乌贼墨对H22癌细胞内Ca^2＋,ATP浓义及线粒体Ca^2＋／Mg^2＋—ATP酶？…

乌贼墨对H22癌细胞内Ca^2＋,ATP浓义及线粒体Ca^2＋／Mg^2＋—ATP酶？… 乌贼墨对H22癌细胞内Ca ，,ATP浓义及 线粒体Ca ，,Mg ，—ATP酶,… ;一t 《中国海洋药物》杂志1999年第3期(总第7l期) 乌贼墨对H22癌细胞内Ca,ATP浓度及线粒体 Ca2/Mg2一ATP酶活性的影响 三尊一跫童谢克新张民苏小游 f山东医科大学山东省毒理学t点实验童,济南250012 |{. 『i79 摘要利用荧光探许和荧光紊,研究了鸟喊墨对2癌细胞内Ca2,ATP浓度厦线粒体c/M.ATP醇活 性的形响.结果发现,鸟喊墨使H22癌细胞内c日2浓度降低了2.3和3.7倍.绒粗体c/Mg2.ATP醇活性降 低了28%和58%,ATP浓度升高了77%和83%.结果提示鸟贼墨可能通过降低细胞内c浓度,蛙而形响到 线粗体上.依柏性c/M?.ATP酶活性.减少了c?向践粗催内曲转运,减轻喜至消除了c对ATP 制 CaAT 这 PAT 押 P 悫谚旺钙未j.卉:铆关键词?,,ca2/M?.醇,垒巍墨.叫22l二,j趸j.,t,: THEEFFECToFSEPIAoNINTRACEI,I,ULARCa,ATPCoN. CENTRATIoNAND??ToCH0ND舡ALCa/Ma.ATPaseACT?. ???SH2,CANCERCELLS WangChengbin,SunKeren,XieKeqin,elal (Depart.ofToxicology,Sham~ongMedicalUniversity..~nan25001.2) ABSTRACTTheeffectsofSemiaoi2theiiltraeellularCa2,ATPcolicentrationsandmitochoildrial Ca/M?ATPaseactivitieswerestudiedinH?cancercellsbyusingfluorescentprobeandlucfferin Theresultsshowedthat[Ca]idecMased2.3and3.7times,mitoch0ndrialca2/M.ATPaseactivi— tiesdiminished28%and58%,lATP]irose77%and83%.respectively.Theresultssuggestedthat Sepiaprobablydimiilished[ca2]i,affectedmitoehoildrialca2.dependentca2/Mg2一ATPaseactivi. ties,thusreducedtheamouiltofCa2transposedintomitoehondrla.lessenedeveileliminatedthein. hibitoryeffectofCaonATPsynthesis.Thisperhapswasoile0fthepossibleanti?cKncermechanismsof Sepia. KEYWORDSCa”,ATP,ca2/MATPase,Sepia 自70年代以来,人们发现乌贼墨能抑制 肿瘤生长.近年来对乌贼墨抗癌功能的研究 逐步深入.现已发现乌贼墨可提高免疫功 能,诱生细胞毒性因子和肿瘤坏死因子,杀伤 癌细胞【.乌贼墨还能缩短凝血时间,增 强纤溶酶恬性.有促凝血作用等J.为了进 一 步研究乌贼墨抗癌的机理,我们利用Fura 2/AM荧光探针,荧光素荧光素酶标记及生 化方法,测定了Hn癌细胞内Ca2浓度,线粒 体ca2/M一ATP酶活性及ATP吉量的变 ?卫生部科研基金资助项目:(蝙号:94—2.135) 化,以探讨乌贼墨抑制肿瘤生长的可能机制. l与方法 1,1材料乌贼墨:乌贼是采于烟台沿海的 枪乌贼,由中科院海洋所鉴定,取新鲜的墨囊 于一3O?保存后研末,称重,配成需要体积. 纯系昆明小鼠,体重l8—22g,由山东医科大 学实验动物中心提供;2癌细胞由山东省医 学科学院药物所提供;Fura-2/AM荧光探针 购于Sigma公司;荧光素荧光素酶购于中科 12《中国海洋药物》杂志1999年第3期(总第71期) 院上海植物生理研究所;ATP购于Sigma公 司. 1.2H22癌细胞内ca2浓度的测定l纯系 昆明小鼠腹腔接种H癌细胞悬液0.2TI1l(2.5 X10oells/m]),8d后,抽取腹水,用冰Hank?日 氏液洗二次,Eagle液(吉1O%小牛血清)制备 成2×10cells/ml的细胞悬液,取3ml细胞悬 液加入Fura-2/AM荧光探针,37?恒温振荡 45mln,细胞息液中依次加入乌贼墨0,2.5,5. 0rag,37?水浴预温3min,日立850型荧光分 光光度计,激发波长350nm,发射波长450nm, 测定荧光强度,根据公式计算细胞内辩离钙 离子浓度:[c?]i:Kd(F-F…)/Fm,F). 1.3H癌细胞内ATP浓度的测定30 只纯系昆明小鼠随机分为3组,每组1O只, 雌雄各半,腹腔接种H癌细胞(方法同1. 2).24h后.I组灌服生理盐水0.2ml/20g体 重,?组灌服乌贼墨25mg/20g体重,?组灌 服乌贼墨50rag/20g体重,连续10d.10d后, 取疆水细胞,将腹水细胞立即用冷PBS(O. 1M,pH=7.2)洗2状,将细胞稀释成 5000cells/ml的细胞悬液,反复冻融,加入荧 光素.荧光索酶,FC.300发光光度计测定发光 强度,以标准ATP制作标准曲线,查标准曲 线计算出相应的ATP浓度.蛋白定量采用 Lo~xy法. 1.42癌钿胞线粒体c/M一ATP酶活 性的测定动物分组及药物剂量同1.3.取 腹水细胞,用冷0.25M蔗糖溶液洗2状,玻璃 匀浆器制成匀浆,1000g离心10rain,取上清, 10000g离心30rain,收集沉淀并低温保存,以 上步骤均于4?下进行l.参照徐友涵等l】 的方法测定酶的活性.蛋白定量用Bradford 法【l 2结果 2.12癌细胞内ca2采度的变化H22癌 细胞内c浓度随给药剂量的增加明显下 降,与对照组相比,分别降低了2.3和3.7 倍,统计学分析差异显着(P<0.01).结果 见1 表1H?癌细胞内c澉度的变化c?5 „P<0.01与对照组(耐量为0)相比较 [Ca?]i:细胞内tl由.60nmol?min,,分别下降到 l9.06?0.53nmolrag一】min一和n.13?0. 74nmolragI1rain,,分别下降了28%和 58%,经统计学检验,有显着性差异(P<0. O1).结果见表3. 表3H癌细胞线粒体c/Mg2一ATP 酶活性的变化{;?】 .?P<001与I组相比较 3讨论 线粒体不仅是细胞内重要的能量生成场 所,而且还是细胞内主要的Ca2储存器.在 《中国海洋药物》杂志1999年第3期(总第71期)13 正常细胞中,约50%的Ca储存在线粒体 中.当细胞内c升高时,线粒体就可以摄 取胞浆中的c,从而降低细胞内c鱼2的浓 度.线粒体摄取钙是通过位于线粒体外膜上 的ca2/Me一ATP酶来完成的_l,是一个耗 能过程.Ca/M一ATP酶摄取钙后,引起 线粒体内外膜问Ca2浓度升高.过多聚积 的Ca2可引起线粒体内膜非特异渗透性增 高.称为”转移通透性”(permeabilitytransitiOn) 现象.ca2大量穿过内膜进人基质,降低了 内膜两侧的电化学梯度,影响了能量的合 成[. 无论在正常还是恶性组织中.Ca2都可 抑制线粒体的氧化磷酸化过程.Ca2主要通 过影响氧化磷酸化过程的两个反应:ATP/ ADP的跨膜转运和.ATP酶/ATP合成酶 的功能,从而影喃ATP的合成.所以,如 果在线粒体所处的溶液中加人大量Ca”,甚 至可中止ATP的合成tJ. ADP在线粒体中有重要作用,它不仅是 生成ATP的底物,而且在ATP从线粒体向外 转运的过程中发挥作用.线粒体跨膜ADP/ ATP转运,是通过镶嵌在内膜上的一些高度 特异的运输蛋白来完成的,转运进一分子 ADP,才能转运出一分子ATP.因此,只有当 细胞浆中有可利用的ADP,即ATP消耗后. 线粒体才能够通过ADP/ATP转运系统.将 ATP运输出来,然后输送到细胞的各个部位. 只有当ADP进人线粒体基质后.线粒体 的F1复合物才能利用ADP合成ATP.当 Ca阻碍了ADP/ATP的转运后,ADP不能进 人基质,ATP合成酶因缺乏底物而无法进行 能量合成【12,而且合成的ATP也无法转 运出线粒体而不能发挥生理作用. 现已发现,Fl-ATP酶/ATP合成酶的功 能主要受Pullman—Monroy抑制亚单位调节. Pullman-Monroy抑制亚单位不仅是线粒体 ATP酶的抑制子,而且对ATP的合成速度也 有调节作用.用甲苯使ADP/ATP转移酶失 活,消除ADP/ATP转运对A合成的影喃 后,发现Ca”对复合物有很强的抑制作 用【J,提示Ca可能通过调节PullmanMon. roy抑制亚单位的功能而影响ATP的合成. 抑制亚单位在一些特定情况下,与线粒体膜 结合而无抑制作用,但其活性可被mmol浓度 的ca2激活【t2].Ca不仅可促进Pullman. Monmy抑制亚单位与F1F0复合物结合,而且 启动抑制亚单位发挥作用,抑制ATP的生 成[. 线粒体摄取Ca是通过线粒体膜上的 ca依赖性ca2/Me.ATP酶来完成的, 需要消耗ATP,因此是一个耗能的过程.乌 贼墨显着降低了H22癌细胞内ca2浓度,引 起线粒体上的ca2依赖性ca2/Me.ATP 酶活性降低,从而使转运到线粒体内的ca? 减少,减轻了Ca对ATP合成的抑制;而且, 由于线粒体ca2/M异2一ATP酶活性降低,转 运ca2所消耗的ATP也减少.二者相互作 用,提高了细胞内ATP的浓度. 我们通过测定H,,癌细胞内ca2,ATP 浓度及线粒体ca2/M异2.ATP酶活性,发现 乌贼墨可显着降低H22癌细胞内ca2浓度和 线粒体Ca/M一ATP酶活性,明显升高细 胞内ATP的浓度,提示乌贼墨可能通过降低 H22癌细胞内ca2浓度,引起线粒体ca2依 赖性ca2/M.ATP酶活性降低,减少了 ATP的消耗,而且导致向线粒体内转运的 ca2减少,减轻甚至消除了F.F0复合体的抑 制,促进了ATP的生成,提高了细胞内ATP 浓度.这可能是乌贼墨抑制肿瘤生长的机制 之一. 参考文献 1常敏毅.乌贼墨囊中音有高教抗癌物质.中国海洋药物. 199I.417 2吕昌龙,洪明标,钟建国等乌贼墨对小鼠移植痛的抑 {5j作用宴甩肿痛学杂志1994,1:6 3吕昌龙,赫生生乌贼墨诱生小鼠细胞毒因子话性的检 测中国医科太学学报,1994,23(4):322 4谢光临目昌龙,替生生乌贼墨促凝血作用机制的实验 研究中国医科大学学报1994,23(6):5320 l4《中国海洋药物》杂志1999年第3期(总第71期) 5辛明,王魄蜂.韩许生,等.应用Fura-2/AM控哥分商的 抻经缅胞内游离钙浓度及变化.药学学报,199l,26(12):890 6Cto~hSPMKozl~wskiR.目岫KJdF1咖kcJThe, ATPumj一ameasureofceil口rol】删i嘶a村e~otox? ,immunMech,】993,160:81 7Koed0R.BarryP.B口D,”App]i~fionthe denon山日ph【cdlvisl:d]ityas8inhum~mh凹cca肿盯 ebt,mo~sitivitytesting]:AMpDn0nthefirstresult,&0胁. 1993.54:119 8苏拔贤着生暂化学制备技术科学出版社,1982.P155 9棘友牺.宋瞳华一种筒便,是敏的ATPaso括性侧定法. 生物化学与生物物理进展,]986,4:64 10B糟drdMMAr蛐jdand~sifiveITled10dfortheq?tmntita— tionofmietogramn【i?曙ofproteirtuti]izin8thep~iple0fPro- In.dvebindir~.Ana/B/oc/~m.I976,72:248 llL帅OH,RosebroaNJ,Fm?rAL,”.Protein I脯ntwiththe岛lia口r~ent.JfC洲,1951193#2 12YT】丑B.VeraVT,k.hW.InhibitionbyCa”of 山血d目栅dtkesymhesls0fATPinEMieha~itestu~ormi- tochomtrm:re]aftOntofireCrabt~ee缸B/op~y,,Aeta. 199?3.1228#261 13V日”,Kry~ynaB,Anelac.elEffectofducosesad 如.uco啦0口eytopl~mie[Cs2]Ehr~chB4?【辟tumorce】l自. 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