胡萝卜素的提取

胡萝卜素的提取 β-胡萝卜素和番茄红素的提取、分离与测定 ,摘要,β—胡萝卜素是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素。番茄红素(Lycopene)是类胡萝卜素的一种，对防治癌症、提高免疫力、延缓衰老有特效，有植物黄金之称，被誉为“21世纪保健品的新宠”。因此，提取、分离、鉴定这些活性成分成为研究和开发这些天然生物资源的重要环节。本实验用常规天然有机化合物的提取方法获得β-胡萝卜素和番茄红素样品，再用柱色谱法将其分离，用薄层色谱检测分离效果，最后用分光光度法分别对其鉴定。 ,关键词,β-胡萝卜素、番茄红素、提取、分离、测定 实验基本原理 β-胡萝卜素和番茄红素分子中的碳骨架是由8个异戊二烯单位连接而成的，它们是四萜类化合物。它们的分子中都有一个较长的π-π共轭体系，能吸收不同波长的可见光，因而，它们都呈现一定的绿色，β-胡萝卜素是黄色物质，番茄红素是红色物质，所以，又把它们叫做多烯色素。β-胡萝卜素和番茄红素的结构式分别如下: (番茄红素) (β-胡萝卜素) 胡萝卜素是最早发现的一种多烯色素。后来，又发现了许多在结构上与胡萝卜素类似的色素，于是就把这类物质叫做胡萝卜素类化合物，或者叫做类胡萝卜素。这类化合物大都难溶于水，易溶于弱极性或非极性的有机溶剂，因此又把这类化合物叫做脂溶性色素。 胡萝卜素广泛存在于植物的叶、花、果实中，尤以胡萝卜中含量最高。胡萝卜素有α、β、γ三种异构体，在生物体中以β-异构体含量最多，生理活性最强。在动物体中，胡萝卜素在酶的作用下可转化为维生素A，因此，胡萝卜素又被叫做维生素A原。胡萝卜素在人和高等动物体内就有重要的生理功能，是人和高等动物生存不可缺少的营养物质。 番茄红素是胡萝卜素的开链异构体。番茄红素在成熟的红色植物果实如番茄、西瓜、胡萝卜、草莓、柑橘等中含量丰富，其中含量最高的是番茄。由于番茄红素不具有维生素A原活性，因此长期以来不被人们所重视。但近年来研究表明，番茄红素是一种优越的天然色素和生物抗氧化剂，具有极强的清除自由基的能力，它可以预防前列腺癌、乳腺癌和消化道(结肠、直肠与胃)癌的发生，在预防心血管疾病、动脉硬化等各种与衰老有关的疾病及增强机体免疫力方面具有重要作用。正因如此，近年来国内外对番茄红素的研究方兴未艾，不仅有大量的研究文章公开发表，而且还有一些相关产品面市。番茄红素作为新型保健食品、食品添加剂、化妆品和药品具有广阔的市场前景。 β-胡萝卜素和番茄红素的分子式均为C40H56，分子量为536.85，β-胡萝卜素的熔点是184?，番茄红素的熔点是174?。β-胡萝卜素和番茄红素是不饱和碳氢化合物，难溶于甲醇、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、正己烷、丙酮，易溶于氯仿、二硫化碳、苯等有机溶剂。 根据β-胡萝卜素和番茄红素的上述性质，可利用石油醚、乙酸乙酯等弱极性溶剂将它们从植物材料中浸提出来。然后，根据它们对吸附剂吸附能力的差异，用柱色谱进行分离，用薄层色谱检测分离效果。并根据它们在可见光区有强烈吸收的性质，用紫外—可见分光光度法进行测定，β-胡萝卜素的最大吸收峰为451nm ，番茄红素的最大吸收峰为472nm 。 实验仪器与试剂 仪器:三角瓶(50ml)、分液漏斗(150ml)、蒸馏瓶(50ml)、普通蒸馏装置(或减压蒸馏装置)、色谱柱、硅胶薄层板、量筒、烧杯、试管、721分光光度计、层析缸。 试剂:番茄(或番茄酱)或胡萝卜、食盐、丙酮、乙酸乙酯、石油醚(60~90?)、乙醇、污水硫酸镁、氧化铝(层析用，100~200目)、硅胶(层析用，200~300目)、无水硫酸钠、石油醚(60~90?):乙醇(2:1，V/V)、石油醚:丙酮(3:2，V/V)。 实验内容与步骤 1、类胡萝卜素的提取: (1)称取10g 新鲜番茄果肉，捣碎，置于50ml 三角瓶中，再加2.5g 食盐，用玻璃棒搅拌，使食盐与番茄果肉充分混合均匀，静置一定时间，便会看到果肉组织中有大量水分渗出。脱水时间持续20~30min 。随后将脱除下来的水分滤入150ml 分液漏斗中。 (2)向经过食盐脱水的番茄果肉中加入5ml 丙酮，用玻璃棒搅拌，并静置5~10min 。然后将丙酮提取液也滤入分液漏斗中。 (3)向经过丙酮处理的番茄果肉中加入5ml 乙酸乙酯浸提5min 。浸提过程中应不时振摇三角瓶，使番茄果肉与溶剂充分接触;若室温过低，可将三角瓶置于温水浴中加热，但应注意不能使浸提溶剂明显挥发损失。5min 后将提取液也滤入漏斗中，并用玻璃棒轻压残渣尽量使溶剂流尽。再用乙酸乙酯重复浸提2次，每次5ml ，合并提取液至分液漏斗中。 (4)充分振摇分液漏斗中的混合溶液，静置，完全分层后，弃去水层，有机层(脂层)再用蒸馏水洗2次，每次8~10ml ，弃去水层。脂层自分液漏斗上口倒入干燥的小三角瓶中，加入适量的无水硫酸镁(或无水硫酸钠)遮光干燥15min 。 (5)干燥后的脂层滤入50ml 干燥的蒸馏瓶中，水浴加热，小心蒸馏(最好减压蒸馏)，浓缩至1~2ml 。所得浓缩夜即为Β-胡萝卜素样品。 2、 类胡萝卜素的柱色谱分离: 选一支1.5*20cm 的色谱柱，用适量层析用氧化铝(100~200目)作吸附剂干法装柱，高度约10cm ，要求紧密匀实。分离方式为梯度洗脱，第一步用石油醚(60~90?)洗脱。先沿色谱柱管壁滴加5~8ml 石油醚至柱体(各方向要均匀)，待溶剂表面降至氧化铝柱面顶端时，用滴管迅速地小心滴加5~10滴样品至柱子中，待样品液面即将在柱面上消失时，沿管壁小心滴加石油醚3~5滴，冲洗粘在管壁上的有色物质。如此重复3~4次，直至管壁冲洗干净为止。随后，在管内加入尽可能多的石油醚进行洗脱，第一步收集到的洗脱液为黄色。待洗脱液清亮无色后用石油醚:丙酮(3:2，V/V)的混合液洗脱，第二步收集到的洗脱液为红色。最后用丙酮将前两步不能洗脱的剩余组分洗脱下来。分别收集第三步洗脱液，用薄层色谱检测及分光光度法测定。 3、 类胡萝卜素的薄层色谱检测: 对前面得到的类胡萝卜素样品以及柱色谱分离得到的样品分别进行薄层分析，以检查柱色谱分离效果。薄层层析板预先用硅胶G制备并活化(110?，1小时)，展开剂为石油醚:丙酮(3:2，V/V)。薄层分离后观察斑点位置，计算各斑点的 Rf值，并明确各斑点归属。 在本实验条件下，薄层检测结果为:β-胡萝卜素，黄色，Rf值为0.89;番茄红素，深红色，Rf值为0.84。 4 、类胡萝卜素的分光光度法测定 取柱色谱分离后得到的样品，用丙酮适当稀释至仪器测量范围，然后用721分光光度计分别在420~520范围测定它们的光密度E，并做出E-λ曲线(每隔10nm 测定一次光密度)。指出各自最大吸收峰λmax ，并与标准吸收对照鉴定。 注释: 1 、新鲜番茄果肉组织中含有大量水分，类胡萝卜素处在含水量很高的细胞环境中，有机溶剂不易渗透进去，因此，为了提高提取效率，减少提取溶剂用量，应首先用食盐对番茄果肉进行脱水处理。经食盐一次脱水处理后，番茄果肉里仍然有一定量水分，致使所用提取溶剂还是无法进入细胞内很好地将类胡萝卜素溶出，故选用弱极性溶剂丙酮对之进一步脱水，同时也会溶出部分类胡萝卜素。为了最大限度地减少类胡萝卜素的损失，故应将前两步脱除下来的水分及这一步的丙酮浸提液都滤入分液漏斗中合并处理。经丙酮处理后的番茄果肉便可直接加有机溶剂浸提。 如果用番茄酱或胡萝卜作原料提取;类胡萝卜素，食盐脱水及丙酮进一步脱水处理这些步骤便可省去。 2、 浓缩提取液时应当用水浴加热蒸馏瓶;最好用减压蒸馏，而且不可蒸得太快、太干，以免类胡萝卜素受热分解破坏。 3、 如用乙酸乙酯提取类胡萝卜素提取液浓缩至1~2ml 后，应停止蒸馏，拆卸仪器，将蒸馏瓶敞口，让剩余的乙酸乙酯挥发至干，然后再加适量石油醚溶解，所得溶液即为类胡萝卜素样品，用于下一步实验。切不可将经过浓缩的乙酸乙酯提取液直接用于柱色谱分离。 参考文献 1、 孙晓萍,赵文恩,时国庆等.渗透法分离提取新鲜组织中番茄红素的研究.山东农业大学学报(自然科学版),2004.35(4):501~505 2、 尚德军,王军.番茄红素研究现状与展望.检验检疫科学.2004.14(2):59~61 3、 王燕燕,邸进申,郑辉杰.番茄红素分离与分析的研究进展.中国食品添加剂.2002.(4):16~20 4、 邸进申,郑辉杰,王燕燕等.番茄红素的层析分离.精细加工.2003.20(4):215~217