维生素K2 对K562细胞生长抑制作用的实验研究

维生素K2 对K562细胞生长抑制作用的实验研究 范文 题目:维生素K2 对K562细胞生长抑制作用 的实验研究 编辑:司马小 作者:邵泽叶 ～陈宝安 ～夏国华～丁家华～朱怀刚 【摘要,目的: 研究维生素K2 ,VK 2 ,对慢性粒细胞白血病急性变细胞株K562细胞的生长抑制作用及其机制。 方法: 采用形态学检测VK2 作用后的细胞形态改变～MTT方法检测VK2 对K562细胞的生长抑制作用～流式细胞仪Annexin-V FITC .PI分析细胞凋亡～PI染色分析细胞周期变化～RT.PCR技术检测抗凋亡基因bcl.2、促凋亡基因bax的表达。 结果: 经VK2 作用后细胞出现明显的形态学改变:细胞变小～核固缩～核染色质聚集边挤于核膜内侧呈新月形以及典型凋亡小体形成等;MTT结果显示VK 2 对K562细胞有明显的抑制作用～作用72h半数抑制浓度为25.1μmol?L-1 ;流式细胞仪检测结果显示随着VK 2 浓度的增加凋亡率逐渐增高,P<0.05,～随着作用时间的延长凋亡率也逐渐增高,P<0.05,;VK 2 作用72h～S期细胞逐渐减少,r=- 0.99～P<0.05,～G 0 .G 1 期细胞逐渐增加,r=1.00,～细胞被阻滞在G 0 .G 1 期;随着VK 2 浓度的增高抗凋亡基因bcl.2表达明显下调～而促凋亡基因bax表达无明显差异。 结论: VK 2 通过诱导K562细胞凋亡抑制其增殖～并呈浓度和时间依赖性;抗凋亡基因bcl.2下调可能是VK 2 诱导K562细胞发生凋亡的机制之一。 ,关键词, 维生素K 2 ;K562细胞;细胞凋亡;细胞周期;基因表达;抗凋亡基因bcl.2 维生素K2 ,VK2 ,是天然的具有萘醌核结构的化合物～有凝血活性～临床上作为止血药物已应用多年。近几年有关VK2 抗肿瘤的作用1，7, 日益受到重视～但对作用机制研究甚少。本实验研究了VK 2 对K562细胞的生长增殖、诱导凋亡作用及其机制。 1 与方法 1.1 材料与细胞培养 VK2 购自Sigma公司～用无水乙醇配成浓度为5、10、20和40μmol?L-1 ～实验表明该浓度乙醇对K562细胞生长无影响。K562细胞株购自上海细胞生物研究所～用RPMI.1640培养液加10%小牛血清～在37?饱和湿度条件下体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养。 1.2 MTT比色法取对数生长期细胞～调细胞浓度为1×10 5 ml-1 接种于96孔培养板～实验组分成4组分别加入不同浓度,5、10、20和40μmol?L-1 ,VK2 ～对照组不加药～另设空白对照组,只加培养液,。置37?、体积分数为0.05的CO2 饱和湿度培养箱中孵育～分别于24、48、72和96h取出加MTT,终浓度为0.5mg?ml-1 ,20μl～继续培养4h～弃上清～加二甲亚砜150μl～摇床震荡10min～用酶标仪,B-L,570nm波长读取光密度～以时间为横坐标、A值为纵坐标绘制细胞生长曲线～半数抑制浓度,IC 50 ,采用Logit法计算。实验重复3次～每孔设复孔5个～取均值为最终结果。 1.3 细胞形态学观察取对数生长期细胞～调细胞浓度为1×10 5 ml -1 ～试验组加入不同浓度VK2 ～对照组不加药培养72h～收集细胞涂片作瑞氏染色观察细胞形态的改变。 取对数生长期细胞调细胞浓度为1×10 5 ml-1 ～接种于6孔培养板～分别加入不同浓度,0、5、10、20和40μmol?ml -1 ,的VK 2 ～分别于孵育24、48、72和96h收 集细胞～经PBS洗涤后加Annexin-V FITC 和PI避光作用10min后在流式细胞仪上检测凋亡细胞。结果Annexin- ?染色阳性PI染色阴性和Annexin-?染色阳性PI染 色阳性细胞均为凋亡细胞～而Annexin-?染色阴性PI染色阳性为机械损伤细胞。 1.4 细胞周期分析 于Annexin-?.PI检测细胞凋亡的同时收集1×10 6 细胞进行细胞周期分析～所有资料经Multieycle1.0DNA分析软件分析。 1.5 RT.PCR半定量检测bcl.2和baxmRNA表达引物由上海生工生物工程公司合成:bax,258bp,:5′.ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC.3′～ R:5′.TGTC-CAGCCGCATGATGGTTC.3′;bcl.2,326bp,F:5′.GACT-TCGCCGAGATGTCCA.3′～R:5′.GTCTTGAGAGA-CAGCCAGGA.3′;GAPDH,内对照,F:5′.TCCCATCAC-CATCTTCCA.3′～ R:5′.CATCACGCCACAGTTTCC.3′。总RNA抽提:按Promema公司提供的试剂盒建议的步骤操作。逆转录:在0.5ml PCR管中加1μg总RNA、0.5μg Oligo,dT,引物、4μl缓冲液、2μl10mmol?L-1 dNTP混合物、0.5μl,20U,重组核酸酶抑制剂Rna-sin、1μl,10U,AMV逆转录酶,Promega公司,～总反应体系20μl～42?逆转录1h～然后95?5min使酶失活。上述cDNA加80μl dd H2 O稀释后～取4μl用于50μl PCR反应。PCR:在50μl反应体系中加入PCR缓冲液,Taka-ra,5μl、4μl2.5mmol?L-1 dNTP、4μl25mmol?L-1 MgCl 2 、GAPDH内对照引物和基因特异性引物,上、下游,各20pmol、cDNA稀释液4μl、Taq DNA聚合酶0.5μl,2.5U,～95?加热预变性后94?45s、58?1min、72?1min进行35个PCR循环～最后在72?延伸7min。 取5μl PCR产物加1μl上样缓冲液混匀～1.5%琼脂糖凝胶电泳～溴化乙锭染色～紫外灯下拍摄～用Kodak EDAS120凝胶电泳分析系统对电泳条带进行光密度分析。 1.6 统计学处理 实验结果以均数?标准差表示～实验数据用SPSS for windows统计软件进行处理～采用单因素方差分析和双因素相关分析～P<0.05为差异有显著性。 2 结 果 2.1 MTT检测结果VK2 对K562细胞具有明显的生长抑制作用～不同浓度,0、5、10、20和40μmol?L-1 ,VK2 具有不同的生长抑制作用,P<0.01,～作用不同时间,24、48、72和96h,其生长抑制作用也不同,P<0.05,～见图1。经加权直线回归方程计算～72h IC 50 为25.10μmol?L -1 。 图1 VK2 作用后K562细胞的生长曲线图 2.2 细胞形态对照组细胞形态相对较～胞体较大～胞浆较多～胞浆中有少量的空泡;胞核大～核染色质细致～核仁清楚。而经VK2 处理组细胞胞浆中含有大量空泡呈蜂窝状;胞核变小～核染色质边挤、固缩形成典型的凋亡小体。见图2。a.凋亡细胞;b.正常对照图2 VK2 作用72h后细胞形态变化 2.3 流式细胞仪检测结果不同浓度,5、10、20和40μmol?L-1 ,的VK2 作用于细胞48h的凋亡率分别是,13.0?2.0,%、 ,13.9?2.3,%、,16.3?2.6,%和,22.4?2.8,%～明显高于对照组的,13.0?1.5,%,P<0.01,;作用72h凋亡率分别为,14.8?1.3,%、,17.3?2.1,%、,19.4?1.8,%和 ,30.2?2.3,%～显著高于对照组的,15.5?2.2,%,P<0.01,;作用96h凋亡率为,17.8?2.5,%、 ,31.0?2.5,%、,40.4?2.9,%和,48.7?2.5,%～显著高于对照组的,18.9?2.1,%,P<0.05,。随着时间的延长凋亡率也逐渐增高,P<0.05,。见图3。 图3 VK2 作用后凋亡率与药物浓度和作用时间关系 2.4 bcl.2和bax mRNA的表达与VK 2 作用之间的关系不同浓度,5、10、20和40μmol?L-1 ,的VK2 作用72h后抗凋亡基因bcl.2表达分别为1.11?0.02、0.77?0.01、0.51?0.04和0.35?0.02～与对照 组,1.48?0.03,相比呈明显下调,P<0.05,;而促凋亡基因bax则没有明显的差异,P>0.05,。见图4、5、6。 图4 VK 2 作用72h后bcl.2、baxmRNA表达变化1.正常对照;2，5.依次为5、10、20和40μmol?L-1 VK 2 ;6.Marker 图5 VK 2 作用72h bcl.2电泳图1.正常对照;2，5.依次为5、10、20和40μmol?L-1 VK 2 ;6.Marker 图6 VK2 作用72h bax电泳图 2.5 VK 2 作用K562细胞72h后～抗凋亡基因bcl.2mRNA表达变化与细胞凋亡率之间的关系不同浓度,0、5、10、20和40μmol?L-1 ,的VK2 作用 K562细胞72h后bcl.2的表达分别为1.48?0.03、 1.11?0.02、0.77?0.01、0.51?0.04和0.35?0.02～而此时的凋亡 率分别为,15.5?2.2,%、,15.8?2.7,%、,17.3?2.1,%、,19.4?1.8,%和,30.2?2.3,%～采用双因素相关分析发现bcl.2mRNA下调与细胞的凋亡呈负相关,r=-0.99～P<0.05,。 2.6 VK2 对K562细胞周期的影响流式细胞仪检测的DNA含量图中～在G 1 期细胞前出现亚G1 峰即凋亡峰～对照组也有少量的凋亡。不同浓度的药物作用K562细胞72h分析周期的变化发现～随着药物浓度的增加G 0 .G 1 期细胞逐渐增多,r=1.00,～而S期细胞逐渐减少,r=-0.99～P<0.05,～细胞被阻止在G0 .G 1 期。见图7。a.正常对照;b.40μmol?L-1 VK2 形成典型的凋亡峰 图7 VK 2 作用72h后细胞周期的变化 3 讨 论 近几年～国外学者已经研究证实VK2 能诱导白血病细胞株HL.60,1，3, 、MDS,4，7, 、肝癌,5, 和鼻咽癌,8, 等多种细胞发生凋亡～特别是近几年国外有报道VK 2 能选择性地诱导白血病细胞发生凋亡～而对正常骨髓细胞只有微弱的抑制作用3, 。国内相关报道鲜见～尤其对VK 2 诱导K562细胞凋亡及机制的研究国内外尚未见报道。 本实验研究了VK2 对体外培养K562细胞增殖的抑制作用及其作用机制～实验结果表明～VK 2 作用K562细胞后细胞的生长受到明显的抑制～并呈时间、 浓度.效应依赖关系～作用72h IC50 为25.10μmol?L-1 ;进一步研究表明～VK2 抑制K562细胞增殖主要是通过诱导其凋亡实现的。细胞形态学上表现为凋亡细胞典型形态学特征～如细胞体积变小～胞浆空泡化～核染色质固缩、边聚于核膜内缘呈新月形以及形成典型的凋亡小体等;流式分析结果显示～细胞的凋亡率与VK2 的浓度和作用时间也呈明显的量效和时效关系;细胞周期分析还发现～随着VK 2 浓度的增加～S期细胞逐渐下降～G 0 .G 1 期细胞逐渐增多～细胞被阻滞在G0 .G1 期;RT.PCR结果显示～在VK 2 诱导的K562细胞发生凋亡的过程中～抗凋亡基因bcl.2明显下调～而促凋亡基因bax则无明显变化。Bcl.2和bax是一对正负凋亡调节基因,9～10, ～但本实验结果表明bcl.2下调可能是VK2 诱导K562细胞发生凋亡的主要机制之一～而与促凋亡基因bax无关。凋亡的发生是多因 素、多通路参与的一系列复杂过程～在VK 2 诱导K562细胞发生凋亡 的过程中是否还存在其他的凋亡机制尚有待进一步研究。VK 2 下调 K562细胞株bcl.2mRNA的表达国内未见报道～本实验结果将为临床使 用V 2 治疗相关病人提供理论依据。 ,参考文献, ,1,MIYAZAWA K～YAGUCHI M～FUNATO K～et al.Apoptosis.dif- fefentiation inducing effects of vitamin K2 on HL.60cells:dichoto-mous nature of vitamin K2 in leukemia cell,J,.Leukemia～2001～15,7,:1111.1117. ,2,FUNATO K～MIYAZAWA K～YAGUCHI M～et al.Combinationof22- oxa-1～25-dihydroxyvitamin D3 ～a vitamin D 3 derivative～ with vi-tamin K2 ,VK 2 ,synergitically enhances cell differentiation but sup-presses VK 2 inducing apoptosis in HL.60cells,J,.Leukemia～2002～16,8,:1519.1527. ,3,YAGUCHI M～MIYAZA K～KATAGIRI T～et al.Vitamin K2 and its derivatives induce apoptosis in leukemia cells and enhance the ef-fect of all-trans retinoic acid,J,.Leukemia～1997～11,6,:779.787. ,4,TAKAMI A～NAKAO S～ONTACHI Y～et al.Successful therapy of myelodysplastic syndrome with menatetrenone～a vitamin K 2 analog ,J,.Int J Hematol～1999～69,1,:24.26. ,5,NISHIKAWA Y～CARR B I～WANG M～et al.Growth inhibition of hepatoma cells induced by vitamin K and its analogs,J,.J BiolChem～1995～270,47,:28304.28310. ,6,YAGUCHIM～MIYAZAWA 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