t10,c12-CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织脂类代谢的影响

t10,c12-CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织脂类代谢的影响 t10,c12-CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织 脂类代谢的影响 畜牧与饲料科学AnimalHusbandryandFeedScience2011,32(9—10):133—136 tlO,c12一CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织脂类代谢的影响 杜瑞平,高民,卢德勋 (1.内蒙古农业大学动物科学学院,内蒙古呼和浩特010018;2.内蒙古农牧业科学院动物营养研究所,内蒙古呼和浩特 010031) 摘要:试验首先建立了30日龄猪皮下脂肪和背最长肌组织块体外培养体系,共设2个处理,处理1为阴性对照(添加 0.1mmol/L牛血清白蛋白,BSA),处理2添加100txmol/L的tl0,c12一CLA,每个处理设6个平行,接种时即加入BSA与 tl0,e12一CIA进行处理至第10天,试验结束后收集细胞保存备用.采用荧光定量PCR技术及试剂盒检测研究tl0.c12一 CLA对猪皮下和背最长肌脂肪代谢关键酶(FAS,ME,LPL,HSL)和激素(INSR,GHR)及甘油三酯(TG)合成的影响.结果 明:?100txmol/LtlO,e12一CLA显着降低了猪皮下脂肪TG含量并提高了猪背最长肌的TG含量(P<0.05):?100 I~mol/Ltl0,c12一CLA显着抑制了猪皮下脂肪FAS,INSR与背最长肌HSL和U的基因表达,促进了猪皮下脂肪HSL 和背最长肌INSR的基因表达(P<0.05):?该研究结果从脂肪代谢关键酶类与调控激素方面揭示了tl0.c12一CLA对猪 皮下和背最长肌组织脂肪代谢与沉积的差异性调控机制,进一步证实了tl0,el2一CLA抑制猪皮下脂肪沉积同时提高 肌内脂肪含量. 关键词:tl0,e12一CLA;背最长肌;皮下脂肪;脂肪代谢关键酶;调控激素;猪 中图分类号:$816.7文献标识码:A文章顺序编号:1672—5190(2011)09—0133—04 StudiesonEffectsoftlO,c12-CLAonLipidMetabolismofSubcutaneousandLongissimus MuscleTissuesinPig DURui—ping-一.GAOMin.LUDe—xun (1.CollegeofAnimalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China;2.InstituteofAnima1Nutrition,Inner MongoliaAcademyofAgricuhuralandAnimalHusbandrySciences.Hohhot010031.China) Abstract:Invitrotissueculturesystemofsubcutaneous(SC)adiposeandlongissimusmuscletakenfrom30dpigwereconstructed firstly,0.1mmol/Lbovineserumalbumin(BSA,ascontro1),100Ixmol/Ltl0,c12一 CLAwereaddedtotheculturesfor10d.six replicateswereperformedforeachtreatment.Attheendof10dtreatmentperiod.cellswereharvestedandstoredat一70oC.Real—time RT—PCRandkitassaywereusedtocharacterizetheeffectsoftl0.c12一 CLAonthelipogenicandlipolytieenzymes.regulation hormones.TGcontentinlongissimusmuscleandSCadiposeofpig.Theresultsshowedthat:themRNAabundanceofFASandINSR.TG contentinSCadiposetissueandthemRNAabundanceofHSLandLPLinlongissimusmuscletissueweredecreasedbyaddingtl0, c12一 CLA(P<0.05):bycontrast,HSLmRNAabundanceinSCadiposetissueandthemRNAabundanceofINSR,TGcontentin longissimusmuscletissuewereincreasedbyaddingtl0,c12一 CLA(P<0.05).Theseresultsillustrated出attheeffectsoftl0.c12一CLAon 1ipidmetabolismanddepositionofSCadiposetissuedifferedfromthatonlongissimusmuscletissue.andfurtherconfirmedthattl0. cl2-CLAinhibitedthelipiddepositionofSCadiposeandpromotedthelipiddepositionoflongissimusmuscleinpig. Keywords:tlO,e12-CLA;longissimusmuscle;subcutaneousadipose;lipidmetabolismenzymes;hormones;pig 共轭亚油酸(CLA)是亚油酸(LA)衍生的共轭双烯的多 种位置与空间异构体的总称.理论上其主要位置异构有4 种即8,10一,9,11一,10,12一和11,13一,而每种异构体又有4 种几何异构体,因此共轭亚油酸的种类十分丰富,但无论是 天然的还是人工合成的CLA,只有c9.tl1和tl0.c12是其 最主要的生物活性异构体.近年来,共轭亚油酸(CLA)的生 物学功能备受瞩目.作为一种新型功能性油脂,共轭亚油酸 具有抗癌,抗动脉粥样硬化,抗糖尿病,降低胴体脂肪含量, 调节免疫,促进生长,增加瘦肉率,改善肉品质及影响骨骼 形成等诸多生理功能.c9,tl1-CLA在提高动物机体的免疫 力,抗癌和提高动物的生长性能方面作用较大,而tl0,c12一 CLA在改变动物机体的脂肪代谢方式以及降低脂肪在动物 体内的沉积方面起主要作用… 本文首次发表在《饲料工业}2010年第19期. 项目来源:国家"973"重点基础研究发展计划 (20O4CB117500). 作者简介:杜瑞平(1979一).女,助理研究员,博士,主要研究 方向为反-5动物营养调控理论与技术 通讯作者:卢德勋(1937一),男,研究员,博士,博士生导师,主 要研究方向为反刍动物营养调控理论与技术. 动物体脂的沉积是脂肪合成代谢与分解代谢的一种动 态平衡,其沉积能力包括脂肪的合成,分解和转运3个方 面.酶和激素在这些代谢过程中起到了至关重要的作用l1]. Lin等发现,tl0,c12一CLA显着降低了3T3一L1前脂肪细胞 中L兕,5和AP2基因mRNA的水平.Brandebourg和 Hu也报道.CLA通过下调脂肪分化过程中关键基因的表达 抑制猪皮下脂肪前体细胞的分化,进而抑制脂类沉积[3J.那 么tlO,c12一CLA对猪皮下脂肪和背最长肌两个部位前脂肪 细胞增殖与分化及脂类代谢与沉积的影响是通过怎样的调 节机制进行调控,该试验即在mRNA水平上研究tl0,c12一 CLA对脂类代谢关键酶中的脂肪酸合成酶(FAS),苹果酸酶 (ME),激素敏感酯酶(HSL),脂蛋白酯酶(LPL)及脂类代谢 调控激素中的胰岛素和生长激素受体(INSR,GHR)的影响, 旨在进一步探讨CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织脂类代 谢的影响并初步揭示其机理. 1材料与方法 1.1试验动物内蒙古农牧业科学院猪场30日龄猪. 1.2试验试剂tl0,c12一CLA购买自Matreya公司:胰岛 素,地塞米松,甲基异丁基黄嘌呤,青霉素和链霉素购买自 134畜牧与饲料科学第32卷 Sigma公司:DMEM/F12干粉培养基,胎牛血清,牛血清白蛋 白和胶原酶?购买于Gibico公司;RNA提取,反转录和普 通PCR反应所用试剂及定量PCR试剂盒(SYBRGreenPCR Kit)购自上海生物T程技术有限公司;DNAMarker (DL1000)购自TAKARA公司,TG测定试剂盒购自北京五洲 元业试剂公司.其余化学试剂购自南京建成生物试剂公司. 1.3主要溶液配制DMEM/F12培养液:10.0LDMEM/ F12培养基,三蒸水.IO%胎牛血清,100IU,mL青霉素,100 txg/mL链霉素,1.2g/LNaHCO,过滤(0.22m滤膜)除菌,按 每次试验需要量分装,4?贮存备用. 组织消化液:?型胶原酶配成1mg/mLHBSS液,过滤 除菌,一20?储存备用. 100p.mol/LCLA液:先用100L无水乙醇溶解25mg CLA,加入8.93mL培养液配成0.01mol/L的母液,滤菌, 一 20?保存,使用时用培养液稀释即可. 分化储备液:分别称取胰岛素5.00mg,地塞米松0.20埘嘱, 甲基异丁基黄嘌呤55.63mg溶于500L无水乙醇中,待完 全溶解后加三蒸水至50mL,滤菌,一20?保存. 1.4组织块培养? ?无菌切取仔猪肩胛部皮下脂肪约5g,背最长肌约8g, 于75%酒精中浸泡3—5S,然后用D—Hanks液清洗3次,置 于消毒的PBS液中:?在培养液或者平衡盐溶液中分离去 除组织中可见的纤维及血管,反复剪切至1mm大小为止 (呈糊状).然后用吸管吸取HBSS液把附着在剪刀上的组 织小块冲下,并补加3,5mLHBSS液后,去上清液,余下的 组织块即可用于培养;?用眼科探针将组织小块均匀摆布 于60eln的培养皿,每小块间距约0.5em,置5%CO,37? 培养箱l,2h左右,再向底部轻轻注入5mL完全培养液. 于CO:培养箱(37?,5%CO)中静置培养,开始2d尽量不 去搬动,以利贴壁和生长,培养第3天换液,此后每2d换液 1次.细胞汇合后用基础培养液漂洗后(一定不要剩余血 清),然后改用无血清分化培养液培养至第l0天. 1.5TG含量测定试验处理第9天收集各组细胞,超声 波处理.按TG试剂盒说明书检测细胞内TG含量,结果以 txmol/mL表示 1.6荧光定量PCR 1.6.1引物设计与合成:登陆NCBI网站查询相关基因序 列.使用DNA—MAN软件设计PCR特异引物,委托上海生 物工程公司合成.将冻干粉状态的引物离心后,用灭菌超纯 水配制成100txmol/L贮备液和20~.mol/L工作液,一20?保 存.引物设计参数见表1. 1.6.2荧光定量PER:定量PCR反应体系见表2.优化反应 程序如下:?95?预变性15min;?95?变性30S;?53, 60?退火30S;?72?延伸30S,循环40次;?72?延伸 1min:?70,95oC生成融解曲线.反应结束后,样品保存 于一20?备用. 1.7试验设计共设2个处理,处理1为阴性对照(添加 0.1mmol/LBSA),处理2添加100~mol/L的tl0,c12一CLA, 每个处理设6个平行,培养开始即加入BSA与tl0,el2一 CLA进行处理至第10天.试验结束后收集细胞保存备用. 表2荧光定量PCR反应体系 成分体积(I) 2xSYBRGreenPCRKit cDNA 引物F(20p~mol/L) 引物R(20p.mol/L) Nuclease—FreeWaterto 12.5 2.5 1.0 1.0 25.0 1.8统计分析采用SPSS11.5软件中单因素方差分析进 行统计.P<0.05时确定为差异显着,P<0.01时确定为差异极 显着. 2结果与讨论 2.1tl0.el2一CLA对猪皮下脂肪和背最长肌内脂类代谢 关键酶的影响(见图1)图1为荧光定量PCR测定脂肪代 谢关键酶类FAS,ME,LPL及HSL的分析结果.脂质的积累 是脂肪合成与分解代谢的动态平衡结果,在这一过程中,生 脂酶和解脂酶发挥着重要作用,FAS与ME是脂肪酸生物 合成甘油二三酯反应的主要限速酶之一,IJPL和HSL则是参 与脂肪分解过程的关键酶类,它们是脂肪代谢和沉积的系 列酶促反应的关键调节因素,它们的表达水平和活性高低预示着TG合成的变化.该试验结果表明,100Ixmol/Ltl0, c12一CLA显着抑制了猪皮下脂肪FAS基因表达及背最长 肌HSL和LPL基因表达.并显着提高了猪皮下脂肪HSL基 第9—10期杜瑞平等:tlO,c12一CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织脂类代谢的影 响135 2.5 ?l12.0 1.5 函 醐1.0 0.5 0 ' 图1脂肪代谢酶FAS,ME,LPL及HSL的相对基因表达水平 因表达(P<0.05),2个部位其他酶基因则无显着性差异(|p> 0.05).由此可以发现.tl0,c12一CLA处理后,猪皮下脂肪的 脂肪合成相关酶(FAS)基因表达显着下降的同时脂肪分解 酶(HSL)基因表达显着提高,而背最长肌的脂肪分解酶 (HSL,LPL)基因表达则显着下降,这一变化规律预示tl0, c12一CLA处理后,就酶的作用而言,猪皮下脂肪的脂肪合成 代谢弱于分解代谢,而肌内脂肪的脂肪合成代谢则强于分 解代谢. 2.2tl0.c12一CLA对皮下脂肪和背最长肌组织脂类代谢 关键调控激素的影响机体对代谢途径反应速度的调节控 制能力称为物质代谢调节(metabolicregulation),生物的进 化程度越高,代谢调节越复杂,越精细.物质代谢调节包括 细胞水平,激素水平和整体水平3种调节方式].上一小节 关于酶基因表达即属于细胞水平调节,这--d,节对激素水 平进行了研究.与脂肪代谢有关的激素,包括很多种,生长 激素和胰岛素是其中重要的2种,生长激素(GH)有促进脂 肪分解,抑制脂肪合成的作用;而胰岛素(INS)则有促进生 脂,抑制解脂的作用.GH和INS发挥生理作用的第一步是 与靶细胞膜表面的受体(GHR,INSR)结合,由受体介导将信 号传人胞内从而发挥其生物学功能[6-7].所以说受体的表达 和活性最终反映了相应激素的调节能力,因此该研究对2 种激素受体GHR和INSR进行了mRNA水平的测定.图2 为荧光定量PCR测定GHR和INSR的分析结果.结果表 明,100Ixmol/Ltl0,C12一CLA显着抑制了猪皮下脂肪INSR 基因表达,并提高了猪背最长肌INSR基因表达水平(P< 0.05).而2个部位GHR基因表达的处理组与对照组无显 着性差异(P>0.05).该结果也说明100Ixmol/Ltl0,c12一CLA 通过调节猪皮下脂肪和背最长肌组织内INSR水平进而影 响2个部位的脂肪代谢. 2.3tl0.c12一CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织TG合 成的影响(见图3)前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞 对照皮下GHR肌内GHR皮下INSR肌内INSR 图2GHR和INSR的相对基因表达水平 后,伴随分化所发生的分子事件的最终结果都表现为细胞 内TG含量的变化,为定量检测tlO,C12一CLA对皮下脂肪 和背最长肌组织脂肪沉积的影响,该试验采用TG试剂盒测 定TG含量.结果表明(见图3).100~mol/Ltl0.C12一CLA显 着降低了猪皮下脂肪内TG含量,而提高了猪背最长肌的 TG含量(P<0.05).充分说明tl0,c12一CLA抑制了猪皮下脂 肪沉积的同时提高了肌内脂肪含量.TG的变化规律也与前 面脂肪代谢酶与激素所表明的2个部位脂肪合成与分解代 谢规律相一致. 肌内CLA组肌内对照皮下CLA组皮下对照 图3tlO.c12一CLA对TG含量的影响 2.4总体讨论关于CLA对脂肪组织脂质代谢和沉积的 影响,Evans等的研究结果表明.tlO,c12一CLA可减少细胞 中甘油三酯含量l8.Lin等发现,tl0,c12一CLA显着降低了 3T3一L1前脂肪细胞中LPL,FAS和AP2基因mRNA的水 平.有关CLA抑制脂肪细胞分化,减少甘油三酯沉积的机 理,在鼠上及3T3一L1前脂肪细胞系上的研究表明,tl0, c12一CLA对脂肪细胞分化以及甘油三酯沉积的抑制主要是 由于该单体对前脂肪细胞增殖的抑制以及提高了细胞中脂 类的分解],而tl0,c12一CLA对人脂肪细胞分化和甘油三 酯沉积的抑制则主要是通过抑制前脂肪细胞分化过程来实 现….在猪脂肪体外培养试验中,有关CLA调控作用的报 道也不一致[3,13-15},但正效应报道表明,一方面,CLA可以 通过抑制猪前脂肪细胞的增殖,分化以及脂类合成的关键 酶基因的表达来减少脂肪的沉积;另一方面,CLA通过与 脂肪酸氧化分解相关的酶.如脂酰辅酶A合成酶,脂酰 辅酶A脱氢酶等结合,增强脂肪酸的氧化,从而减少甘油三 酯合成. 结合前面的研究结果,可以这样认为:tl0,c12一CLA显 着抑制和促进猪皮下和背最长肌前脂肪细胞分化和脂类 沉积中的关键基因如FAS,INSR,LPL,HSL等的基因表达, 从而抑制和促进了前脂肪细胞的分化最终影响其甘油三 酯沉积 3小结 该试验中.100i~moL/Ltl0.c12一CLA(10d处理)显着抑制 了猪皮下脂肪FAS,1NSR与背最长肌HSL和LPL的基因表 达并降低了皮下脂肪的TG含量,同时显着促进了猪皮下脂肪 HSL和背最长肌INSR的基因表达并提高了猪背最长肌的TG 含量(P<0.05);该研究结果从脂肪代谢关键酶类及调控激 素角度揭示了tl0,c12一CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织 脂肪代谢和沉积的差异性调控机制,进一步证实了tl0, c12一CLA抑制猪皮下脂肪沉积同时提高肌内脂肪含量. 3210 一广IHS._【Ili一姻如0 ?如?;2 22l111O0O0 唧函醐葭 136畜牧与饲料科学第32卷 参考文献: [1]PARIZAMw,PARKY,COOKME.Thebiologicallyactive isomersofconjugatedlinoleicacid[J].ProgLipidRes, 2001,40:283—298. 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(责任编辑:慕宗杰) ? ;稿件要求:稿件必须包括以下项目:名(一般不超过20个关键词为该文主要研究对象的事物名称,第5个及以后的; 字),作者姓名,作者单位(包括地址和邮编),中文摘要,关键关键词为作者认为有利于检索和文献利用的其他名词.(3) ),中图分类号,英文题名,作者英文姓名(汉语拼写好论文的引言.引言是堇词(4-8个 论文内容的重要提示,作者在引言i ;音),作者英文单位,英文摘要(与中文摘要对应),英文关键词中应概述前人在该领域内所做的工作,并陈述论文在此基础 (与中文关键词对应),1言,正文,结语,参考文献.另请附第一上所取得的成果和突破.(4)正文中的图(务必清晰,精确), 作者简介,包括姓名,出生年,性别,职称(是博导,院士的请标表按出现的先后顺序进行编号,图名,坐标图的横,纵坐标; 明),学历(是博士后的请标明),研究方向及作者的详细联系必须标明其对应的量及单位(量纲为1的除外).(5)论文中 地址和其他联系方式(包括电话,手机,电子信箱).如果论文涉及到量的单位,务必使用国际标准单位,避免用同一个符号 系省部级以上基金或攻关项目产生的论文,亦请在论文首页表示不同的量,凡是含有变量的符号(包括表示量及其上,下角 脚注明并给出项目的编号或批准文号.文稿采用word格式,标的符号)一律用斜体,反之,用正体.(6)文后参考文献的着录 在电子邮件中须用附件形式发送.其他具体要求如下:项目一定要全,相关格式参见《中国学术期刊(光盘版)检索与 ;(1)摘要应写成报道式摘要,按照摘要四要素(目的,方评价数据规范》.参考文献按在正文中出现的先后顺序进行 法,结果,结论)来撰写,直接切入主题(不要论及论文研究的编号.中文及其他非英 文参考文献要有对应的英文表述. 基础和背景知识,不要进行自我评价),且中文摘要字数要达稿件处理:本刊收到稿件后将在7个工作日内回复.本刊 i到200-300字.(2)关键词的选择应规范.第1个关键词为该论文发表周期为1~2个月,并优先刊登有关国家科技攻关,自然 文所属相应栏目名称,第2个关键词为该文研究成果名称,科学基金以及各部委和各省,市,自治区政府,科研院所科技基 ? 第3个关键词为得到该文研究成果所采用的方法名称,第4金资助项目的论文.不得一稿多投,来稿文责自负. 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