乙醇脱氢酶（ADH）活性的测定

乙醇脱氢酶（ADH）活性的测定 乙醇脱氢酶(ADH)活性的测定 (一)实验材料 各处理的花生根系(取根尖清洗后吸干水分，称取2.0g) (二)试剂及其配制 1. 50mmol/L pH=7.5 PBS:(如上配制1000ml) 取A液 336.7ml与B 液663.3ml混合，即PH7.5。 2. 5 mmol /L MgCI6HO:取0.50805g用PBS定容至500ml; 2 2 3. 1mol/L HCl :取相对密度1.19(质量分数37.2)84ml定至100ml。 以下现配现用: 4. 1 mmol /L苯甲基磺酰氟(PMSF):取0.0870g定容至500ml;(难溶，需加热) 5. 1 mol /L pH=8三羟甲基氨基甲烷(Tris):取6.057g定至50ml，再取25ml，再 加入1 mol /L HCl 13.4ml定至100mL。(注:若为黄色溶液则丢弃)Tris溶液 可从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严; 难溶 +6. 0.01 mol /L 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD):取0.068144g定容至10ml; 7. 酶提取缓冲液:50 mmol/L pH=7.5磷酸缓冲液，5mmol/L MgCI，1 mmol /L苯2 甲基磺酞氟(PMSF); +8. 酶活性反应液:15ml pH=8.0的Tris 1.0mol/L，3ml的0.0lmol/L辅酶I(NAD)， 82ml蒸馏水。 (三)仪器设备 紫外分光光度计;天平;高速冰冻离心机;移液枪;研钵 实验步骤 (一)粗酶液的提取 1. 称取2.0g经处理的根系，放入预冷的研钵中; 2. 加5ml预冷的酶提取缓冲液(可分多次加入)，冰浴中匀浆; 3. 将提取液和残渣放入离心管中，4?以下15000r/min离心20min，上清液用于酶 活性测定 (二)活性的测定 1. 用移液枪吸取100μl上清酶液于试管中; 2. 加入2.85ml酶活性反应液混合; 3. 加入30μl 95%乙醇启动反应; 4. 用紫外分光光度计于340nm处测定吸光度变化。 5. 以每分钟OD增加0.001为一个酶活性单位(U)。酶活性用U/mg?FW表示。 340