五种变温动物抗凝血酶和纤溶酶原相对含量比较

五种变温动物抗凝血酶和纤溶酶原相对含量比较 五种变温动物抗凝血酶和纤溶酶原相对含 量比较 四川动物2008年第27卷第5期SichuanJournalofZoologyVo1.27No.52008 五种变温动物抗凝血酶和纤溶酶原相对含量比较 王韫,韩旭东,李鑫,刘小宝,路卫星,高明,霍书英,李双安 (1.河北农业大学动物科技学院,河北保定071001;2.保定职业技术学院) 摘要:用免疫浊度法对进食期5,9月的鲤鱼Cyprinuscarpio,鲫鱼Carassiusauratus,鲶鱼Silurusasotus,中华大蟾 蜍B,6.rm和中华鳖Pelodiscussinensis血清中AT和PLG进行测定.结果显示:1)鲶 鱼和中华鳖血清中 AT的相对含量极显着高于鲤鱼,鲫鱼,蟾蜍的AT相对含量(P<0.01);2)中华鳖血 清中PLG的相对含量显着高 于鲤鱼,鲫鱼,鲶鱼和蟾蜍的PLG相对含量(P<0.01).结论:1)5种动物体内都存在 AT和PLG,并且抗原性和人 的AT?和PLG相似;2)脊椎动物体内AT和PLG的生理含量与生存环境之间有一 定的相关性. 关键词:鲤鱼;鲫鱼;鲶鱼;中华大蟾蜍;中华鳖;抗凝血酶;纤溶酶原;免疫浊度法 中图分类号:Q959.3;Q592.1文献标识码:A文章编号:1000—7083(2008)05—0797 —03 ComparisonofRelativeConcentrationsofAntithrombinandPlasminogenbetween FiveSpeciesofHeterothermVertebrates WANGYun.HANXu.d0ng,LIXin,LIUXiao-bao., LUWei—xing, GAOMing,HUOShu—ying,LIShuang—aH (1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding, HebeiProvinee071001,China:2.BaodiugVocationalandTechnicalCollege) Abstract:Toinvestigatetherelationshipbetweentheenvironmentandrelativeconcentration s(RCs)ofantithrombin (AT)andplasminogen(PLG)inbloodserumforheterothermvertebrates,theRCsoftheATandthePLGinserumfrom carpCyprinuscarpio,crucianCarassiusauratus,catfishSilurusasotus,toadB6gargarizansandChinesesoft—shelled turtlePelodiscussinensisduringthefood— takenperiods(MaytoSeptember)wereseparatelymeasuredusingimmunoturbi— dinletryassayat25?invitro.andcontrolwiththeconcentrationsoftheAT— llIandthePLGinhmnan.Theresultsshowed that:1)TheRCsoftheATforthecatfish(421mg/L)andChinesesoft— shelledturtle(522mg/L)wereextremelysignifi— cantlyhigherthanthatofthecarp,thecrucian,thecrucian(115, 122mg/L)andhuman(215m#L)(P<0.01).The RCsoftheATinthecarp,thecrucianandthetoadwereextremelysignificantlylowerthanthatofhuman.2)TheRCsof thePLGforthecarp,thecrucian,thecatfishandthetoad(180, 211mg/L)wereextremelysignificantlylowerthanthatof theChinesesoft— shelledturtle(849mg/L)(P<0.01).ComparingwiththeconcentrationofthePLGofhuman(206in# L),theRCsofthecarp,thecrucian,thecatfishandthetoadweresignificantlylower,butthatoftheChinesesoft—shelled turtleweresignificantlyhigher.Conclusions:1)BothATandPLGpresentsinthebloodserumforfiveexperimentanimals, andtheirantigenicitiesmaybesimilartohuman.TheATandthePLGremainsconservatisminvertebrateduringtheevolu— tionperhaps.2)TheRCsoftheATandPLGinanimalslivinginthebottomofoxygen— poorfleshwaterconditionsareex— tremelysignificantlyhigherthanthatlivingintheoxygen— richfreshwaterconditions.Thereareimportantphysiologicaladap— tationrelationsbetweentheRCsoftheATandPLGforvertebrataandtheirlivingenvironment s. Keywords:carp;crucian;catfish;toad;Chinesesoft—shelledturtle;antithrombin;plasminogen;imunoturbidimeuyas— say 脊椎动物体内的血液保持流动状态是凝血系统,抗凝和 纤溶系统功能动态平衡的结果.在抗凝和纤溶系统中发挥 重要作用的物质是抗凝血酶(Antithrombin,AT)和纤溶酶原 (Plasminogen,PLG).哺乳类和人的AT一?能抑制血液中 70%的凝血酶活力.一般认为,人血浆中游离的AT—m正常 含量为150,200mg/L(王韦,王益寿,1999;吴强,2000). PLG是纤溶酶(plasmin,PL)的前体.血液凝固时,PLG大量 吸附于纤维蛋白网上,在组织型纤溶酶原激活物(t-PA)或尿 激酶(UK)的作用下,PLG脱下一段肽链形成活性很强的PL, 进而水解纤维蛋白原和凝血蛋白,溶解血栓.人血浆中PLG 正常含量为230,342mg/L.PLG的水平降低时,易发生血 栓(高飞,杨万兴,2003).AT和PLG的含量和活性是反映动 收稿日期:2008—04—10基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30670260) 作者简介:王韫(1982,),男,硕士研究生,研究方向:动物医学,E—mail:wailg2044776@yahoo.tom.en 通讯作者Correspondingauthor,E—mail:shuanganli@126.tom 797 四川动物2008年第27卷第5期SichuanJournalofZoologyVo1.27No.52008 物体止血功能正常与否的指标之一.作者发现鲤鱼的凝血 现象和陆生脊椎动物有很大的不同(李双安等,1999;Liet a1.,2006).为了弄清鱼类特殊凝血现象的机理和环境之间 的关系,由于AT和PLG的含量和活性对凝血有一定的影响, 因此,有必要对这两种物质相对含量进行测定. 国外的研究证明鲑鱼(大西洋鲑Salmosalar和虹鳟On— corhynchusrnyk&s)的AT和PLG在生理功能和分子结构上与 人的是相似的(Doolittle,1993;Saheeta1.,1995a,b;Jagade— eswaran&Liu.1997:Anderseneta1.,2000;Jiang&Doolittle, 2003).国内外对于变温脊椎动物如鱼类,两栖类和爬行类 的AT和PLG的含量与生存环境之间的关系的研究报道较少 (SaheaL,1995a;Davidsoneta1.,2003).为了比较几种常 见淡水鱼,两栖类和次水生爬行类止血系统中各因子含量的 异同,作者对鲤鱼Cyprinuscarpio,鲫鱼Carassiusauratus,鲶鱼 Silurusasotus,中华大蟾蜍日咖6gargarizans和中华鳖Pel— odiscussinensis5种动物正常血清中的AT和PLG的相对含量 进行了测定与比较. 1材料和 1.1试验动物 鲜活鲤鱼,鲫鱼,鲶鱼和中华鳖(早:6=1:1)购自河北 保定白洋淀水产养殖场.体重0.5,1.0kg/尾(只).健康, 体表无皮肤创伤.鲤鱼,鲫鱼和鲶鱼的鳃丝鲜红,无缺氧现 象.试验过程中,试验动物暂养在实验室的水族箱内,室温 常规养殖.野生蟾蜍采自白洋淀附近湿地. 1.2试剂和仪器 AT一?含量测定试剂盒(规格:35mL×2,上海太阳生物 技术有限公司批号:452003),主要试剂为羊抗人AT一?抗 体;PLG含量测定试剂盒(规格:35mL×2,上海太阳生物技 术有限公司批号:A20203),主要试剂为羊抗人PLG抗体. T6新世纪(T6spectrophotometer)紫外可见分光光度计 (190,Ii00nm),北京普析通用仪器有限责任公司. 1.3试验方法 1.3.1样本采集鲤鱼,鲫鱼,鲶鱼,中华大蟾蜍和中华鳖 活体心脏采血(王军萍,韩希福,1997;李双安等,1999),手术 暴露心脏,用塑料注射器刺人心室,采血3,5mL/尾(只), 置于塑料试管中,室温(25?)静置1h,待凝固血块开始回缩 后,4,10%冷藏8,12h,取上层血清1,2mL置于塑料试管 中,一20?冷冻保存备用.在48h内完成全部试验.中华鳖 的血块回缩非常慢,血清析出很少.5种动物的血清均弃去 发生溶血和部分溶血的样本,避免影响试验结果. 1.3.2免疫浊度法(Immunoturbidimetryassay,ITA)测定 AT和PLG的相对含量本试验严格按照试剂盒说明和仪 器操作说明进行.测定方法:340nm处以抗血清调零点,血 清20L和抗血清1.0mL均匀混合,测定各管A值. 1.4统计方法 试验数据使用Excel2003和SPSS12.0软件进行单因子 方差分析. 2结果 2.1鲤鱼,鲫鱼,鲶鱼,中华大蟾蜍和中华鳖AT相对含量测 定的结果 免疫浊度法测定试验动物血清中AT的相对含量分别 为:鲤鱼115.9mg/L,鲫鱼122.8mg/L,鲶鱼421.5m#L,中 华大蟾蜍117.7mg/L和中华鳖522.1rag/L(表1).鲤鱼,鲫 鱼和中华大蟾蜍血清中AT的相对含量差异不显着(P> 0.05).但是,这3种动物血清AT的相对含量低于鲶鱼,中 华鳖的AT的相对含量,存在极显着的差异(P<0.01).中 华鳖血清AT的相对含量高于鲶鱼(P<0.01).鲤鱼,鲫鱼 和中华大蟾蜍血清中AT的相对含量低于人血清中AT一?的 正常含量(参比品浓度215m#L),而鲶鱼和中华鳖血清中 AT的相对含量高于人血清中AT—llI的正常含量(P<0.01). 5种实验动物血清中AT的相对含量和人的AT一?的正常含 量比较,由高到低的顺序为:中华鳖>鲶鱼>人>鲫鱼,中华 大蟾蜍,鲤鱼. 表1免疫浊度法测定的鲤鱼,鲫鱼,鲶鱼,蟾蜍和中华鳖血液中AT相对含量平均值(mg/L,n=30,?SD) Table1Rdativemeanvalues(mg/L)ofconcentrationofATineachsam#esofMoodscrotafro mcarp,erucian,catfish,toadandChinese soft-shelledturtlebythemethodofimmunoturbidimetryassayattemperatureof25?(n=30,mean?standarddeflation) 示差异极显着(P<0.01) 注2:AT相对含量(mg/L)=(测定管A值?参比管A值)×参比品浓度(mg/L)(参比品浓度:215rag/L) 2.2鲤鱼,鲫鱼,鲶鱼,中华大蟾蜍和中华鳖纤溶酶原相对 含量测定的结果 免疫浊度法测定试验动物血清中PLG的相对含量分别为: 鲤鱼184.5m#L,鲫鱼211.4m#L,鲶鱼180.4m#L,中华大蟾 蜍180.4m#L和中华鳖849.6rag/L(表2).鲤鱼,鲫鱼,鲶鱼和 798 中华大蟾蜍血清中PLG的相对含量之问差异不显着(P>0.05). 中华鳖血清中PLG的相对含量为849.6mg/L,极显着高于鲤鱼, 鲫鱼,鲶鱼和中华大蟾蜍血清中PLG的相对含量(P<O.01).鲤 鱼,鲫鱼,鲶鱼和中华大蟾蜍的血清中PLG的相对含量和人血清 中PLG的正常含量(参比品浓度206mg/L)差异不显着(P> 四川动物2008年第27卷第5期SichuanJourn~ofZoologyVo1.27No.52008 0.05).中华鳖血清中PLG的相对含量849.6mg/L显着高于人血清中PLG的正常含量(P<O.O1)(表2). 表2鲤鱼,鲫鱼,鲶鱼,蟾蜍和中华鳖血液中纤溶酶原相对含量平均值(mg/L,n=30,?SD) Table2Relativemeanvalues(mg/L)ofconcentrationofplasminogenineachsamplesofbloo dfromcarp,crucian,catfish,toadand Chinesesoft—shelledturtlebythemethodofImmunoturbidimetryassayatteIIIperat!!l 三.m圭竺!!!! 注1:与表1同;2:纤溶酶原相对含量(mL)=(测定管A值?参比管A值)×参比品浓 度(1I]g/L)(参比品浓度:206mg/L) 3结论与讨论 为了探索不同脊椎动物体内AT和PLG的相对含量的异 同,作者采用了透射免疫浊度法对5种动物的血清进行了检 测.其检测原理是以被检测物质作为抗原,然后用免疫动物 的方法制备相应的抗体,抗原抗体的特异性结合形成难溶的 抗原一抗体复合物.抗原性不同的物质无干扰.这种大分子 复合物能在液相中引起浊度变化.利用外界光源的照射,检 测溶液透射光变化的程度,计算复合物的含量,再推算出溶 液中待测抗原的含量(秦莉等,1999;李天星,2001).由于现 在还没有鱼类,两栖类和爬行类专用的AT和PLG含量测定 试剂,本试验尝试着采用了羊抗人AT一?抗体和羊抗人PLG 抗体试剂,对5种实验动物的血清进行了测定.结果表明, 不同进化地位的动物如鲤鱼,鲫鱼,鲶鱼,中华大蟾蜍和中华 鳖血清都能和抗体试剂形成复合物(加入抗体后样本透光度 发生变化).说明5种动物血液中的AT和PLG的抗原性分 别与人的AT一?和PLG的抗原性是相似的,并且有相似的抗 原决定簇(antigenicdeterminant)或表位(epitope).同时也说 明AT和PLG在脊椎动物进化上有很大程度的保守性.其他 相关研究也证明鱼的AT和PLG在生理功能和分子结构上与 人的是相似的(Salteeta1.,1995a;Jagadeeswaran&Liu,1997; Jiang&Doolittle,2003).鲑鱼的AT在生理功能,分子结构上 和人的AT一?相似.硬骨鱼(Teleostei)大西洋鲑Salmosalar L.和虹鳟OncorhynchusmykissWalbaum的AT在体外其功能 和人的相似.在肝素存在时,几乎瞬间抑制凝血酶的功能, 但在缺乏肝素时,抑制是很慢的;鲑鱼的AT抑制同源凝血酶 的能力并非显着不同于对异源(其他硬骨鱼)凝血酶的抑制 能力,并且酶和抑制物的反应在鱼和人之间是有效的.鲑鱼 的AT在广泛的温度范围内(3?)也能抑制凝血酶的活性 (Salteeta1.,1995b;Anderseneta1.,2000).多方面的研究都 证实有颌类的血液中存在AT,并且AT在功能上,分子结构 上和抗原性上是相似的. AT和PLG在不同动物之间存在的相对含量上的差异 (表1,2),如:AT由高到低的顺序为:中华鳖>鲶鱼>人>鲫 鱼,中华大蟾蜍,鲤鱼(P<0.01).PLG,中华鳖>鲫鱼,人, 鲶鱼,中华大蟾蜍,鲤鱼(P<0.01).作者对此初步认为这可 能是由于脊椎动物适应不同环境造成的.AT和PLC的含量 没有表现出与动物的进化地位之间存在着规律性变化.底 栖耐缺氧的种类中华鳖体内的AT和PLG,鲶鱼PLG都显着 高于非底栖种类鲤鱼,鲫鱼,中华大蟾蜍(非休眠期).这可 能是中华鳖和鲶鱼对缺氧环境的生理适应.其他相关研究 也证明,动物和人在缺氧环境中,可以破坏正常血液中的凝 血,抗凝和纤溶系统的动态平衡,使凝血活性加强,抗凝机制 受到抑制,血液处于高凝状态,继之在脑,肝和肾等重要器官 和组织的毛细血管内形成广泛的血栓(杨光明,柳君泽, 2001).鳖和鲶鱼属于淡水底栖耐缺氧种类,在长期适应淡 水底栖缺氧环境过程中,不仅在相关的形态结构上出现了特 化,在许多生理机制上也发生了一定的变化(牛翠娟,1999; 杨振才等,1999).因此,在长期适应缺氧环境的动物,体内 AT和PLG的含量相对较高对于防止血栓形成,维持血液的 正常流动状态可能是非常重要的生理机制之一. 该研究只是用免疫学方法(李天星,2001)测定AT和 PLG的相对含量的一种尝试性的探讨.在研究方法和试剂 选择方面可能存在着种的特异性造成的结果误差.因此,用 了"相对含量"这个概念.现在关于测定人和家畜相关的酶 和蛋白质含量的方法和技术较成熟,在野生动物的蛋白质含 量检测方面,无论是在方法上和相关试剂的研究上,和对人 的研究之间比较,还存在着很大的差距.对不同动物不同蛋 白质的测定较成熟的生化和免疫学技术和方法仍然需要逐 步探讨和完善.该研究在实验动物的选择方面主要从进化 地位和生存环境的不同来考虑的,鱼类以鲤鱼,鲫鱼和鲶鱼 (底栖)为代表,两栖类以蟾蜍,爬行类选择的是次水生的鳖. 其中不足的地方是种的数量较少.所以,是一种探索性研 究.该方面的研究结论也是初步的,尚需从增加实验动物种 的数量,选择新的研究方法进一步实验证实. 4参考文献 高飞,杨万兴.2003.抗凝血酶?,纤溶酶原及D一二聚体的研究及临 床意义[J].激光杂志,24(5):91,92. 李双安,张正珊,李铁拴,等.1999M04溶液抑制鲤鱼血液凝固 的初步研究[A].中国动物学会编.中国动物科学研究[c].北 京:中国林业出版社:765,769. 李天星.2001.现代临床免疫学检验[M].北京:军事医学科学出版 社:503,543. 牛翠娟.1999.水生龟鳖类潜水生活的呼吸代谢[J].生物学通报, 34(4):8,9. (下转第806页) 799 四川动物2008年第27卷第5期SichuanJournalofZoologyVo1.27No.52008 注:头胸甲长度L>30em为大型个体,20enl<L<30sin为中型个体,L<20em 为小型个体 中的溪蟹为黄褐色. 4讨论 《山西省水资源公报》指出山西2004年严重污染的河 段占64%(程原生,2007),缺水已成为制约山西经济社会 发展的主要因素之一(王彦红等,2003).沁河是山西省第 二大河流,近年来径流量持续偏枯(王道席等,2006),局 部河段污染严重.本次调查显示,沁河流域中部晋城地区 沁水县北部的河流生态状况良好,其余河流皆受到污染和 破坏.由于煤化工企业较多,高平的丹河水流量锐减,水 体污染严重,一些支流干枯或变为农田,沁河自沁水县嘉 峰镇以下也受到严重污染,水体发黑.溪蟹随着局部地区 河流污染的加重,开始出现区域性的绝迹,即使有溪蟹生 存的河流,随着污染的不同,溪蟹的种群特征值也会发生 改变.位于沁水县北部的苏庄河,林村河,马邑河和龙渠 河生态环境良好,受人类活动的直接影响不大,溪蟹的生 物密度和生物量最好;沁水县城附近的柿元河,龙渠河以 及东部的固县河和胡底河,受到生活,煤矿等人为污染, 溪蟹的生物密度和生物量较低;沁河和芦苇河水体严重污 染,溪蟹的生物密度和生物量最差. (土接第799页) 秦莉,韩文,王国华.1999.免疫比浊法及其应用[J].实用医技杂 志,6(7):498. 王军萍,韩希福.1997.中华鳖取血的一种新方法[J].河北大学学 报,17(4):78—79. 王韦,王益寿.1999.抗凝血酶?(AT-?)的研究进展[J].上海化 工,24(20):7—11. 吴强.2000.抗凝血酶因子?分子生物学研究进展[J].国外医学分 子生物学分册,22(1):56,60. 杨光明,柳君泽.2001.缺氧激活凝血通路和诱导血栓形成机制的新 进展[J].高原医学杂志,11(1):59,62. 杨振才,牛翠娟,孙儒泳.1999.中华鳖生物学研究进展[J].动物 学杂志,34(6):41,46. 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