森林冬虫草：水溶性虫草多糖研究.

森林冬虫草：水溶性虫草多糖研究. 森林冬虫草:水溶性虫草多糖研究 虫草多糖由于其抗肿瘤作用、抗辐射作用和免疫调节作用,对人和动物无毒无害,对治疗肿瘤和感染所引起的免疫抑制有巨大的价值贡献。但迄今为止,所发现的虫草多糖多为胞内多糖,即是胞外多糖也是水不溶性的,增大了人体吸收的难度。因此,寻找生产免疫活性的水溶性胞外多糖的虫草新种,探讨生产虫草多糖和菌丝体的最佳条件就显得非常迫切和需要。本文对川藏森林冬虫草所含虫草多糖，CDP，的免疫调节作用,组成及液体培养条件进行了研究。 研究结果明:森林冬虫草所含虫草多糖CDP为水溶性胞外多糖,不像其它人巟培植虫草虫草胞外多糖不溶于水而致人体难以吸收。草原冬虫草含有两种虫草胞内多糖CT-4N和CS-1,其产率为别为0.08%和0.77%。而森林冬虫草的水溶性虫草多糖CDP粗糖产量为16.75g/l,纯多糖产量也较高可达13.5g/l,明显高于上述几种多糖。实验中还论证了森林冬虫草所含虫草多糖CDP的具有免疫作用。 首次发现森林冬虫草含有在虫草中稀见的脂溶性抗生素。因此脂溶性抗生素和CDP可望得到综合利用。 森林冬虫草的服用安全性也得到论证。 下面为实验过程和: 【1】材料和方法 1.1菌种提取自川藏森林野生冬虫草。 1.2 培养基 1.2.1沙氏培养液，Sabouraud‘s Broth，:葡萄糖40g,蛋白胨10g,水1000ml。 1.2.2马铃薯葡萄糖培养液，PDA，:取去皮马铃薯200g,切成小块,加水1L,煮30分钟,纱布过滤,滤液中加葡萄糖20g,最终体积至1000ml。 1.2.3察氏培养液，CZ，:蔗糖30g,NaNO33g,K2HPO41g,MgSO4.7 H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO40.01g,蒸馏水1000ml。 1.2.4AM培养液:可溶性淀粉20g,葡萄糖20g,棉子粉4g,蛋白胨4g,土豆粉4g,MgSO4.7 H2O0.4g,CaCO34g,蒸馏水1000ml,pH6.0。 1.2.5黄豆粉葡萄糖培养液，SGM，:葡萄糖30g,黄豆粉5g,酵母膏2g,K2HPO41g,MgSO4.7 H2O0.5g,蒸馏水1000ml。 1.2.6完全培养液，CM，:葡萄糖40g,蛋白胨10g,酵母膏5g,蒸馏水1000ml。 1.3方法 1.3.1淋巴细胞转化实验:参阅林学颜，1980，方法。 1.3.2菌丝产量测定:按俞大绂等，1985，方法。 1.3.3多糖的提取:参阅李兆兰，1987，方法。 1.3.4粗多糖重量的测定:取烘干恒重的粗多糖粉末放在电光分析天平上称重。 1.3.5粗多糖纯度的测定:采用蒽酮—硫酸法。具体操作参阅张惟杰，1987，的方法。 1.3.6纸层析:用新华1滤纸，24×10cm，,乙酸乙酯-吡啶-水，10:4:3，为展开剂，吴梧桐等,1984，。显色剂为苯胺-磷酸试剂,4g二苯胺,4ml苯胺及20ml85%磷酸溶于20ml丙酮，张惟杰1987，标注品不样品含量均为10mg/ml巠右。 1.3.7培养方法 静置培养:25?恒温培养24天。200ml三角瓶100ml培养液,接种量5ml。100ml三角瓶装20ml培养液,接种量0.5ml。 振荡培养:24~26?,振床转速100~110r/min200ml三角瓶装去100ml,接种量5ml,4个重复。不多糖有关的实验中,7~8个重复,多糖是7~8瓶所含的多糖之和,折合成每升培养液所产生多糖的量。生物量取4个最接近的数值平均值。 数据处理:仪器为CASIOfx-3600p函数计算器。采用LSR法。 【2】实验结果 2.1森林冬虫草水溶性胞外多糖，CDP，对淋巴细胞转化的影响 本试验所用森林冬虫草水溶性胞外多糖，CDP，粗品用SGM培养液生产,纯度为80%。CDP转化率比对照增加16.2倍,说明CDP有促进淋巴细胞转化作用,但不PHA合用无协同作用。该种情况在用银耳子实体多糖，TF，所做的淋巴细胞转化实验中也出现,说明不是偶然现象。 2.2森林冬虫草水溶性胞外多糖，CDP，的分离纯化及组成单糖的鉴定。 取森林冬虫草水溶性胞外多糖，CDP，粗品干粉3g,溶于30ml热水中,离心除去不溶物,用Sevag方法除蛋白,干燥备用。取0.1g脱蛋白多糖,经Sephadex G-200柱，2×60cm，分离,洗脱液为0.1M NaCl,流速为0.25ml/min,分管收集,每管3ml,蒽酮法检测。洗脱曲线见图1,由此图可知仅有一个峰,说明CDP只有一个组分,利用分子排阻法推测其分子量200,000巠右。 合并含糖量高的洗脱液25ml透析至无Cl-为止,然后用PEG6000浓缩至1ml,加入5ml2N硫酸,封安瓿80?水解24小时,取出用BaCO3中和,过滤除去BaSO 4沉淀,即得多糖的水解产物。点样进行纸层析,结果见图2。从巠至右以此为山梨糖、鼠李糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、CDP水解液,其Rf值分别为0.29、0.54、0.41、0.2、0.23、0.23,说明CDP水解产物为葡萄糖组成,CDP为一种葡萄聚糖分子。 2.3温度对森林冬虫草菌种生长的影响 不同温度对虫草菌丝产量的影响很大。森林虫草菌株生长的最是温度范围为25~29?。当温度上升到37?时,未测出菌丝干重,经镜检分生孢子没萌发,此温度为菌丝生长的极限温度。 2.4培养基对虫草的菌丝产量和胞外多糖产量的影响 不同培养基处理对菌丝产量和胞外多糖产量影响很大。由图5可知,菌丝产量最高的培养基为SGM,达到1.24/100ml。其次为CM,是最高产量的80%,AM和Sab相差不大,产量最低的为PDA和CZ培养基。 由图6可知,多糖产量最高的培养基也是SGM,纯多糖产量可达13.54g/l，粗多糖产量为6.75g/l，。其次为CM,只是最高产量的14%,其后以此为AM、Sab、PDA、CZ。CZ几乎不产多糖,只有0.03g/l是最高产量的0.2%。由此可见,最有利菌丝和多糖生产的培养基为SGM。 【3】分析和讨论 淋巴细胞转换试验表明CDP有促进淋巴细胞转换作用,说明CDP具有免疫调节作用。而且CDP为水溶性胞外多糖,不像其它虫草胞外多糖不溶于水而增加了人体吸收的难度。草原冬虫草含有两种虫草胞内多糖CT-4N(Kino,et al,1986)和CS-1(Miyazaki,et al,1977),其产率为别为0.08%和0.77%,即是研究较多的裂褶菌多糖,胞外粗多糖产量只 有5.37g/l,纯多糖产量只有2.15g/l(李兆兰,1987)。而森林冬虫草的水溶性虫草多糖CDP 粗糖产量为16.75g/l,纯多糖产量也较高可达13.5g/l,明显高于上述几种多糖。菌丝产量 也较高达到1.24g/100ml。 此外,森林冬虫草含有首次在虫草无性型中所发现的脂溶性抗生素。因此脂溶性抗生素 和CDP可望得到综合利用。 森林冬虫草菌种在37?时分生孢子不能萌发,菌丝不能生长。人的正常体温为 36.5~37.5?,各种家畜、家禽的温度更高,森林冬虫草菌种不可能在此温度下生长。因此, 森林冬虫草服用对人、家畜、家禽是安全的。 参考文献 1、焦彦朝等。虫草生物活性物质研究概况。贵州农业科学,1990,，3，:53~58 2、李兆兰。裂褶菌深层培养及多糖测定。真菌学报,1987,6，3，170~177 3、梁宗琦,刘爱英等。虫草一新种及其绿僵菌无性型。真菌学报,1991,10，3，:172~180 4、林学颜编,免疫学基础。福州,福建科技出版社,1980:184~187 5、吴梧桐等。银耳孢子多糖TF-A、TF-B、TF-C的分离、纯化及组成单糖的鉴定。生 物物理不生物化学学报,1984,16，4，:393~398 6、俞大绂,李季伦编。微生物学，第二版，。北京:科学出版社,1985:682~690 7、张惟杰主编。复合多糖生化研究技术。上海:上海科技出版社,1987:1~21 8、Kino T et al. A minor protein-containing galactomannan from a sodium carbonate extract of Cordyceps sinensis, Carbonhydr Res,1986,155:189~197 9、Miyazaki J et al .studies on fungal polysaccharides.X X Galactomann of Cordyceps sinensis Chem pharm Bull,1977,25(12):3324~3328 10、Toshihiro O et al. Structure of a galactosaminoglycan from C , ophioglossoides. Carbonbydr Res,1984,134(2):275~282? 11、Yamada H et al. Structure and antitumor activity of an ajki-soluble polysaccharide from C. ophioglossoides. Carbonbydr Res,1984,125(1):107~116 书中横卧着整个过去的灵魂——卡莱尔 人的影响短暂而微弱，书的影响则广泛而深远——普希金 人离开了书，如同离开空气一样不能生活——科洛廖夫 书不仅是生活，而且是现在、过去和未来文化生活的源泉 ——库法耶夫 书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者———史美尔斯 书籍便是这种改造灵魂的工具。人类所需要的，是富有启发性的养料。而阅读，则正是这种养料———雨果