血清学 - 血清学方法--血凝和血凝抑制试验

血清学 - 血清学--血凝和血凝抑制试验 一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒;其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。各种病毒的血凝素性质不尽相同。某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象;但另一些病毒却可在4?、室温和37?呈现同样的血凝作用。病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。 当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。 血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。 各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下: 1(生理盐水:用蒸馏水或去离子水配制成0.85,NaCl溶液，高 压灭菌备用。 2(红细胞悬液:采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4?普通冰箱保存，可用一个月。使用前，取红细胞悬液1份，用5,10倍量的生理盐水洗涤3次，直至上清无色透明。取沉淀红细胞，加生理盐水制备成1,红细胞悬液。 3(病毒液:包括接种病料后收获的鸡胚羊水、尿囊液或感染小鼠的肺乳剂，经3000转离心沉淀15分钟，除去较大颗粒后应用。血凝抑制试验用的血凝素抗原，系用病毒接种鸡胚后收获的鸡胚尿囊液和羊水，以3000转离心20分钟，吸取上清液，加入3倍量的灭菌生理盐水，并加入1:10000硫柳汞防腐，保存于4?冰箱备用。 4(特异性抗血清:用作阳性对照。一般用鸡制备。取血凝效价在1:320倍以上的鸡胚尿囊液，注射壮龄鸡的腹腔内，每次10毫升，共3次，每次间隔1周。最后一次注射后2周放血，分离血清，置-20?以下冻存。血凝抑制效价可达1:640倍以上。另一法是将尿囊液静脉或腹腔注射壮龄公鸡，每次2毫升，间隔1周，如上法注射4,5次，血凝抑制效价有时可高达1:5000倍以上。按上法给壮龄公鸡静脉或腹腔注射1次尿囊液，7天后采血，也可获得血凝抑制效价有时可达1:160倍的抗血清。 5(8单位或4单位抗原的配制:以能引起红细胞100,凝集的病毒最高稀释度作为终点，即1个HA单位，终点滴度除以8即为含8HA单位的抗原。例如，如果血凝终点滴度为1:256，则8个血凝单位的稀释度应是1:32(256除以8)，此例中将1ml抗原加入31ml生理 盐水即为8HA单位抗原。取8HA单位的抗原加入等量生理盐水即为4HA单位抗原。 血凝素效价测定:将待检病毒液用生理盐水作1:5稀释，在大孔塑料滴定板或小试管中进行倍比稀释，直至1:2560，每孔(管)0.25毫升，最后1孔只加生理盐水作为对照。随即向各孔内加入0.25毫升的1,鸡红细胞悬液，充分混匀，于室温放置45分钟后判定结果。红细胞凝集程度以，，，，、，，，、，，、，和,表示。最后1孔(管)的红细胞应无凝集现象。 红细胞呈细砂粒状均匀铺于孔底者为，，，，，即100,凝集;红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整而稍向孔底集中者为，，，，即75,凝集;红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝集块者为，，，即50,凝集;红细胞于孔底形成圆团，但边缘不够光滑，四周稍有凝集块者为，，即25,凝集;红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐者为-，即无凝集。 血凝素效价以，，为终点，即以能够使50,红细胞凝集的血凝素的最高稀释度作为该血凝素的血凝效价。 血凝(HA)试验:在微量血凝板的1,12孔均加入25ul生理盐水。用微量移液器吸取25ul抗原加入第1孔，混匀。从第1孔吸取25ul抗原液加入第2孔，混匀后吸取25ul加入第3孔，如此进行倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25ul弃之，第12孔作为生理盐水对照。每孔再加入25ul生理盐水。之后每孔均加入25ul1,鸡红细胞悬液，在微量振荡器上振荡1min，使其混合均匀;在室温(20?,25?)下作用40min后观察结果。红细胞凝集呈薄膜状，均匀地覆盖孔底，强凝集时凝集块皱缩呈团状或边缘呈锯齿状，即100,的红细胞凝集;红细胞凝集呈薄层，但是面积较小，孔底中央有红细胞沉积呈小圆点状，即50,的红细胞凝集;红细胞全部沉于孔底中心呈小圆点状，周围光滑，无分散的红细胞，即无凝集现象。能使红细胞100,凝集的病毒最高稀释度作为该病毒的血凝价。 血凝抑制(HI)试验:在微量反应板的第1,11孔各加入25ul生理盐水，第12孔加入50ul生理盐水。吸取25ul血清加入第1孔内，充分混匀后吸25ul于第2孔，依次对倍释至第10孔，从第10孔吸取25ul弃去。1孔,11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25ul，室温(约20?)静置至少30min。每孔加入25ul1,的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min(室温约20?)，若环境温度太高可置4?条件下进行，对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔底。以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于2?2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于3?2判定HI试验阴性;HI价等于4?2为可疑，需重复试验;HI价大于或等于5?2为阳性。