细菌接种法实验报告

细菌接种法实验微生物实验报告细菌微生物实验报告目年级专业实验者学号小组成员指导老师一、实验目的脓汁和粪便标本中病原菌的检测2013级临床医学八年制1.了解细菌生长的基本营养条件，熟悉培养基的类型，学习并掌握培养基的原则与方法。2.掌握无菌操作技术，掌握病原菌的分离与培养方法。3.了解并比较细菌在固体、半固体和液体培养基的生长特征。4.学习并掌握空气及人体细菌检测学方法。5.掌握细菌涂片标本的制备以及革兰染色法，熟悉不同类型细菌的基本形态。6.掌握糖发酵实验、抗菌素敏感性实验和血浆凝固酶实验的原理与方法。7.从脓汁和粪便标本中分离培养和检测出病原体。二、实验器材1.培养基的制备:干粉培养基、天平、蒸馏水、称量皿、药勺、锥形瓶、量筒、电炉、试管、洗耳球、试管筐、移液管、棉塞、牛皮纸、橡皮筋、手套、石棉网2.空气与人体体细菌学检查:琼脂培养基、酒精、碘酒3.细菌的分离培养:脓汁标本、粪便标本、伊红美蓝平板、营养琼脂平板、接种环、酒精灯、打火机4.细菌的纯培养:接种环、酒精灯、打火机、中性笔、斜面培养基5.细菌的形态学检测:斜面培养物、营养肉汤、生理盐水、镜油瓶、拭镜纸、吸水纸、载玻片、显微镜、接种环、酒精灯、打火机、中性笔、革兰染色试剂、液体培养基6.细菌的生化试验:葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、接种针、酒精灯、打火机、中性笔、菌液、营养琼脂平板、接种环、药物纸片(青霉素、庆大霉素、头孢曲松)、玻片、兔血浆、生理盐水7.细菌的血清学试验:玻片、福氏志贺菌诊断血清、生理盐水、接种环、酒精灯三、实验方法与步骤1.培养基的制备称量琼脂粉?蒸馏水?加热溶化?分装?集中放在试管筐里?罩上硫酸纸、牛皮纸?用橡皮筋扎好?放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内?送到高压蒸汽灭菌室(洗刷室)?灭菌2.空气与人体体表细菌学检查2.1空气的细菌学检查每组1个营养琼脂平板，选择实验楼女厕所?将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边?平板暴露于空气中15分钟?平板倒扣盖上?作标记?37?温箱培养24小时?观察结果。2.2人体体表细菌学检查甲丙常规洗手，乙丁洗手。甲和乙、丙和丁分别共用1个平板按下图在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。3.细菌的分离培养3.1实验方法平板划线法:借助于划线，将混杂的多种细菌，在平板表面分散成单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团(单菌落)。3.2实验步骤接种环烧灼灭菌?分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和依红美蓝平板上，各做两份，?烧掉接种环上多余的标本?冷却后，应用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板(2份)，粪便标本接种于伊红美蓝平板(2份)?接种环烧灼灭菌?将平板倒置37?培养18,24h?观察结果。4.细菌的纯培养甲?普通平板?金黄色菌落(auratus，goldenyellow)?1支斜面乙?普通平板?白色菌落(albus，white)?1支斜面丙?EMB平板?紫黑色菌落(atropurpureus)?1支斜面丁?EMB平板?粉红色菌落(pink)?1支斜面斜面正面上2/3作标记:组号+金黄、白色、紫黑、粉红。5.细菌的形态学检测5.1革兰试剂染色5.2显微镜油镜使用步骤10×物镜?看清标本?滴加香柏油?100×油镜?浸泡油中?模糊物象?细调节调焦，观察物像?记录结果?关闭电源?擦镜纸拭去香柏油?擦镜纸沾少许乙醇和乙醚(7:3)混合液擦拭?擦镜纸擦拭油镜。5.3肉汤接种法接种环烧灼灭菌?分别在斜面培养物中挑取菌苔少许?立即移入肉汤培养基管中?在接近液面的管壁上轻轻研磨?沾取少量肉汤调和?混匀?试管口通过火焰2-3次灭菌?塞好棉塞?35?培养4~6小时6.细菌的生化试验6.1细菌的糖发酵实验接种针烧灼灭菌?用灭菌接种针分别刮取实验所得到的紫黑色和粉红色菌苔?分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内?接种环烧灼灭菌?将微量管平放在平板内?37?培养过夜后?观察结果。6.2药敏实验接种环烧灼灭菌?分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布(如图6)?接种环烧灼灭菌?标记:青、头、庆?镊子火焰消毒?贴青霉素、头孢曲松、庆大霉素纸片?按压?镊子消毒?倒置37?培养6.3凝固酶实验取干净玻片一张?在左右两边分别滴加兔血浆1-2滴，生理盐水1滴?接种环烧灼灭菌?冷却?分别用接种环取之前实验所得到的白色和黄色菌苔(2,3个菌落的菌量)与血浆研磨混合?边混匀边观察结果?接种环烧灼灭菌?稍等片刻，观察结果6.4动力实验接种针烧灼灭菌?分别用接种针在紫黑色和粉红色的斜面取菌?从半固体培养基中心垂直刺入，可刺达近底管处，但不要到达管底?循原来的路线退出接种针?试管口迅速通过篇二:微生物实验报告动物微生物及免疫学实验报告一、实验目的(一)掌握一般培养基的制备原理及，掌握培养基酸碱度的测定，熟悉一般培养基的制备过程和各种器皿灭菌方法。(二)掌握细菌分离培养的基本要领和方法，掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏染色法及油镜的使用方法，并认识革兰氏染色的反应特性。(三)掌握学习用微生物学原理诊断疾病的一般方法及步骤。二、实验用品(一)器材量筒、烧杯、电子天平、漏斗、三角烧瓶、空试剂瓶、玻璃棒、玻璃平皿、刻度吸管、pH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试剂瓶瓶塞、扎绳、放大镜、包装纸、洗耳球、酒精灯、载玻片、火柴、吸水纸、剪刀、记号笔、接种环、注射器、镊子、钳子、毫米尺、培养箱、水浴培养箱、高压蒸汽灭菌锅、油镜(二)试剂及材料肘胨、蛋白胨、猪胆盐、氯化钠、琼脂、乳糖、0.01%结晶紫水溶液、0.5%中性红水溶液、血清、胰化蛋白胨、酵母提取物、氢氧化钠、盐酸、牛血清、革兰氏染色液、蒸馏水、小白鼠、病猪内脏三、实验步骤(一)培养基的制备(所有用到的器皿都已121?高压灭菌15~30min，倾注平板在无菌操作台内完成，并放在无菌操作台内)1、麦康凯培养基(1)组成:蛋白胨17g、肘胨3g、猪胆盐5g、氯化钠5g、琼脂17g、乳糖10g、0.01%结晶紫水溶液10ml、0.5%中性红水溶液5ml、蒸馏水1000ml(2)方法:将蛋白胨、肘胨、猪胆盐和氯化钠溶解于400ml蒸馏水中，调节pH至7.2。将琼脂加入600ml蒸馏水中，并加入乳糖，加热熔化。将两液混合，分装于烧瓶内，用纱布、扎绳等捆好后，121?高压灭菌15~30min。待冷却至50~55?时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。注:结晶紫和中性红水溶液配好后需经高压灭菌。2、血清平板(1)组成:营养琼脂、牛血清(2)方法:将灭菌的营养琼脂加热熔化，冷却至45~50?时，加入牛血清，并混匀，倾注平板。注:不得将牛血清一并加入后再灭菌。3、LB培养基(1)组成:胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g(2)方法:在950ml蒸馏水中加入胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂和氯化钠，调节pH至7.4，加热熔化，分装于瓶中，用纱布、扎绳等捆好后，121?高压灭菌15~30min。待冷却至50~55?时，倾注平板。4、液体培养基(在LB培养基的基础上，装入大试剂瓶中，不加琼脂，不分装)(二)病料取材在病猪死亡后，首先用显微镜检查其末梢血液膜片中是否有炭疽杆菌存在，未发现，则立即用消毒的器械对其进行生理解剖，观察其病理特征现象，取出病猪的十二指肠、胃、肝脏三处的组织物，并注意组织的完整性，用储物袋密封保存。(三)细菌粗培养1、消毒灭菌:操作人员先用消毒水清洗手或戴好实验手套，再用消毒水对无菌操作台内桌面及用酒精灯外焰对待用器械进行火焰灭菌。2、接种(1)在无菌操作台酒精灯旁打开用储物袋密封保存的病料，先左手持镊子右手持剪刀，把病料剪出一个小口。(2)右手持灭过菌的接种环，左手持平板，并用拇指、食指及中指将平皿揭开约20左右，然后将接种环前端插入小口旋转一下后，再用划线接种的方法接种到一个血清平板上。(3)用记号笔在平板底部作好日期、操作人员、部位等标记，并将平板倒放。以此方法，分别接种十二指肠、胃粘膜、肝脏于血清平板上，各接种2个血清平板。3、培养:将接种好的血清平板倒扣放入37?培养箱中，反向培养24小时。注:划线接种时尽量划开，以保证长出单个菌落，且划线时接种环应尽量倾斜，以免划破培养基(后同);待接种完毕后熄灭无菌操作台内酒精灯，关闭好无菌操作台窗口，打开无菌操作台内的紫外灯。。(四)细菌纯培养1、菌落特征判断待粗培养的细菌培养24小时后，取出用放大镜观察记录单个小菌落的形态特征并用实验报告纸记录好，并在平板底部上做好观察标记，其形态特征包括大小、形状、菌落边缘、表面构造、隆起度、湿润度、透明度、颜色等。2、取单个菌落进行革兰氏染色镜检(1)取干净的载玻片，用记号笔在其一面做好正反面标记，再在载玻片另一面中央滴上一小滴蒸馏水。(2)将接种环在火焰上灭菌，待冷却后，在酒精灯旁从标记的单个小菌落中取少许细菌置于蒸馏水中混匀(同时盖好平板倒扣置于一旁)，用接种环涂成直径约1.5cm的菌膜，再在酒精灯火焰上方以钟摆速度通过固定好细菌，待冷却进行染色。(3)先滴加草酸结晶紫溶液染色1~2min，再水洗;然后滴加革兰氏碘液溶液染色1~2min，再水洗;随后滴加95%的酒精脱色30~60s，再水洗;最后滴加稀释的品红进行复染30~60s，再水洗;待干燥或吸水纸吸干后镜检。(4)将干燥的载玻片放在1000倍油镜下，滴加一滴松柏油进行镜检，观察其形态特征，判断细菌的种属。3、细菌接种培养(1)消毒灭菌:操作人员先用消毒水清洗手或戴好实验手套，再用消毒水对无菌操作台内桌面及用酒精灯外焰对待用器械进行火焰灭菌。(2)接种:右手持灭过菌的接种环，左手持平板，并用拇指、食指及中指将平皿揭开约20左右，然后将接种环插入揭开的平板口内蘸去一下镜检标记的小菌落，再用划线接种的方法接种到一个血清平板、LB平板或麦康凯平板上。并用记号笔在平板底部作好日期、操作人员、菌种、部位等标记，将平板倒放。(3)将接种好的平板倒扣放入37?培养箱中，反向培养24小时。注:油镜用完后应立即清理物镜上的松柏油;划线接种时尽量划开，以保证长出单个菌落;待接种完毕后熄灭无菌操作台内酒精灯，关闭好无菌操作台窗口，打开无菌操作台内的紫外灯。。(五)菌液的制备1、镜检:用革兰氏染色法在1000倍油镜下镜检，观察并记录是否为纯培养的细菌。2、分装液体培养基:先对无菌操作台及需要使用的器械进行消毒灭菌，然后用钳子揭开一个空试剂瓶，用倾倒的方法在酒精灯旁从液体培养基大试剂瓶中分装于空试剂瓶内，并立即盖上液体培养基大试剂瓶瓶塞。3、接种:右手持接种环，用火焰对其进行灭菌，待冷却后，取出纯培养的平板，在无菌操作台内酒精灯旁，蘸去少许细菌，左手倾斜液体培养基，将接种环，伸入液体培养基内搅动，然后取出对接种火焰环灭菌，并用灭菌的包装纸捆绑好后，用记号笔做好相应标记，置于一旁。4、培养摇菌:将接种好的液体培养基置于水浴培养箱中培养24小时。注:分装一个培养基就接种一个培养基，不得全部分装完后再一个一个接种。(六)小鼠致病性实验1、保定:选择健康的青壮年小白鼠，先用右手抓住尾巴，旋转数周让其眩晕，然后用左手的拇指和食指捏住两耳及头部皮肤，并翻转左手，使其头部朝下，以达到内脏前移的目的。2、接种:先用酒精棉球蘸取酒精对注射部位擦洗消毒，再用注射器注射吸取0.2ml菌液注射于小白鼠腹腔中。3、观察:将接种的小白鼠放在适宜的环境下生活，并在鼠笼处用记号笔标记好接种时间、菌种等。4、再培养鉴定:待小白鼠死亡后，对其进行解剖，观察其内脏病变情况，并取肝脏直接涂在相应培养基上，在适宜条件下反向培养24小时后，取菌落细菌进行镜检观察判断。注:在注射小白鼠2小时候需要观察小白鼠是否因注射时伤害到内脏而死亡。(七)生化试验篇三:微生物学实验报告微生物学实验报告实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察第一部分:显微镜的使用一、目的要求1(熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。2(学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。3(了解各种显微镜的主要特征。二、实验原理(一)光学显微镜的构造微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。1、机械部分普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分:目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。2、光学部分:目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。(二)放大倍数标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。物镜的放大倍数愈大，其工作距离(物镜镜头到标本片之间的距离)愈短，这时光圈就要打开得愈大。显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。因此常以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。R=0.61λ/N.A式中:R-----分辨距离;λ------作用光的波长;N.A------数值口径。一些介质的折射率介质空气水玻璃香柏油折射率113551.56三、实验内容(一)材料:显微镜，香柏油，擦镜纸。(二)方法:细菌很小，须使用油镜方可观察到。油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头，故必须极其仔细地学习油镜的使用方法:1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节到离载物台约1cm的高度，将聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。2、滴一滴香柏油，固定于载物台上，用推动器调节到载物台正中。在双目侧视下，下旋粗调节器，使油镜头浸入油中几乎与标本片相接触。然后眼睛从目镜观察(如光线不足，可适当增大电源电压)，徐徐上旋粗调节器至看到模糊物像之后，再用细调节器调节以使物像清晰。如镜头已离开油面还未看到物像，则再重新操作。3、更换标本时应先提高油镜头，再更换玻片，切勿随意移动显微镜的位置。4、油镜观察完毕后，按“显微镜保护”中(6)项处理。5、最后将油镜各部分还原，聚光器下降，反光镜垂直于镜座，镜头转成八字形，以免与聚光器发生碰撞。四、思考题1、使用显微镜时为何调节下列构造,反光镜，光圈，聚光器，粗调节器，细调节器，镜头回转器。答:聚光器的位置之升降可影响视野的明亮度，上升则视野明亮，下降则光线减弱。光圈的放大或缩小也可控制视野明亮程度。粗调节器和细调节器均是调节焦距的装置。镜头回转器为装置物镜和转换物镜之用。2、使用不同放大倍数的物镜时，工作距离与光圈的关系。如何利用这一原理用好显微镜,答:物镜的放大倍数愈大，其工作距离(物镜镜头到标本片之间的距离)愈短。标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。3、为何要选用与玻璃折射率相似的香柏油作为油镜的介质,油镜的原理是什么,答:香柏油只在使用油镜头时(100倍物镜)使用，因为当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气(n=1.52)的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油(n=1.515)为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55μm。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42μm;而使用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的距离则为0.22μm。选用香柏油是因为它的折射率是1.5154、显微镜有哪几种,各自的主要特征是什么,答:光学显微镜中除明视野显微镜外，还有暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜;除光学显微镜外，还有电子显微镜。暗视野显微镜:在普通光学显微镜载物台下安装一个暗视野聚光器即成暗视野显微镜。相差显微镜:相差显微镜成像的原理和普通光学显微镜一样，所不同的是相差显微镜包括有环状光阑、装有相板的相差物镜和全轴调整望远镜三个特殊部分。荧光显微镜:荧光显微镜的主要特征是以紫外线为光源，当照射到用荧光素标记的细菌时，荧光素吸收了紫外线的能量后，再发射出可见的橙、黄、浅绿色荧光。由于用荧光素标记的菌体各种结构中的溶解、吸附或化合情况不一，于是发出不同色调和亮度的荧光，从而可以观察细菌的不同结构。电子显微镜:电子显微镜的基本结构和工作原理与普通光学显微镜非常相似，不同的是用电子流代替光线，用电磁圈代替透镜聚焦。第二部分:细菌形态学检查方法一、目的要求1、了解不染色标本检查法，用悬滴法观察活细菌及其动力。2、熟悉染色标本的制备过程，掌握革兰氏染色法及其结果判断，了解革兰氏染色法原理。3、了解其它常用染色法。二、实验原理检查细菌形态的主要工具是显微镜，可根据不同目的将细菌染色或不染色进行镜检。常用的碱性染料有结晶紫、美蓝、碱性复红等。染色法又分单染色法和复染色法两大类。单染色法即仅用一种染料着色，所有的细菌均被染成一种颜色，无鉴别细菌的作用。复染色法又称鉴别染色法，通常用二种或二种以上的染料着色，由于不同种类的细菌或同种细菌的不同组成结构对染料有不同的反应性而被染成不同的颜色，从而有鉴别细菌的作用。2、最常用的细菌复染色法是革兰氏染色法(Gramstain)。通过革兰氏染色法操作，可把细菌分成两大类:革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。凡能使第一种染料结晶紫保留蓝色的细菌叫革兰氏阳性细菌，凡被洒精脱色后染上对比颜料沙黄或稀释复红而呈红色的细菌叫做革兰氏阴性细菌。三、实验内容(一)染色标本的制备及观察1、复染色法(革兰氏染色法)材料:葡萄球菌琼脂培养物1支大肠杆菌琼脂培养物1支革兰氏染液一套:结晶紫、95%酒精、路哥氏碘液、稀释复红各1瓶。玻片，接种环，酒精灯，吸水纸等。方法:(1)涂片用葡萄球菌和大肠杆菌混合涂片。?取玻片一块，拭净。?用无菌接种环取生理盐水一滴，放在玻片中央(如被检材料是液体，可不加生理盐水)。?左手斜持菌种试管，右手将菌种试管棉塞稍加转动，以便拔下。?右手持接种环，经火焰灭菌后，用右手小拇指拔开菌种试管棉塞，试管口通过火焰，将接种环插入试管中取菌少许(切不可多，更不可将培养基刮下)。?试管口再通过火焰，塞好棉塞。?将接种环上的细菌加入玻片上之水滴内，磨匀，涂成直径为1cm大小的薄菌膜。?接种环经火焰灭菌。.(2)干燥涂片置于空气中，使其自然干燥。(3)固定干燥后将涂片在火焰上缓缓通过三次，此为“固定”。目的是使细菌粘于玻片上，染色和水冲时不易脱落;且细菌为蛋白质，被热凝固可保持完整形态。(4)染色初染?媒染?脱色?复染?加结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染1~2分钟。?细水冲洗。?加路哥氏碘溶液经1分钟。?水洗。?加95%酒精于玻片上来回流动，倾去酒精。如此重复2~3次(约30秒钟)。?水洗。?加稀释复红染液，染约1分钟。?水洗，用吸水纸吸干。(5)镜检革兰氏阳性菌在结晶紫着色后不易被酒精脱色，故仍为深蓝色或紫色;革兰氏阴性菌在结晶紫着色后易被酒精脱色，故经稀释复红复染后成红色。三、实验记录革兰氏染色过程:取玻片一块，在玻片上滴三小滴水(有一定的距离)，分别用接种环取EC(大肠杆菌)和BS(金黄色葡萄球菌)与两边的水滴上，并混匀，灼烧接种环后再分别取EC和BS于中间的水滴上混匀(即中间水滴是两种菌的混合物)，并在酒精灯下灼烧至干(小心不要将玻片炸裂)，用结晶紫进行初染，细水冲洗后，加路哥氏碘液进行媒染，水洗后加酒精脱色2~3次，水冲洗后加稀释复红染液复染一分钟，水洗，并用吸水纸吸干。大肠杆菌为革兰氏阴性菌，染色后呈紫红色。普葡萄球菌为革兰氏阳性菌，染色后呈现蓝紫色。以下为实验观测图:四、思考题1(染色法在微生物学上有何实际意义,染色法可以更方便的观察细菌的具体形态，更方便观察细菌，革兰氏染色法有更重要的意义，可以鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，在实验方面，可以通过杀死阳性或阴性菌而得到目的菌。2(比较复染色法与单染色法的优缺点。答:单染色法:优点:仅用一种染料着色，所有的细菌均被染成一种颜色，简单方便，可用来观察细菌的形态和排列方式。缺点:但无鉴别细菌的作用。复染色法:优点:用二种或二种以上的染料着色，由于不同种类的细菌或同种细菌的不同组成结构对染料有不同的反应性而被染成不同的颜色，从而有鉴别细菌的作用。缺点:使用试剂较多，过程较单染色法更复杂繁琐。3(以革兰氏染色法为例，说明它至少要涉及几种试剂,各起何作用,答:至少用到4种试剂。结晶紫溶液进行初染，路哥氏碘液进行媒染，95%酒精进行脱色，稀释复红染液进行复染。4(要确证一个未知细菌的革兰氏染色性质，你可用什么方法来说明你的结果是可靠的,答:通过在显微镜下的菌体被染的颜色可以判断，凡能使第一种染料结晶紫保留蓝色的细菌为革兰氏阳性细菌，凡被洒精脱色后染上对比颜料沙黄或稀释复红而呈红色的细菌为革兰氏阴性细菌。