细胞免疫组化步骤

细胞免疫组化步骤 (2010-06-19 21:40:50) 细胞免疫组化(SABC法)步步看: 细胞冻存够了，且状态良好～咋们就开始做细胞免疫组化吧～开始做实验了，先看要准备些什么吧～ 实验准备: 实验用品: 移液枪:1ml、200ul、10ul 枪头:1ml、200ul、10ul 枪头盒:1ml、200ul、10ul EP管:1.5ml 湿盒 需要灭菌的东西:培养皿(可以是重复用的)、细胞爬片(多聚赖氨酸处理，并经过环氧乙烷消毒)、常规细胞培养物品。 试剂: 细胞消化液、完全培养基、4%多聚赖氨酸、0.01M PBS(ph7.2-7.4)、3%H2O2(现配)、0.5%Txiton X-100、浓缩型SABC试剂盒(血清封闭液、二抗、三抗《SABC》)、苏木素、ddH2O、DAB显色试剂盒 操作步骤: 一、细胞爬片的制作 1、细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬(4-5ml)或者密度为1-5x106/ml 2、在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片(圆片)，圆片间不要重叠 3、取细胞悬液分别滴到圆片上，注意不要滴到圆片外，让细胞贴片30min左右 4、30min后，在培养皿中补加完全培养液(轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来)，放于 37?C，5%CO2培养箱中培养3h左右(让其贴壁更牢)。 二、组化前处理 1、取出培养皿，用PBS漂洗2x2min(PBS可以不灭菌) 2、4%多聚甲醛处理(室温)20min; 3、PBS漂洗，3x2min; 4、0.5%Txiton X-100 处理(室温)20min; 5、PBS漂洗，3x2min; 6、3%H2O2处理(室温)15min; 7、PBS漂洗，3x2min; 三、组化 1、血清封闭:试剂盒中的血清封闭液，37?C，20min; 2、取出甩干封闭液(不漂洗);一抗(1:200)(PBS稀释)，阴性对照用PBS代替一抗，37?C1-2h或4?C过夜; 3、PBS漂洗，3x2min; 4、二抗孵育:试剂盒中的生物素化...37?C，20min; 5、PBS漂洗，3x2min; 6、SABC孵育:湿盒内37?C，20min; 7、PBS漂洗，3x4min; 8、DAB显色:DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂，我是按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。在镜下观察显色情况，在没有背景色的条件下可继续显色。一般在2-10min 9、自来水冲洗; 10、苏木素复染，15-30s; 11、自来水冲洗; 12、封片剂封片(有细胞一面对着载玻片)，镜下观察 若要长期保存片子，可以对爬片进行脱水处理: 70%(1次，1min)-80%(1次，1min)-95%(1次，1min)-无水乙醇(2x3min)-二甲苯(2x1min)，观察是否彻底脱水，看观察片子放入二甲苯时，容器周围有白色雾状产生，若有则说明脱水不彻底。可重新进行～ 得到结果:实验组中，细胞浆为棕黄色，细胞和为蓝紫色;阴性细胞中，只有核被染为蓝色，胞浆无色～在此抱歉不能将图片上传，还得用来发文章之用～ 在爬片时，圆片不好用镊子夹起，可在圆片之下垫上封口膜，这样操作起来即省事省时，又节约试剂 的用量和提高试剂的有效性。