脱氧雪腐镰刀菌烯醇与溶菌酶相互作用的研究

脱氧雪腐镰刀菌烯醇与溶菌酶相互作用的研究 脱氧雪腐镰刀菌烯醇与溶菌酶相互作用的 研究 第27卷,第3期 2O10年5月 光谱实验室 ChineseJournalofSpectroscopyLaboratory VO1.27.NO.3 May,2O10 脱氧雪腐镰刀菌烯醇与溶菌酶相互作用的研究? 李晓梅李玉琴侯海峰冀海伟.李群伟? (泰山医学院流行病研究所山东省泰安市长城路中段271000) n(泰山医学院药学院山东省泰安市271016) 摘要利用荧光猝灭,紫外光谱(uV),傅里叶变换红外光谱(FTIR)和圆二色性光谱(cD)法测定反 应的结合常数,主要作用力以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇对溶菌酶二级结构的影响;并综合实验所得的热力学 参数结果,确定二者间的作用力.脱氧雪腐镰刀菌烯醇与溶菌酶有较强的结合,脱氧雪腐镰刀菌烯醇对溶 菌酶的荧光猝灭以氢键和范德华力为主,结合位置与色氨酸残基间的距离r为4.62nm.通过光谱法研究 模拟生理条件下真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇与溶菌酶的相互作用,为脱氧雪腐镰刀菌烯醇在体内的储 存,运输及毒性机制提供一些具有指导作用的信息. 关键词脱氧雪腐镰刀菌烯醇;溶菌酶;相互作用 中图分类号:0657.32;0657.33文献标识码:A文章编号:1004—8138(2010)03—0809—06 1引言 溶菌酶是一种广泛分布于生物体内的小分子碱性蛋白,长期以来一直被作为一种模型体系, 用于研究蛋白的空间构象,酶动力学以及分子进化与分子免疫间的关系.同时它也是生物体内不 可或缺的重要的非特异性体液免疫因子,能够和很多的外源和内源性物质结合,从而行使抗菌消 炎,抗病毒等诸多的生物功能n]. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)主要是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生,广泛存在于全球,主要 污染小麦,大麦,玉米等谷类作物,是一种有很强细胞毒性,胚胎毒性,一定致畸性,弱致癌性,并且 影响免疫系统的真菌毒素,人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应[2]. 本文首次用多种分析技术研究了模拟生理条件(pH7.40,离子强度0.1)下DON与溶菌酶 (LYSO)的相互作用信息.利用DON对LYSO内在荧光的猝灭,根据修正的Stern—Volmer和 Seathard方程分别求出了反应的猝灭常数和结合常数;由Foerster能量转移理论确定了DON在 LYSO中的结合位置与色氨酸残基间的距离,并根据热力学参数确定了它们之间的主要作用力类 型;同时结合FTIR和CD技术讨论了DON对IYSO二级结构的影响.上述研究结果不仅揭示了 DON与LYSO的作用方式,而且为进一步研究DON的毒性效应提供了理论依据. ?山东省自然科学基金(Y2008C59);山东省教育厅基金(J07D06) ?联系人,电话:(O538)6229839;E—mail:qwli@tsmc.edu.cn 作者简介:李晓梅(1977一),女,山东省威海市人,讲师,硕士,主要从事流行病学研究工作. 收稿日期;2009—09—14;接受日期:2009—10—26 光谱实验室第27卷 2实验部分 2.1仪器与试剂 RF一5301PC型荧光光度计(日本岛津公司);UV一2450PC紫外可见分光光度计(日本岛津公 司);Nexus670傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司),衰减全反射附件(ATR),DTGS检测 器,OMNIC52数据处理Jasco一20c圆二色谱(日本岛津公司),SiliconGraphicsOcatane2工作站. DON购于美国Sigma—Alorich公司,储备液(1.0×10mol?L_1)用二次蒸馏水配制;溶菌酶 (Lysozyme,IYsO)购于德国Merck公司,用pH7.40Tris—HCI缓冲溶液配制浓度为1.5×10 mol?L的储备液,保存于4?的暗处.实验用水为二次蒸馏水,其他试剂均为分析纯. 2.2实验方法 荧光光谱测定:分别移取1.0mL1.0tool?LI1的NaC1溶液,2.0mILYSO溶液和0,30L DON溶液于10ml比色管中,以pH7.4O的Tris—HCI缓冲溶液定容.以265nm为激发波长(k), 扫描300--500nm范围的荧光光谱(1cm石英池,狭缝宽5nm). 荧光滴定实验:移取0.3mL的NaC1溶液,0.6mL的LYSO储备液和2.1mL的Tris—HC1缓冲 溶液(pH7.40)于lcm石英池中(三者体积总和为3.OmL),以微量注射器逐次(共7次)加入lOlL 的DON储备液(累积体积<lOOgI),反应时间为5min.以265nm为激发波长,340nm为发射波长, 测定不同温度下体系的荧光强度,所得实验数据用于结合常数等的计算. 同步荧光测定:以230nm为激发波长,290nm(?一60nm)为发射波长,扫描加入不同体积 DON后体系的同步荧光. 紫外吸收光谱:分别移取1.0mL1.0mol?I-1的NaC1溶液,2.0mILYSO溶液和0,10,2O, 3O,40,50IDON溶液于10mI比色管中,以pH7.4O的Tris—HC1缓冲溶液定容.用UV一2450PC 紫外可见光谱仪记录,狭缝为5nm,扫描200--400nm范围内的紫外吸收光谱(1cm比色皿). 红外光谱:4cm-1分辨率下,扫描2048次收集水汽光谱,使用0MNIC52数据处理软件自动进 行水汽校正;室温敞开状态收集背景,然后将样品均匀地铺满ATR的ZnSe晶片,同样分辨率下, 扫描6O次收集样品光谱. 光谱处理程序:在同样条件下收集DON和LYSO作用后的红外光谱及含有同样药物浓度的 缓冲体系的红外谱图.从前者谱图中减去后者的吸收,得到蛋白和D0N作用后血清白蛋白的红外 光谱,以谱图在1800--2200cm叫呈一条平滑直线为差减终点判据. 圆二色性光谱(CD)测定:在10mI比色管中依次加人1.0mLNaC1溶液,一定体积的蛋白溶液 和DON溶液,以Tris—HC1缓冲溶液(pH7.40)定容.使用1ram石英池,于室温下测定200--350nm 波长范围内I.YSO与DON混合前后的CD光谱. 3结果与讨论 3.1DON与LYSO相互作用的荧光光谱及猝灭机理 蛋白质的荧光特性主要取决于结构中的色氨酸(Trp),酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe),它们的 荧光强度比通常为lOO:9:0.5.因此大多数情况下可以认为蛋白质的荧光主要来自Trp残基的 贡献.从图1中可看出,随着DON浓度的增加,荧光强度渐渐减小,并可以观察到微弱的从340nm 到338nm的蓝移现象,表明DON的加入降低了蛋白质分子微环境的极性,从而猝灭了LYSO内 Trp残基的荧光. 图2为DON—LYSO体系的紫外吸收光谱图,随着DON浓度的增大,体系的吸收强度逐渐增 第3期李晓梅等:脱氧雪腐镰刀菌烯醇与溶菌酶相互作用的研究 大,这可能是由于DON结构中存在给电子基团一OH和一.一,可诱导摩尔吸收率增大引,导致体 系的吸收光谱发生了变化.由以上两点得到的结果可以确定DON对LYSO的荧光猝灭机理为静 态猝灭. 慰 ? 波长,Unm 图1DON—LYSO的荧光光谱图 蘧 波~A/nm 图2DON—LYSO体系的紫外光谱图 a--i:(VlYON:VLYSO):0;60,10:60,2O:60?30:60,口—— ,:(CDoNlCLVSO):030'10030?2030'303O' 40{60,50:60,60:60,70:60,30:0.40l30. 荧光猝灭的机制主要有3种:静态猝灭,动态猝灭,非辐射能量转移.无论是静态猝灭还是动态 猝灭,荧光分子与猝灭剂之间的猝灭效率都遵循方程: F./F=1+K[Q](1) 式中:F.与F——分别为猝灭剂加入前和加入后的荧光强度;[Q]——猝灭剂浓度;K—— Stern—Volmer猝灭常数.为了进一步研究DON对LYSO的猝灭机理,分别在303,310,318K3个温 度下,进行荧光滴定,根据方程(1)线性拟合计算,结果见表1.由表1可知,在选定的浓度范围内, 随着温度升高,这些Stern—Volmer图都有着良好的线性关系,且猝灭常数呈降低趋势,初步表明 DON对LYSO的荧光猝灭机理为静态猝灭. 表1不同温度下DON与LYSO相互作用的结合常数,结合位点数 3.2结合常数及结合位点数的计算 在研究蛋白质与药物分子相互作用时,假设生物大分子有一类相互独立的结合位 ,z个独 点,有 立的结合位点数,且荧光体的荧光强度与其游离浓度成正比,在此基础上猝灭数据也可以用修正的 Scatchard方程来计算]: lg(F.一F)/F—lgK+lg[Q](2) 式中:与F——分别为不存在与存在猝灭剂时的荧光强度;[Q]——猝灭剂浓度;K——结合常 数.分别在303,310和318K3个温度下,进行荧光滴定,根据方程(2)线性拟合测定和结合位点 数,结果见表1.由表1可知,DON—LYSO的结合常数较大,而且温度对结合常数的影响较小,说 明DON与LYSO有强的结合. 3.3结合距离的计算 根据Foerster能量转移理论,可以求出DON在蛋白质上的结合位置与蛋白质分子中产生荧光 光谱实验室第z7卷 的基团之间的距离].当荧光体与药物分子的光谱特性符合非辐射能量转移条件时,它们之间遵从 方程: E=1一F/F.=尺3/(R3+r.)(3) 式中:E——能量转移效率;R.——转移效率为5O时的临界距离;r——荧光体与猝 灭体之间的真 实距离;F和F0——分别为存在和不存在能量受体时,能量给体的荧光发射强度. R3—8.8×10一.K一'J(4) 式中:K——偶极空间取向因子;——介 质的折射指数;——荧光给体的荧光量子 产率;——给体的荧光发射光谱与受体的 吸收光谱之间的光谱重迭积分: 一 ?F()e(a)24Aa/?F(,t)A2(5)璧 式中:F()——荧光给体在波长为时的荧 光强度;e()——受体在波长时的摩尔消 光系数. 图3是DON—IYSO的荧光和UV光 谱重叠图.将图中的光谱重叠部分分割成 副 极小矩形面积求积分得到积分面积为图3LYSO的荧光(F)和DON的紫外)光谱重叠图 7.6142×10叫'cm.?L?tool_..色氨酸的量[Don]:1.5×10—6mo1.L-l;[LYSO3=1.5XIO 一6mol?L-1}F一 子产率为0.118,折射指数取水和有机物LYSO荧光;A—DON的uV. 的平均值1.336,取向因子取给体和受体各向随机分布的平均值K.=2/3,将以上各量代人公式 (4)中,计算得DON—LYSO体系临界距离R0为3.52rim,由公式(3)求出LYSO中色氨酸残基与已 结合的药物分子间的距离r为4.62nm,符合能量转移理论,说明在DON与LYSO之间均发生了 能量转移. 3.4键合模式的确定 不同药物与蛋白质结合的作用力类型不同,根据反应 的热力学参数可大致确定作用力类型.采用荧光光谱技术 测定不同温度下的结合常数(见表1).当反应的温度变化 不太大时,反应的焓变AH和K遵循Van'tHoff定律: INK=-一?H./R丁+?/R(6) 式中:K——对应温度下的结合常数;R——气体常数.由 lnK对lIT作图,由斜率与截距分别可以计算出焓变 ?H.,熵变?.,再由AGO一?H.一T,SS.计算出反应的自由300游o0nm.. 能变化?G.结果列于表2,将表中的数据由lnK对1/T作图4DON.LYSO体系的 图,求得药物与蛋白质相互作用的热力学常数.Nemethy同步荧光光谱图(?=60nm) 与Scheraga等根据热力学常数的符号与大小确定了作用 a--h(VDON:VLYSO):0:60,10t60,2O:60? 力的类型.在DON与LYSO的相互作用中,?H和?S....?..,.'.,...'.... 均为负值,所以其主要作用力为氢键和范德华力. OOO??加 越噬 第3期李晓梅等:脱氧雪腐镰刀菌烯醇与溶菌酶相互作用的研究813 3.5判定药物影响蛋白质二级结构的定性依据和定量依据 利用同步荧光可以了解小分子对蛋白质构象的影响.Brustein等认为色氨酸的最大荧光发 射峰位对环境很敏感,所处通常以色氨酸残基的同步荧光光谱,作为定性判断蛋白质构象变化的依 据.图4为DON—IYSO的同步荧光光谱图(?=60nm),从图中可看出,随着药物浓度的增大, DON猝灭了色氨酸残基的荧光,但是其最大荧光发射峰并未出现明显的位移. 图6为加入DON前后LYSO的红外光谱波数nr. 图.由图中可以看出,DON—LYSO的相互作用图6DON-LYSO体系的红外光谱图(2o.O一13oocm) 使LYSO的酰胺I带由1672cm轻微移动到一SO徊一c.CLSO_1'L 1675cm_.,酰胺?带变化不明显,表明DON与LYSO分子发生了作用,并使蛋白质的二级结构发 生了变化.这可能是由于DON分子与LYSO分子中的C—0与C—N或N—H基团发生了相互 作用,也可能是DON分子与蛋白质分子的多肽链之间形成了氢键. 814光谱实验室第27卷 4结论 本文利用荧光光谱,UV,FTIR和CD谱研究了模拟生理条件下DON与LYSO的相互作用, 计算了反应的结合常数和结合位点数.并综合荧光实验结果,得到了热力学参数,由热力学参数确 定了二者间的作用力主要是氢键和范德华力.本研究在预防医学上有一定的实际意义,可为研究 DON的毒理机制提供理论依据. 参考文献 [1]王佃亮.重组人LYSO研究进展[J].中国生物工程杂志,2003,23(9):59—62. [23霍星华,赵宝玉,万学攀等.脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性研究进展[J].毒理学杂志,2008,22(2);l51一l55. [33MallickA,MaityS,HaldarBel0.1.Photophysicsof3-Acetyl一4一Oxo一6.7-Dihydro-12Hindolo-[2,3-a]QuinolozinelEmissionfrom TwoStates[J].Chem.Phys.Lett..2003,371(5):688—693. [4]陈国珍,黄贤智,许金钩等.荧光分析法[M].第2版.北京;科学出版社,1990.123—129. 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ResearchonInteractionofDeOxyniValenOlwithLysozyme LIXiao—MeiLIYu—Qin.HouHai—FengJxHai—Wei.LIQun-Wei (Epidemiologyjn5mme,TaishanMedicineCollege,Taian.Shandong271000.P.R.China) a(CollegeofPharmacy,TaishanMedicineCollege,71口n,Shandong271016,P.R.Chma) AbstractFluorescencequenchingmethods,UV,FTIRandCDtechniquewereusedto determinethebindingconstants,drug— bindingmodes,andproteinstructurechangesinthepresenceof deoxynivaleno1.ThedeoxynivalenolboundtoLYSOwithhigherbinding,andthequenchingreactions werethehydrogenbondandvanderWaals'forces,andthedistancebetweendeoxynivalenoland UYS9"was4.62nm.Thestudywasdesignedtoexaminetheinteractionbetweendeoxynivalenoland LOundersimulatedphysiologicalconditions,providingsomedirectinginformationforthestorage, transporation,andtoxicitymechanismofthedeoxynivalenolinvivo. KeywordsDeoxynivalenol;Lysozyme;Interaction