 4.2 miRNA 与肿瘤.30 4.3 miR-155 与宫颈鳞癌.30 4.4 高危型人类乳 头瘤病 毒感染 与宫颈 癌中 miR-155 的表达.31 第二部分 宫颈 癌患者 血清miR-155 的表达及意义..33 1 前 言.33 1.1 血清肿瘤标志 物.33 VI I 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈 鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 1.2 血清中微小RNA..34 2 材 料 与 方 法..36 2.1 研究对象.36 2.2 实验材料.36 2.3 技术路线图..38 2.4 实验方法.39 2.5 统计分析:..40 3 实 验 结 果.42 3.1 实时荧光定 量PCR 溶解曲线.42 3.2 miR-155 在血清中的表 达43 4 讨 论.47 4.1 血清中miRNA 的表达与肿瘤.47 4.2 血清中miR-155 的表达与宫颈癌.48 4.3 miR-155 在临床应用与 展望.49 实验的不 足之处.50 结论..51 参 考 文 献.52 英文缩写 词表59 综 述61 攻读硕士 期间发 表论文.66 致谢..67 VI II 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈 鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 第 一 部分 HR-HPV 感染与宫颈鳞癌组织 miR-155 表达 1 前 言 子宫颈 鳞 癌(cervical cancer )是发 生于女 性生殖 道常见 恶性肿 瘤, 其中 发展中 国家 发病 率较高,每年新 发病例 约占全 世界 85% , 中国 约占 1/3 , 约有 20 万妇女 死 于 该病。 目前, 子宫颈 鳞癌的 发病率 呈现上 升趋势 ,而且 发病低 龄化 趋势日益 显著 [1] ,子宫颈 鳞 癌 目前 已 经逐 渐成 为一 种严 重威 胁 女性 健康 和生 命的 疾 病。 流行 病学 研究已经 证明, 人 乳头瘤 病毒 (human papillomavirus, HPV ) 的感 染为 子宫颈 鳞 癌发 [2] 生的 必要 条件 。其 中 与子 宫颈 鳞癌 发生 的 关 系 最为 密 切 的是 高危 型 人乳 头瘤 病毒 (high-risk human papillomavirus, HR-HPV ) 感染 ,99.7% 的子 宫 颈鳞 癌组织中 可检 [3] 测出 HPV , 而 且, 其 检出率 随 子 宫 颈病变程 度的加 重 而逐 渐增高 。HPV 病毒 主要 侵犯皮肤 及粘膜 鳞状上 皮细胞 , 在于 宿主细 胞内 , 以 DNA 整合 状 态 及染色体 外的 附加体形 式存 在, 并在其他 多种 因素的 作用下,子宫颈 鳞状上 皮细胞 发 生 异常增 殖 , 呈现 出宫 颈上皮 内瘤变cervical intraepithelial neoplasia, CIN , 并 逐渐 发展成为 宫颈 鳞癌。 1.1 miRNA 与 中心法则 中心法则 是由克 里克 在 1957 年提出, 它是 现代生 物学最 基本、 最 重要 的规律之 [4] 一。 它的 提出 是研 究生 命 科学 发展 的重 要里 程碑 。 中心 法则 认为 , 在各 种生 物大 分子中,DNA 存储 遗传信 息,蛋白 质执行 生物学 功能, 而 RNA 是把 位于细胞 核中 DNA 的遗 传 信息 传递到细 胞质并 用于蛋 白质的 合成 。 遗传 信息的 流向 是由 DNA 转 录形成 RNA , 然后再由 RNA 翻译成 为蛋白 质,最 后由蛋 白质执 行其 特定的生 物学 功能,核 酸分子 之间的 信息传 递是通 过碱基 配对而 实现的 ,核酸 到蛋 白质通过 一个 十分复杂 的翻译 机构来 实现信 息转移 。 研 究初 始 认为 ,DNA 是唯一 的 遗传物质 , 而 且认为遗 传信息 的传递 是单向 进行并 且是不 可逆的 ,即 DNA 是 遗传 信息的起 点, 而最后合 成 蛋白 质 则是 终点,RNA 只是 DNA 与蛋白 质之前 信息的 媒 介 。 1 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 1958 年 Temin 对致 癌 RNA 病毒?? 劳斯肉 瘤病毒 (RSV )的研 究发 现,放线 菌素 D 能 够抑制 细胞 中 RSV 的复 制,而 放线菌 素 D 是 特异性 的 DNA 抑制剂 ,可 见 RSV 复制 必然涉 及到 DNA , 因 此, 他 们提出― 前 病毒假 说‖ , 即 致癌 RNA 病毒 的 复制必须 经过一 个 DNA 中间体 ( 前病毒 ) ,DNA 中间 体整合 到宿主 细 胞基因组 中, 最后引起 细胞恶 性转化 。1970 年,Temin 发现 了催化 这一过 程的关 键 酶,即 RNA [5] 依赖 DNA 聚合 酶??逆 转录酶, 因此― 前病 毒假说‖ 得到证 实 。 该现象被称为 逆转 录现象, 即病毒 RNA 为 模板反 向转录 成为 cDNA , 后以 cDNA 为模 板合成新 的病 毒 RNA 。 逆转 录的发现 , 证 明除 DNA 外, RNA 也具有 遗传信 息存储 及 表达的功 能, 并进一步 充实和 完善了― 中 心法则‖ 。 在 人 类 基 因 组 研 究 发 现 编 码 蛋 白 质 仅 占 基 因 组 的 1% , 非 编 码 基 因 序 列 则 占 99% 。 编码 蛋白质 的 DNA 首先转 录成 RNA 然 后翻译 蛋白质 执行生 物 学功能 , 而由 大量非编 码基因 转录的 生物大 分子, 被称为 非编码 核糖核 酸分子non-codingRNA , ncRNA , 非编码 RNA 具有 一个共 同特点 都是 不 翻译成 蛋白 质 ,能以 RNA 的 形式 实现各项 生物学 功能。 非编 码 RNA 根据 长度可 以把非 编码 RNA 划 分可以分 为 3 类: 小 于 50 nt , 包 括 miRNA ,siRNA ,piRNA ;50 nt 到 500 nt , 包 括 rRNA ,tRNA , snRNA , snoRNA , SRPRNA 等等; 大于 500 nt , 包括 长的 mRNA-like 的 非编码 RNA , 长的不 带 polyA 尾巴 的非编 码 RNA 等等 。 细胞 中含量 最高两 种非编 码 RNA : rRNA 和 tRNA , 其 功能已 明确, 但相当 大 一部 分非编 码 RNA 的功 能更仍 在 探索当中 。 经 过大量研 究 发现 , 非编码 小分 子 RNA 中的 miRNA 是细胞 内调节 基因 表达的关 键性 分子, 其 作 用机制 是与 miRNA 互补 的 mRNA 沉 默或者 降解, 从 而起 到转录后 抑制 [6] 的作用 。 科学 家认 为 miRNA 在生物 发育的 过程中 , 有 着不亚 于蛋白 质 的重要作 用。 因此 miRNA 成 为近来 的研究热 点 , 了解 miRNA 的生物 功能, 可 以揭 示 miRNA 在 遗传信息 传递中 的调控 作用, 从而进 一步完 善中心 法则。 1.2 miRNA 的 产生及作用机制 微小 RNA (miRNA ) 是 一种广 泛存在 于真核 生物中 的内源 非编 码 RNA 。 成熟 miRNA 由 19-25 个 核 苷 酸 组 成 。 miRNA 的 生 成 需 要 经 过 从 初 始 miRNA (primary-miRNA ,pri-miRNA ) , 到前 体 miRNA (precursor-miRNA ,pre- miRNA ) [7] 和成熟 miRNA (mature-miRNA ) 等过程 。 首先 以 DNA 为模板 在 RNA 聚合酶 ? 作用下 转录为 具有 帽子 结构7MGpppG 和多 聚腺 苷酸尾 巴AAAAA 的 初级 miRNA 2 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 (pri- miRNA ) ,在 细胞核 内 pri-miRNA 经 过一种 被称 为 Drosha 的核 酸内切酶 其辅 助因子 Pasha 的 作用 下, 形 成长度 为 70-100nt , 具有发 夹状茎- 环结构 的 pre-miRNA 。 在 Ran-GTP 依 赖的转 运蛋白-5 (exportin-5 )的作 用下,pre- miRNA 由细胞核 转运 至细胞质 中。 经 过另一 种核酸 内切 酶 Dicer 酶 的切割 下,pre-miRNA 形成 miRNA 双 链复合体, 在经过 解旋酶的 作用下, 最终解 链形成 单链结 构的成 熟 miRNA 。miRNA 相关蛋白 形成 RNA 诱 导沉默 复合体 (RNA-induced silencing complex,RISC ) 并 按碱 [8] [8] 基互补原 则与目 标 mRNA 结合 从而起 到转录 后抑制 作用 。 如 (图 1 ) 当 miRNA 的和靶 miRNA 完全 或 几乎 完全 配对 时 ,miRNA 对靶 基因 进 行切 割 致其 降解 ;当 miRNA 的 5 ′端 2-8 个 核苷酸 的序列 和靶 miRNA 的 3 ′端非 编码 序列 不完 全配 对时,不 对其起 降解作 用,而 是从 转 录后水 平实现 抑制作 用 。 每个 miRNA 可以有 多个靶基 因,不 同 miRNAs 也可 以调节 同一个 靶基因 。因此 可以通 过 一个 miRNA 来调控多 个靶基 因,也 可以通 过几 个 miRNAs 的组合 来精细 调控某 个 基因的表 达。 miRNAs 在 物种进化 中相当 保守, 其 表达具 有组织 特异性 和时序 性, 决定组织 和细 胞的功能 特异性。miRNA 参 与了机 体多种 病理生 理过程, 包括细 胞生 长, 分化, 细 [9] 胞凋亡甚 至肿瘤 的形成 及发展 。图 1miRNA 的生 成及作用 机制 3 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 1.3 miR-155 与肿瘤 至今为止 ,越来 越多研 究证明 miR -155 是一种功能 型 miRNA , 它参 与血细胞 的 生成、 炎症性 反应 的 发生以 及 免疫 效 应等 多种重要 的生 物学过 程 , 其中使 肿 瘤学 家 们 最感 兴趣的 是 miR-155 异常 表达与 多种肿瘤 发生 相关 , 因此 ,miR -155 被认 为 是一种致 癌 的 miRNA 。 [10] miR-155 在较 多的实 体肿瘤 中都能 发现其 表达异 常,例 如, 在 结 肠癌 、乳腺 [11-12] [13-14] [15] 癌 、 胰腺癌 、 肺癌 等肿瘤 组织中, 发现 miR-155 的表达 升高 。 除此以外 , [16] miR-155 在宫 颈 鳞 癌 中同样 发现有 表达上 调 存在 ,Wang X 等人利 用 northern blot 测定年龄 匹配的 正常宫 颈 组织 与宫颈 癌组织 中的 miRNA 表达 发现 ,miR -126 以及 miR-424 的表 达显著 下调, 而 miR-15b, miR-16, miR-146a, miR-155, 及 miR-223 的 表达显著 上 调。 目前已经 有许多 研究证 实 miR-155 与肿 瘤 的发 生相关 。 但 是, 细 胞是 通过何种 机制导致 miR-155 异常表达;miR-155 作用于哪一 种靶基 因 、 起 哪种 生物学作 用, 至今仍不 十分清 楚。 以 下几个 研究 对 miRNA -155 如何参 与肿瘤 的发 生 作了解释。 在 BRAF, RAS 和 RET/PTC 基因 突变阳 性的乳头 状甲状 腺癌中 ,发 现 miR -155 高 [17] [18] 水平表达 , 提 示 miR-155 与这些基因突变 有密切 关系 。Ovcharenko 等在 T 淋巴 细胞 Jurkat 细胞 株和乳 腺癌 MDA-MB-453 细胞 株中发 现, miR-155 是 一种最有 效的 [19] 抑制凋亡 的基因 , 它 可能通 过阻竭 caspase-3 的 活性而 起到抗凋 亡的作 用。 Gironella 等对凋亡 相关基 因 TP53INP1 作用机 制进行 研究, 通过对 TP53INP1 蛋白阳性 的和 阴性的胰 腺癌组 织行 PCR 检测 , 发 现两种 组织 中 TP53INP1 mRNA 表 达 无明显差 异, 它们推测 其过程 可能 有 miRNA 抑制 该 mRNA 表达 。 通过 生物信 息学 搜索发现 , 在 胰腺癌组 织中高 表达的 miR-155 可能是其 作用基 因。 为了明 确 miR-155 在 TP53INP1 的作用, 他们 在 MCF-7 细 胞株中 转染 miR-155 ,检测 得 TP53INP1 蛋 白表达下 降。 该研究结 果证 明 TP53INP1 是 miR-155 的目标基 因。 其 次, 肿 瘤 所 生 存的 微 环 境 对 影响 肿 瘤 的 生 长取 着 十 分 重要 的 作 用 ,miR-155 可以通过 改变癌 周组织 从而促 进肿瘤 生长。 其中, 有研究 发现 卵 巢癌 周 成纤维 细胞 [20] miR-155 高表 达有助 于卵巢癌 的发展 ;其次 ,miR-155 通过控 制下 游 的靶基 因从 而参与肿 瘤发生 ,VHL 是一 肿瘤抑 制因子 并且 是 miR-155 的靶 基因,miR-155 抑制 [21] VHL 表达 而间接 参与促 进肿瘤 新生血 管形成 , 继而为 肿瘤的 生长 提供营养 。 4 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 以上研究 表明 ,miR-155 在 肿瘤形成 过程中 发挥着 较为重 要作用 ,对 其研究可 以进一步 补充当 今肿瘤 发生理 论。 1.4 人乳头瘤病毒(HPV )与宫颈鳞癌 人乳 头瘤病 毒 (HPV ) 是一 类 双链闭 合环状 DNA 病毒, 主要 感染 人体皮肤 和粘 膜 。 按功 能 ,基 因组可分 为 3 个编 码区: 早期蛋 白编码 区early region ,ER , 晚期 蛋白编码 区late region ,LR ,上 游调节 区upstream,regulatory region ,URR 或称 长 控制区long control region ,LCR 。ER 分 别编 码 E1 、E2 、E4 、E5 、E6 和 E7 蛋 白。 E2 蛋白是 一种可 以调节 病毒 DNA 复制 和病毒 mRNA 的 转录, 并且 具有负性 调节 [22] [23] E6 和 E7 的作用 。E6 、E7 蛋白是 病毒癌 基因表 达的相 关蛋白 , 研 究 表明 ,HPV 感染机体 后, 病 毒基因 组 常常 整合 于 E1 ,E2 位点, 并使 E1 ,E2 基因 缺失, 其 中以 E2 缺失为 甚。 随后 E6 和 E7 蛋白 表达抑 制解除 , 使 E6 ,E7mRNA 呈 现 高表达状 态。 [24] E6 蛋白 与 E6-AP 结合 形成复 合体, 与 p53 蛋 白结合 并抑制 其功能 。p53 蛋白是 一 [25] 种重要的 抑癌蛋 白,其功 能缺失 使 G1/S 节 点调节失 控,细 胞无限 增殖 。另外 E7 蛋白与 控制 细胞 周期 有关 的肿 瘤抑 制蛋 白视 网膜 母细 胞瘤 蛋白 Rb 蛋白 结 合, 使 [26] Rb-E2F 复 合物解 离, E2F 被游离 ,导致 细胞周 期失控 而发生 细胞永 生化 。其次 高危型 HPV 感染宫 颈上皮 后,宫 颈组织 中 IFN-γ 表 达下调 ,IL-10 表 达上调认 为, 提示宫颈 病变局 部组织 抗病毒 , 抗 肿瘤免 疫功能 逐渐降 低 , 认 为 HR-HPV 持续 感染 可能导致 宫颈局 部免疫 功能下 降, 可导 致宫颈 局部免 疫功能 下 降,HPV 病毒逃 脱免 [27] 疫系统监 视,有 助于其 致癌作 用 。流行 病学研 究表明 ,处于 性活跃 期的群 体,其 中大 约 50 ~80% 可 能感染 HPV 。 但 HPV 感 染后 80% 常 被身体 免疫机 能清除 ,呈现 一种隐 性感染 ,而 且并非所 有高 危型 HPV 感 染患者 都会进 展成为 宫颈上 皮瘤变 或浸润 癌, 仅有部 分持 续感染者 发展 成为宫颈 鳞癌, 表 明单纯 的 HPV 感 染并不 是宫颈 鳞癌发 生发展 的唯一 因素, 可能 还 有其它许 多诱因 参与了 宫颈鳞 癌的发 生。 因此 ,HPV 感染 导致宫 颈鳞 癌的发生 是一 个多因素 、 多 步骤 、 多 环节的 复杂过 程, 虽然高 危型 HPV 持续感 染与 宫颈鳞癌 的关 系已经得 到了确 认, 但是 HPV 感染后 导致宫 颈鳞癌 发生的 具体分 子机 制仍未完 全明 确,仍须 进一步 探索。 HPV 在 宫颈 上皮 存 在的 方式 主要 有三 种 :游 离状 态, 整 合状 态, 整合/ 游 离状 5 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 态, 其存在 方式受 疾病严 重程度 影响。 有 研究认 为 整合 状态 的 HPV 被 认为与宫 颈鳞 [28] 癌的发生 与发展 相关 , 通过 PCR 检 测, 尽管在 正常人 和低级 别的宫 颈 上皮瘤变 中, 都可以发 现整合 状态 的 HPV , 但是其 表达量 远远低 于高级 别宫颈 上皮 瘤变和浸 润性 宫颈鳞癌 。HPV 整合 到宿主 细胞, 对于 HPV 本身, 整合位 点 E2 受破 坏, 其阻 竭致 癌 E6 、E7 蛋 白的功 能也受 影响。 另一 方面, 为 HPV 整合 行为同 时影 响宿主细 胞基 因的表达 。到目 前为止 ,该行 为可用 插入诱 变这一 理论解 释,即 外来 基因序列 的引 [28] [29] 入, 导致 宿主细 胞基因 突变发 生 。Peter 等对 HPV16 型/18 型 感染 的宫颈细 胞进 行研究, 其中 有 5 种细 胞,HPV 基因 序列整 合于染 色体 8q24 附近, 即 癌基因 MYC 所处的位 点。同 时,他 们也发 现相应 细胞中 MYC 基因转 录和蛋 白质 表达有不 同程 度升高, 而在 HPV 整合在 其它位 点的细 胞中, 却没有 发现这 一现象 。 该研究表 明, HPV 整 合这一 行为会 影响宿 主细胞 基因表 达,甚 至是导 致癌的 形 成。 1.5 HPV 感 染和 miRNA 的表达 与子宫颈 鳞 癌 高危型人 类乳头 瘤 病毒 持续感 染 目前 是宫颈 癌 比较 明确 病 因。 对于 HPV 感染如 何导致宫 颈癌 , 目前 最公认 的机制 是 HPV 表 达的癌 蛋白 E6/E7 通 过作 用于 细胞 周期 相关蛋 白 p53 及 pRb , 使细 胞周期 失调控 , 从而 导致癌 的形成 。HPV 感染可能 通过 调节 miRNA 的 表达 , 导致宫颈 癌变 。 [30] Dreher 等 人分别 对低危 型 HPV-11 和 高危 型 HPV-16 、HPV-45 感染 HaCaT 细 胞株进 行 miRNA 表达 谱分析, 发现 13 种 miRNA 在三 种 HPV 感 染细 胞株中同 时表 达异常, 其中 miR-125a-5p, miR-129-3p, miR-363, 和 miR-145 与肿瘤 相关。值 得注 [31] 意的是, 对于高 危型 HPV 感 染的细 胞株中 ,miR-145 表达上调 。Martine 等 对通 过微阵列 分析和 实时荧 光定量 PCR 等方 法, 在 SiHa 细胞 株 (HPV-16 阳性) 和 Ca-33A 细胞株 (HPV 阴性 ) 中发 现,miR-218 表达下调 , 接 着, 对 HPV-16 型 阳性的 CIN 、 宫颈癌患者和正常患者的宫颈组织进行研究,能发现相同的结果。通过抑制 HPV 阳性细胞 株中 E6/E7 的 表达,miR-218 表达上调 。该研 究表 明 miR-218 表达异常 与 HPV 感 染相关 。 这 两篇研究 通过分 析不 同 HPV 感染 状态的 宫颈癌 细胞 株 miRNA 的 表达谱 , 提 示 HPV 感染 可以导 致 miRNA 的 表达异 常, 但是 HPV 导致 miRNA 表达 紊乱具体 机制 , 至今 仍在探 索当中 , 以下 几个研 究解释 了 HPV 影响 miRNA 表达 的 可能机制 。 6 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 [32] HPV 感染 可以 直接影响 miRNA 的表 达。Calin 等 认为, 对 于大部 分 miRNA , 其编码基 因位于 脆性位 点附近 ,脆性 位点往 往是 HPV 整 合到细 胞基 因组的理 想位 置,HPV 基因 整合到 脆性位 点后, 可能影 响到其 附近 miRNA 的 表达 。 HPV 表 达的致 癌蛋 白 E6 、E7 直 接或间 接导 致 miRNA 表达紊 乱。 抑癌 蛋白 P53 可以结合 到 miR-34a 的 启动子 区域的 特异性 结合位 点,促 进 miR-34a 基因的表 达, 而 miR-34a 能影 响多种 细胞周 期调控 分子,如 cyclinE1 、cyclinD 、E2F1 、E2F3 等, [33] 因此 HPV 可 以通 过 E6 使 miR-34a 表达 下调, 从 而导致 细胞恶 性转化 。E2F 是基 因转录重 要的调 控因子 ,E7 蛋 白可以 降解 pRB-E2F 复合 体中的 抑癌蛋 白 pRB,被释 放出来 的 E2F 能与 很多 miRNA 基 因, 如 miR-17-92 、 Let-7a-d 、 Let-7i , miR-15b/16-2 、 [34] miR-106b-25 ,结 合,促 进这 些 miRNA 基因的 转录 。 从 以 上 研 究 可 以 看 出 , 关 于 宫颈癌 miRNA 表达 的 研 究 有 很 好 的 前 景 , 随着 miRNA 研 究的深 入, 可 以进一 步 完善当 今宫颈 癌发生 理论。 7 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞癌组织 及血清中的表达及意 义 2 材 料 与 方 法 2.1 研究对象 2.1.1 资料来源 选取 2011 年 12 月 ~2012 年 12 月在暨南大学附属 第一医 院妇科 因宫 颈鳞癌入 院治疗的 患者 共 37 例作为 研究组 , 另 选择同 期因子 宫肌瘤 及子宫 腺肌 病行全子 宫切 除的患 者 20 例作为 对照组。 全部研 究对象 在标本 获取前 均未进 行放疗 、 化疗以及 其 它治疗, 临床及 病理资 料完整 , 均无 内分泌 、免疫 及 代谢 性疾病 ,术 前 6 个月 内未 使用过甾 体类激 素 及免 疫药物 治疗, 无高血 压、糖 尿病、 肾病等 慢性 内科病史 。 2.1.2 研究分组 一, 研究 组 (宫颈 鳞癌组 ) : 根据病 理检查 确诊为宫 颈鳞癌 的 患者 37 例 , 依据 2009 年国际妇产科联 盟 (FIGO ) , 宫颈 癌的临 床分期 标准 , ? 期 12 例、 ? 期 11 例、 ? 期 14 例。 根 据病理 分级, 高 分化 3 例、 中分 化 15 例、 低 分化 19 例, 所有标本 均 为 宫颈原 发病变 。年龄 39 ~61 岁,平均 年龄 50.3 ?7.4 岁。 二, 对 照组 ( 正常宫 颈 组 织): 子宫 良性病 变 ( 子宫肌 瘤、 子 宫腺肌 病 ) 行全 子 宫切除者 ,术后 经病理 证实为 正常的 宫颈组 织的患 者 20 例。 年龄 43 ~50 岁,平均 年龄 45.4 ?3.6 岁。 2.2 实验材料 2.2.1 主要试剂及材 料 8 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞 癌组织 及血清中的表达及意 义 DNA 提取 试剂盒 中国凯 普生物 科技有 限公 司 试剂盒组 成 规格 组份 溶液 ? 12ml Tris 、Nacl 、Na2EDTA 、NaOH 、SDS 、 H O 2 12ml 溶液 ? 异丙醇 溶液 ? 1.8ml 灭菌注射 用水 HPV 核 酸扩增 分型检 测试剂 盒 中 国凯普 生物科 技有限 公司 PCR 试剂盒 组成(30 人 份用量) 规格 组份 PCR Mix 745μl dNTPs,MgCL Tris-HCl 2 24μl DNA Taq (5U/μl ) Taq DNA 聚合酶 阳性对照 10μl HPV18 型对 照 DNA 100μl H O 阴性对照 2 杂交 试剂盒 中 国凯普 生物化 学 有限公司杂交试剂 盒组成 (30 人 份用 量) 规格 组份 120ml NaCl,SDS 杂交液 封阻液 32ml Tris-HCl, 干酪素 16ml 酶标液 Tris ,Streptavidin-AP conjugate 溶液 A 100ml Tris, 叠 氮钠 100ml NaCl,SDS 溶液 B 杂交膜 30 人/ 份 Biodyne C 膜, 氨基化 探针 NBT/BCIP 16ml NBT/BCIP 9 暨南大学 硕士学位论 文 HR-HPV 感染与 微小 RNA-155 在子 宫颈鳞 癌组织 及血清中的表达及意 义 miR-155/U6 荧光 定量试 剂盒 中国 上海吉 玛制药 技术有 限公 司 试剂盒组 成(20μl×100rxns ) 规格 Real-time PCR Master Mix 2× 1ml×2 支 miRNA Hairpin-primer set10μM 100μl×1 支 miRNA RT primer 10μM 15μl×1 支 Taq DNA polymerase5U/μl 50μl×1 支 1×RNA Dilution buffer 1ml×2 支 Ezol 中国上海 吉玛制 药技术 有限公 司 miR-155 逆转 录试剂 盒 中国上海 吉玛制 药技术 有限公 司 逆转录试 剂盒 中国天根 生化科 技有限 公司 异丙醇 中国广州 达晖生 物技术 有限公 司 无水乙醇 中国广州 达晖生 物技术 有限公 司 氯仿 中国广州 达晖生 物技术 有限公 司 DEPC 水 广州欣晶 科技有 限公司 1.5mlEP 管 美国 Axygen 公司 1ml 移液枪头 美国 Axygen 公司 200ul 移液枪头 美国 Axygen 公司 10ul 移液枪头 美国 Axygen 公司 0.2ml 透明 PCR 八联管 美国 Axygen 公司