脂多糖结合蛋白与杀菌通透性增加蛋白研究进展

脂多糖结合蛋白与杀菌通透性增加蛋白研究进展 word格式 内毒素/脂多糖结合蛋白与杀菌通透性增 加蛋白研究进展 【摘要】 内毒素所致的内毒素休克和多器官功能衰竭是导致革兰阴性菌 感染患者死亡的重要原因,内毒素结合蛋白,endotoxin binding protEin,EBP,及其受体系统在机体识别和调控内毒素作用中起重要作用,通过其增敏或抑制作用而发挥生物学效应,本文就脂多糖结合蛋白,lipopoysacchride binding protEIn,LBP,与杀菌通透性增加蛋白,batericidal permeability increasing protein,BPI,的特性、相互关系及 研究 进展作一综述。 【关键词】 脂多糖结合蛋白,内毒素结合蛋白,杀菌通透性增加蛋白,内毒素血症 脂多糖(lipopolysacchride,LPS)是革兰阴性菌细胞壁外膜的主要成分[1],近年研究证明,内毒素结合蛋白(endotoxin bindingprotein,EBP)及其受体系统在机体识别和调控内毒素作用中起重要作用,内毒素通过其增敏或抑制作用 word格式论文 而发挥生物学效应,其中脂多糖结合蛋白(lipopolysacchride bindingprotein,LBP)与杀菌通透性增加蛋白(bactericidal permeability increasing protein,BPI)起到关键作用[2],LBP与BPI均为脂质转移和脂多糖结合蛋白家族成员,尽管结构有许多相似之处,但功能却截然不同[3]。本文就LBP和BPI的特性、相互关系及研究进展作一综述。 1 脂多糖结合蛋白(LBP) 1,1 LBP的生理特性 LBP属糖蛋白,其相对分子量约为60×103,肝脏是其合成和分泌的主要场所,但其他脏器如肺、肾、心、脾及肠上皮细胞也有不同程度的表达。不同哺乳动物种属间LBP存在一定的差异性。LBP耐热性差,50 ? 以下活性尚稳定,在53~56 ? 之间约丢失50%的活性,如小鼠LBP在59 ? 时,其活性几乎完全丧失,人LBP在56 ? 30 min 活性可丢失70%。 1,2 LBP的生物学效应 word格式论文 LBP的体外实验提示,机体在炎症反应初期通过正常血浆中少量的LBP增敏LPS,从而激发机体的炎症反应。临床上内毒素休克、内毒素血症、多器官功能不全时病人血浆中的内毒素浓度差异较大,提示体内存在内毒素致敏物质[2],LPS在水溶液中以多聚体形式存在,其 自然 解聚成LPS单体的速度很慢,LBP可明显加速LPS的解聚并将其转运至mCD14,故LBP与CD14在革兰阴性菌感染的免疫反应中发挥关键作用[4]。革兰阳性菌的脂膜酸也可通过LBP识别,甚至对螺旋体、分枝杆菌也有类似作用[5]。 生理条件下血浆中LBP含量极微100 ng/L,当受LPS刺激后,LBP浓度迅速增高,血浆中LBP可达100倍以上,LBP加速运送LPS至细胞膜上与mCD14或与血清中sCD14结合,而形成可溶性复合体,迅速刺激体内单核巨噬细胞,使LPS与CD14的亲和力增高数百倍,并且分泌大量炎性介质,造成机体损害,然后LBP从复合物中脱出,再进入下一个循环。该复合物激活跨膜受体Toll样受体4 MD2(TLR4 MD2)[6~7],通过其胞内的IL 1R同源结构并利用IL 1R下游的信号传递分子进行与IL 1相类似的胞内信号转导,其中胚胎蛋白MyD88是TCR4和IL 1R激活NF κB必不可少的一种接头蛋白。当IL 1与IL 1R结合后,IL 1R即与胞浆内IL 1受体辅助蛋白(IL 1RacP)结合,此复合物激活MyD88(羧基端存在TIR结构域),活化的MyD88可结合IL 1R相关激酶IRAK和IRAK2(通过氨基端的死亡结构域与MyD88相作用)[8],然后与肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF6)相互作用,通过TRAF6使IKAR及 word格式论文 IKAR2连接于NF κB诱导激酶(NIK),NIK被活化后进一步激活IκB激酶复合体(IKK α及IKK β),活化的IKK复合体使IκB直接被磷酸化,激活的NF κB移位入核,启动免疫应答基因转录[9]。静息状态时lκB借助P50蛋白A与NF κB结合形成三聚体以失活状态存在于细胞质中,磷酸化的IκB即与NF κB分离导致NF κB释放后由胞浆进入核内与相关基因的κB位点结合并转录为mRNA,进而介导单核巨噬细胞的活化,最终导致全身炎症反应综合征(SIRS)的发生[10]。在LBP存在下,体内1‰浓度的LPS即可激活外周血单核细胞。 [11]的研究表明,LBP使LPS刺激单核吞噬细胞系统合成TNFα的Heumann等 阈值明显下降,约为原来的1‰,并使LPS诱导该系统生成细胞因子的速度明显加快。Guha等[12]也发现LPS与血浆中的LBP结合后作用于CD14,经TLR4和MD 2复合物激活不同的MAPK途径,包括ERK、JNK、p38等,通过这些途径直接或间接激活不同的转录因子,如Elk、SRF、c Jun、c Fos、ATF 2和CREB而启动基因的转录和翻译。 在内毒素血症发生和 发展 过程中,LBP在体内所发挥的作用除了与LPS的浓度密切相关外,同时还与它本身的浓度有关。低浓度LPS(含量在1~5 μg/L 水平)时,LPS的毒性作用依赖于LBP剂量,即前述LPS的毒性作用需通过LBP的增敏效应,并且在一定范围内其效应随着LBP浓度的增加而增加,但当LBP升高到一定浓度时其对LPS的增敏效应有所减弱,甚至消失。高浓度的LPS并不需要LBP的增敏作用,如没有LBP时,大剂量的LPS同样可激活靶细胞,产生大量细胞因子和炎症介质,可能的机制为,大剂量LPS时,解离为LPS的 word格式论文 单体增多,细胞表面可能存在另一种非LBP依赖受体,与LPS的亲和力较低,但在高浓度LPS时可与LPS直接结合,介导细胞信号转导,高浓度LPS可直接与TLR4 MD2结合,激活靶细胞,释放炎症介质,导致机体的损伤。 1,3 LBP的保护功能 高浓度的LBP可抑制LPS介导的细胞因子如IL 1、TNFα等炎症介质的释放,并可减轻肝细胞损伤,降低小鼠的死亡率,此即LBP的保护功能[5],这种功能可能与下列因素有关,LBP可以介导LPS与高密度脂蛋白的结合,在磷脂转移酶的作用下,使LPS在高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)之间转移[3],LPS从HDL转移后,HDL转为两个亚单位,该亚单位的形成又进一步提高了HDL LDL复合物与LPS结合的稳定状态,从而中和LPS的炎性效应[13],LBP可增强巨噬细胞与大肠埃希菌的结合及其吞噬作用,并存在时间和剂量上的依赖性,表明在革兰阴性杆菌的清除中也发挥着重要的作用,LBP还可以促进磷脂与mCD14的结合,从而减少LPS与mCD14的结合和LPS刺激的单核 巨噬细胞释放细胞因子[14],LBP具有直接的LPS中和效应,并且在极低LBP/LPS比值时即可使LPS的生物活性受到 影响 。 1,4 LBP尚未明确的 问题 word格式论文 研究发现LBP基因清除的小鼠血清无增敏LPS的作用,这表明LBP应是血清中唯一可增敏LPS与单核 巨噬细胞结合的因素。然而Le等[4]学者发现CD14、LBP的单抗可以推迟TNFα的分泌和减少24 h 内的致死率,但不能改变24 h 以后的动物致死率,提示在血清中可能还存在其他的与LBP功能相似的内毒素结合蛋白。需要进一步弄清楚的是LBP在启动内毒素多脏器损伤的确切调节作用及发生机制,在组织中寻找LBP蛋白的mRNA原位表达的直接证据,探讨LBP与细胞因子相关性表达的意义。 2 杀菌通透性增加蛋白(bactericidal permeability increasing protein,BPI) 2,1 BPI的生理特性 天然BPl是由456个氨基酸残基构成的,其相对分子量为55×103、等电点为pH 9,8的阳离子,是一种能中和内毒素的内源性粒细胞蛋白质,与LPS的类脂A具有高度亲和力[1]。BPI是存在于人中性粒细胞嗜天青颗粒中的蛋白质, 其在化学结构上与内毒素结合蛋白(LBP)具有同源性,尤其是与类脂A结 word格式论文 合的区域,许多实验证实BPI对革兰阴性杆菌具有杀菌和中和内毒素的作用,从而抑制内毒素刺激单核细胞产生细胞因子,正常血液循环中BPI含量很低,大约是血浆中LBP的千分之一,但却具有强大的杀菌和中和内毒素的作用,故有“超级抗生素”之称。人BPI基因位于第20号染色体上,序列 分析 显示,该基因全长1 459 bp。除人外,兔、牛、猪、狒狒、鼠等哺乳动物的中性粒细胞嗜天青颗粒中亦发现了BPl,并且在不同动物种属间BPI具有高度的同源性。 2,2 BPI生物学活性 2,2,1 结合LPS作用 BPI与LBP一样其N端能结合LPS的类脂A部分,但BPI与LPS结合后所引起的生物学效应却与LPS LBP复合物所引起的生物学效应截然相反。BPI及其活性片段均无明显的毒性和免疫原性,在人体及不同动物内毒素血症模型中都能发挥强有力的中和内毒素的作用。研究表明BPI与LBP相比对LPS具有更高的亲和力[15],较低浓度BPI即可竞争性抑制较高浓度的LBP与LPS的结合,减少LPS LBP复合物的形成及其向mCDl4等LPS受体的转运,从而拮抗LPS诱导的细胞激活反应。因此,BPI常被认为是LBP的天然拮抗剂、LPS的抑制物[1]。BPI作为LPS的抑制物、LBP的拮抗剂,具有其他外源性生物拮 word格式论文 抗剂无可比拟的优点。实验发现在感染时BPI能明显升高,且BPI/LBP比值也升高,这有利于BPI同LBP竞争性结合内毒素,从而减少内毒素引起的局部和全身性炎症反应及毒性作用[16]。 2,2,2 杀菌作用 BPI的杀菌作用主要局限于革兰阴性菌,但这些细菌对BPI的敏感性有较大差异,体外研究显示,细菌对BPI敏感性的差异与细菌胞壁结构的完整性、O特异多糖长度及细菌外膜孔蛋白调节因子(OmPR)的功能有关,完整的BPI不能杀灭革兰阳性细菌[17]。利用蛋白酶分解BPI,研究发现位于NH2末端的1~199氨基酸(25×103)片断具有杀菌能力,氨基酸系列分析发现rBPI的杀菌活性、中和内毒素和结合肝素的活性区域分别位于第17~45、65~99和142~169氨基酸区域内,故认为rBPI由3个独立功能区域组成, 这些单独功能区的活性或其共同作用是rBPl生物学效应的基础[18]。BPI的杀菌过程分为早期的可逆性生长抑制和晚期的不可逆性杀灭作用。早期BPI及其N端片段与革兰阴性菌外膜LPS结合后,1 min 内即可使细菌分裂停止,细菌外膜疏水性屏障被破坏,菌体内一些酶类被激活并水解外膜磷脂和肽聚糖,导致菌体细菌壁的损伤,抑制细菌生长,但这时细菌还可能生长和修复。晚期,随着BPI浓度增加,作用时间延长,细菌外膜屏障破坏,出现结构和功能性改变,细菌生长不可逆性受抑制,细菌裂解、死亡。静脉注射人源性BPI能显著降低内毒素致伤小鼠的死亡率,家兔早期 应 word格式论文 用 BPI 治疗 后能耐受皮肤斯氏反应,对光滑或粗糙型内毒素或不同血清型内毒素均有保护作用。人源或重组BPI同样具有竞争性抑制LBP特性,阻止内毒素与中性粒细胞的结合和内毒素在中性粒细胞的内移,能抑制内毒素的鲎试剂(LAL)反应,抑制内毒素刺激中性粒细胞表达CR和CR3,对内毒素诱导的纤维蛋白溶解和凝血系统活化具有明显的保护作用。重组BPI(rBPI)还能抑制光滑或粗糙型内毒素介导的内皮细胞的损伤和IL 6、TNF、IL 1等的释放, 同时具有时间依赖性, 对内毒素诱导的血流动力学改变具有剂量依赖性[19]。 2,2,3 BPl可作为调理素,发挥调理作用 BPI通过其氨基末端区与细菌表面的LPS结合,再通过其羧基末端区与吞噬细胞表面结合,形成桥状连接,便于吞噬细胞吞噬这些细菌。尤其是有荚膜的,易逃避吞噬作用的细菌,BPI可通过发挥调理作用,使之易被中性粒细胞等吞噬[17]。BPI调理作用功能区分布在羧基末端区。 2,3 BPI的 研究 进展 rBPI的作用效力已在鼠模型上进行了研究[20],与非对照组相比, BPI word格式论文 可有效地降低LPS攻击小鼠的死亡率,提示BPI是一种有前景的 治疗 革兰阴性菌感染的药物[21]。BPI具有“超级抗生素”美称,但由于人工合成的BPI循环半衰期短,需重复给药,成本高、用药量大,而且它只对许多革兰阴性菌有效。因此,利用基因合成技术研制出半衰期更长、抗菌谱更广的BPI片段,已成为今后关注的热点。有人[21]已经利用基因转换的 方法 将BPI基因转移到缺陷的腺病毒上,导致BPI蛋白的细胞外分泌,显著地降低了LPS刺激的促炎性细胞因子的释放,明显地提高了败血症休克小鼠的生存率。该结果提示BPI基因转换用于败血症的治疗有潜在的 应用 价值。 目前 ,在临床上内毒素所致的内毒素休克和多器官功能衰竭仍是导致革兰阴性菌感染的患者死亡的重要原因。尽管通过各种体内外实验,已经基本了解到LBP、BPI、CDl4等在LPS的毒性作用中起到的作用,但是由于大部分实验都限于动物实验及体外研究,在临床研究中并未获得预期的积极效果,因此,深入认识和研究内毒素血症产生的机制,以协助寻找有效的治疗策略和措施,这对于合理干预内毒素血症、预防感染性休克及多器官功能衰竭的发生具有十分重要的临床意义。随着 科学 研究的不断深入,有关内毒素血症的疑难 问题 一定能逐渐解决。 【 参考 文献 】 [ 1] Azuma M, Matsuo A, Fujimoto Y,et al.Inhibition of lipid A mediated type I interferon induction by word格式论文 Bactericidal/permeability increasing protEin(BFI)[J], Biochem Biophys Res Commun, 2007,354(2),574-578, 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